任春宇+姜丹丹+車(chē)達(dá)

摘要：為建立快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)氣腫疽的膠體金免疫層析試紙條，以免疫層析法為指導(dǎo)，根據(jù)抗原-抗體的特性，建立了不需要再加入任何檢測(cè)試劑且快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。結(jié)果表明，膠體金與該單抗的最佳結(jié)合量為 30 μg/mL，最佳 pH 值為8.4，最佳NC膜為Millipore HFB1350220型。將純化的氣腫疽梭菌多抗及羊抗鼠IgG分別以1 ∶4和1 ∶8的稀釋倍數(shù)噴于硝酸纖維素膜的T線(xiàn)和C線(xiàn)。對(duì)膠體金診斷試紙條進(jìn)行驗(yàn)證，敏感度高，可檢測(cè)到的最低抗原量為1×105 CFU/mL，特異性強(qiáng)、無(wú)假陽(yáng)性與交叉反應(yīng)現(xiàn)象、有較好的穩(wěn)定性。本研究旨在建立快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)氣腫疽的膠體金免疫層析試紙條。

關(guān)鍵詞：氣腫疽梭菌；膠體金；免疫層析試紙條

中圖分類(lèi)號(hào)： S855.1+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）11-0283-03

氣腫疽又稱(chēng)黑腿病或鳴疽，是由氣腫疽梭菌（Clostridium chauvoei）引起的反芻動(dòng)物的急性、敗血性傳染病[1]。該菌屬細(xì)菌綱芽孢桿菌科梭菌屬，是土壤中的專(zhuān)性厭氧菌，廣泛分布于自然界中，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于牛和綿羊的腸內(nèi)容物中[2]，特別在深部傷口的厭氧環(huán)境中[3-4]。該菌為革蘭氏陽(yáng)性棒狀大桿菌，對(duì)進(jìn)行疫苗接種的豚鼠腹腔滲出液做涂片觀(guān)察，可發(fā)現(xiàn)該菌以單個(gè)形式存在，或幾個(gè)細(xì)菌形成短鏈，可與呈長(zhǎng)鏈的腐敗梭菌做出鑒別，這是形態(tài)上的主要區(qū)別之一[5]。在進(jìn)行菌體培養(yǎng)時(shí)，需創(chuàng)造嚴(yán)格的厭氧環(huán)境，尤其是在固體培養(yǎng)中，當(dāng)接種于葡萄糖血液瓊脂中時(shí)，形成半透明圓形菌落、β溶血環(huán)，中心略凸起[6]。

該菌繁菌體的抵抗力不強(qiáng)，但芽孢卻有很強(qiáng)的抵抗力，可在土壤中存活多年[7]，在腐敗尸體中仍可存活3個(gè)月。若想將組織內(nèi)的芽孢殺死，經(jīng)煮沸20 min或0.2%升汞處理 10 min 方可。一旦通過(guò)深部創(chuàng)傷或術(shù)后而感染[8]，或經(jīng)口感染，經(jīng)胃腸道腸系膜進(jìn)入血液最終到達(dá)各個(gè)器官和肌肉組織內(nèi)的芽孢將迅速繁殖[9]，并很快出現(xiàn)病癥，還可形成腸氣腫疽，易感動(dòng)物在感染后12～36 h則出現(xiàn)死亡[10]。

本試驗(yàn)選用氣腫疽梭菌標(biāo)準(zhǔn)株制備菌體單克隆抗體，旨在將該單抗與膠體金標(biāo)記結(jié)合，研制出能對(duì)氣腫疽梭菌做出快速診斷的膠體金免疫層析試紙條，該試紙條研制成功將為氣腫疽診斷、流行病學(xué)調(diào)查及衛(wèi)生檢疫等提供快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)手段，更好地應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

氣腫疽梭菌標(biāo)準(zhǔn)株C54-1，購(gòu)自于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；氯金酸（HAuCl4·4H2O），購(gòu)自科興生物科技有限公司；檸檬酸三鈉C6H5Na3O7·2H2O，購(gòu)自北京華力德科技有限公司；二氯二甲基硅烷（Sigma公司產(chǎn)品）；PVC底板、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜、MAX線(xiàn)標(biāo)簽貼紙、色皮標(biāo)簽等，購(gòu)自杭州隆基生物技術(shù)有限公司；BSA，購(gòu)自Promega公司；樣品墊及吸水墊，購(gòu)自上海金標(biāo)生物科技有限公司。

1.2 單克隆抗體的制備、純化及檢測(cè)

注射經(jīng)離心洗滌的雜交瘤細(xì)胞于8周齡BALB/c小鼠，待有腹水形成后，取腹水并用間接ELISA法檢測(cè)腹水效價(jià)。采用Protein A 親和層析法對(duì)單克隆抗體進(jìn)行純化，用紫外光分光光度計(jì)測(cè)量純化的單抗?jié)舛?，將單抗溶液?0倍稀釋?zhuān)謩e于260 nm 和280 nm 波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，并于-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 膠體金的制備

采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金，制備膠體金粒徑大小為20～25 nm。將100 mL去離子水和1 mL 1%氯金酸溶液加入硅化處理好的錐形瓶中，加熱至完全沸騰時(shí)，迅速加入1.5 mL 1%檸檬酸三鈉，煮沸5～10 min，發(fā)現(xiàn)溶液顏色漸變成酒紅色后，繼續(xù)煮沸10 min取下，置于常溫自然涼透，補(bǔ)足水分，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 金標(biāo)的制備

1.4.1 氣腫疽梭菌單抗與膠體金顆粒結(jié)合的最適pH值確定

將制備的膠體金加入若干2 mL離心管中，1.5 mL/管。將pH值分別調(diào)為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0。按pH值從低到高分別加50 μL 1 mg/mL 的單抗IgG到離心管中，搖勻30 min后靜置約10 min；再將100 μL的10% NaCl溶液加至管中，搖勻20 min后靜置約1 h，觀(guān)察顏色變化情況，記錄能保持為紅色的最低pH值，即為最適pH值。

1.4.2 單克隆抗體最適用量的確定

分別取金標(biāo)用抗體5、10、15、20、25、30、35、40、45 μg，加入1 mL膠體金溶液中充分混勻，完成后室溫靜置約1 h，觀(guān)察膠體金溶液的顏色變化。

1.4.3 膠體金探針的制備

取已制備好的膠體金溶液 20 mL 加入50 mL離心管中，將膠體金溶液的pH值調(diào)整為略高于最適pH值0.2～0.4，在磁力加熱攪拌器運(yùn)行中，將純化后的單克隆抗體溶液按最佳結(jié)合濃度緩慢滴入膠體金溶液中，混勻后室溫靜置10 min，再置于磁力攪拌器上加入終濃度為2%的BSA，離心棄上清，用TBS將沉淀溶解，即為合成探針。

1.4.4 膠體金探針的純化

先除去其中未被完全標(biāo)記的膠體金和在標(biāo)記的過(guò)程中容易產(chǎn)生的多種聚合物[11]。應(yīng)用低溫高速離心純化方法，將標(biāo)記好的膠體金先以小轉(zhuǎn)數(shù)離心；再將收集的上清液以13 500 r/min離心1 h，此時(shí)將上清液緩慢倒出。將沉淀以原體積的膠體金重懸液溶解沉淀，低溫重復(fù)離心2～3次，沉淀溶于原體積的膠體金重懸液中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 試紙條的制備

1.5.1 金標(biāo)墊的制備

在金標(biāo)墊處理液Ⅰ與Ⅱ中分別處理玻璃纖維素膜GF-08和Ahlstrom 8964，1 h后取出并于常溫中晾干，干燥保存。玻璃纖維素膜處理完畢后剪成50 mm寬的長(zhǎng)條，把制備好的金標(biāo)探針按一定量均勻噴涂于玻璃纖維上，選出最佳玻璃纖維膜及處理液。

1.5.2 樣品墊的預(yù)處理

將樣品墊裁剪成適當(dāng)尺寸浸入預(yù)處理液中浸泡20 min取出，控干液體，置烘干箱，烘干后干燥保存。

1.5.3 NC膜的優(yōu)選

選擇不同流速的Millipore HFB1350220、whatman Immunopore RP、whatman Immunopore FP、Sartorius CN 140、whatman AE 99 （無(wú)背襯）硝酸纖維素膜于處理液中，浸泡30 min取出，用PBS沖洗，烘干。進(jìn)行流速試驗(yàn)，注意其流速和反應(yīng)背景均勻度，選擇層析速度快（3～5 min）且背影小、顏色淡的硝酸纖維膜。

1.5.4 T線(xiàn)及C線(xiàn)條件的優(yōu)化

將純化處理好的兔抗氣腫疽梭菌血清及羊抗鼠IgG分別按以下比例稀釋?zhuān)? ∶2、1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32。然后劃在NC膜的檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)上進(jìn)行優(yōu)化（做方陣試驗(yàn)），選出效果最好的一組進(jìn)行包被。

1.5.5 封閉液的優(yōu)化

將噴涂有腫疽梭菌多抗及羊抗鼠IgG的NC膜分別置于5%犢牛血清、3%脫脂乳和1%BSA中，在封閉液中浸泡30 min，取出用PBS沖洗，晾干，制成試紙條，用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性和陰性血清作試驗(yàn)，篩選出最佳封閉液。

1.5.6 試紙條的組裝

將硝酸纖維素膜貼在PVC底板中央，貼后不要有空隙和氣泡；金標(biāo)結(jié)合墊平貼于NC膜T線(xiàn)下方壓住 NC 膜重疊5 mm、然后粘貼樣品板及吸水紙，小心抹平，最后貼上MAX線(xiàn)標(biāo)貼和色皮標(biāo)簽，即成檢測(cè)試紙條。

1.6 試紙條的檢測(cè)方法和結(jié)果判定

使試紙條保持豎直方向，將樣品墊端放入稀釋后的待檢樣液中（注意液面不可超過(guò)MAX 線(xiàn)），室溫下作用5～10 min，觀(guān)察結(jié)果。

1.7 敏感性試驗(yàn)

將氣腫疽梭菌菌液做1 ∶50、1 ∶100、1 ∶200、1 ∶400倍比稀釋?zhuān)謩e將試紙條插入以上不同稀釋度的菌液中，觀(guān)察結(jié)果。

1.8 特異性試驗(yàn)

用膠體金試紙條檢測(cè)選取與氣腫疽梭菌種系相近的腐敗梭菌、肉毒梭菌進(jìn)行特異性試驗(yàn)，觀(guān)察檢測(cè)結(jié)果是否存在交叉反應(yīng)。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

隨機(jī)取40支試紙條進(jìn)行檢測(cè)試驗(yàn)，10只進(jìn)行陰性樣品檢測(cè)，30支進(jìn)行陽(yáng)性樣品檢測(cè)，測(cè)定試紙條的重復(fù)性。

1.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將膠體金試紙條置于室溫和4 ℃冰箱中保存，半年內(nèi)檢測(cè)1次/月保存的陽(yáng)性菌液及陰性對(duì)照菌液，觀(guān)察檢測(cè)結(jié)果，比較符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單克隆抗體的制備、純化及檢測(cè)

全菌加強(qiáng)免疫后收集血清，經(jīng)辛酸-硫酸銨法進(jìn)行抗體的粗提，并透析除鹽處理后，以間接ELISA法檢測(cè)多抗效價(jià)，氣腫疽梭菌的抗體效價(jià)為1 ∶25 600。

經(jīng)辛酸-硫酸銨法粗提，再用Protein A 親和層析法純化，間接ELISA法測(cè)定的單克隆抗體效價(jià)為1 ∶102 400，抗體效價(jià)升高1倍。測(cè)得純化蛋白的濃度為28.14 mg/mL（紫外分光度計(jì)測(cè)定）。

2.2 單克隆抗體與膠體金結(jié)合的最佳pH值確定

將膠體金溶液的pH值分別調(diào)為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0。按pH值從低到高分別加50 μL 1 mg/mL 單抗IgG和100 μL 10% NaCl溶液至膠體金管中，振搖20 min，室溫下靜置1 h。根據(jù)膠體金的顏色變化，確定了最低pH值為8，再做pH值為7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8幾個(gè)梯度，室溫下放置2 h，觀(guān)測(cè)膠體金顏色變化，記錄仍保持紅色的pH值，穩(wěn)定膠體金的最適pH值為8.4。

2.3 膠體金標(biāo)記單克隆抗體最適用量的確定

將膠體金顆粒與氣腫疽梭菌單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記。觀(guān)察膠體金溶液的顏色變化，穩(wěn)定膠體金所需抗體的最低量為 25 μg，而實(shí)際標(biāo)記中使用免疫金抗體的量為最低量再加20%，即為30 μg，確定單克隆抗體與膠體金的的最佳結(jié)合濃度應(yīng)為30 μg/mL。

2.4 金標(biāo)墊的制備

將已經(jīng)純化好的金標(biāo)探針按一定量均勻噴涂于玻璃纖維上，于室溫干燥后觀(guān)察顏色和均勻度。比較結(jié)果為浸泡在金標(biāo)墊處理液Ⅱ中的Ahlstrom 8964玻璃纖維干燥后的顏色（酒紅色）與純化后的免疫膠體金顏色相同，且均勻度最好；檢測(cè)樣品時(shí)，玻璃纖維上的膠體金探針被溶解并帶動(dòng)其向前移動(dòng)，釋放效果最好。所以本試驗(yàn)選用Ahlstrom8964玻璃纖維膜（經(jīng)金標(biāo)處理液Ⅱ處理的）為金標(biāo)墊。

2.5 不同型號(hào)NC膜的選擇結(jié)果

選擇5種不同型號(hào)的NC膜，用NC 膜處理液于37 ℃浸泡30 min。做流速試驗(yàn)，Millipore HFB1350220型NC膜所用的時(shí)間最短，僅為4 min，且擴(kuò)散均勻不拖帶。因此，選擇該型號(hào)的硝酸纖維素膜作為免疫層析載體膜。

2.6 T線(xiàn)及C線(xiàn)的優(yōu)化結(jié)果

氣腫疽梭菌多抗進(jìn)行1 ∶4倍稀釋時(shí)，效果較好（顏色清晰且無(wú)拖帶現(xiàn)象），以1 ∶4稀釋后噴于T線(xiàn)；羊抗鼠IgG做 1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8稀釋時(shí)，均能得到理想效果。將羊抗鼠IgG作1 ∶8稀釋后噴在C線(xiàn)上；按2.0 μL/cm的噴膜量進(jìn)行噴膜可達(dá)到較好結(jié)果，免疫層析顯色較快，顏色深且清晰可辨，顯色條帶無(wú)中空效果。

2.7 試紙條的組裝和判定

檢測(cè)樣品溶液，在5～10 min內(nèi)觀(guān)察檢測(cè)結(jié)果，根據(jù)出現(xiàn)紅色反應(yīng)線(xiàn)的情況確定待檢樣液的陰性、陽(yáng)性，若出現(xiàn)2條紅色反應(yīng)線(xiàn)則為陽(yáng)性反應(yīng)，只出現(xiàn)質(zhì)控線(xiàn)上1條紅線(xiàn)為陰性反應(yīng)，均不顯紅色線(xiàn)則試紙條無(wú)效（圖1）。

2.8 敏感性試驗(yàn)

將氣腫疽梭菌菌液做1 ∶50、1 ∶100、1 ∶200、1 ∶400倍稀釋?zhuān)Y(jié)果顯示氣腫疽梭菌菌液稀釋至1 ∶100倍時(shí)，結(jié)果仍顯示為陽(yáng)性，檢測(cè)到的菌液最低抗原量為1×105 CFU/mL。

2.9 特異性試驗(yàn)

用膠體金試紙條檢測(cè)氣腫疽梭菌（C54-1）、腐敗梭菌、肉毒梭菌。檢測(cè)結(jié)果顯示，氣腫疽梭菌呈陽(yáng)性，試紙條無(wú)假陽(yáng)性與交叉反應(yīng)現(xiàn)象（圖2）。

2.10 重復(fù)性試驗(yàn)

10條試紙條進(jìn)行陰性樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，T線(xiàn)均不出條帶，9條試紙條C線(xiàn)顯現(xiàn)深紅色帶，1條的C線(xiàn)為淺紅色帶；檢測(cè)陽(yáng)性樣品的30條試紙條，T線(xiàn)C線(xiàn)均出現(xiàn)紅色條帶，由此得出試紙條的重復(fù)性達(dá)到100%，重復(fù)性好。

2.11 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將試紙條密封后于室溫和4 ℃環(huán)境存放，5個(gè)月內(nèi)均能正常穩(wěn)定顯色，室溫環(huán)境中于5個(gè)月后略出現(xiàn)膠體金探針釋放不完全的現(xiàn)象，4 ℃條件下放置的試紙條在6個(gè)月后才出現(xiàn)上述現(xiàn)象，但特異性無(wú)變化。

3 討論

膠體金是氯金酸的水溶膠，可以結(jié)合多種生物大分子，現(xiàn)已成為在免疫標(biāo)記技術(shù)中1種常用的非放射性示蹤劑。在1971年，F(xiàn)aulk和Taylor首次將膠體金顆粒用抗體來(lái)標(biāo)記，在免疫化學(xué)領(lǐng)域中誕生了1項(xiàng)新技術(shù)[12]。與ELISA法相比，除了都具有較強(qiáng)的特異性和敏感性之外，在操作上也更加簡(jiǎn)便快速，無(wú)需復(fù)雜儀器設(shè)備且極易判斷，保質(zhì)期長(zhǎng)。隨著試劑盒品種和銷(xiāo)售量的不斷增長(zhǎng)，現(xiàn)已發(fā)展為生產(chǎn)完全自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化水平。

膠體金顆粒質(zhì)量除了受水質(zhì)、試劑純度等多種因素的影響之外，還與檸檬酸鈉的加入以及攪拌的程度和加入速度有關(guān)。制備膠體金溶液玻璃器皿的清潔是成功制備膠體金的前提條件[13]。由膠體金的性質(zhì)可知，膠體金具有不穩(wěn)定性，有聚沉的可能，故制備好后盡量在20 d以?xún)?nèi)進(jìn)行標(biāo)記[14]，不可長(zhǎng)時(shí)間放置。在膠體金診斷試紙條的研制過(guò)程中，需要對(duì)一系列反應(yīng)條件和材料進(jìn)行優(yōu)化和篩選。固相蛋白與NC膜的結(jié)合是重中之重，是否能獲得靈敏度高、重復(fù)性好的檢測(cè)結(jié)果取決于蛋白與膜的結(jié)合效果。蛋白與膜的結(jié)合力主要為疏水作用力、氫鍵和靜電吸引力，所以在優(yōu)化蛋白結(jié)合膜時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮到這幾種力的作用，選擇不會(huì)使疏水作用力和靜電引力下降的緩沖液，使之不影響蛋白結(jié)合力。噴完抗體后對(duì)NC膜做適當(dāng)?shù)母稍?，使蛋白能夠長(zhǎng)期而穩(wěn)定地與膜結(jié)合。本試驗(yàn)應(yīng)用雙抗體夾心法，將氣腫疽梭菌多抗包被在檢測(cè)線(xiàn)處，羊抗鼠IgG包被在質(zhì)控線(xiàn)處，金標(biāo)單克隆抗體吸附在纖維素膜固相載體上來(lái)裝備試紙條，檢測(cè)樣品中的抗原。當(dāng)待檢樣液中有氣腫疽梭菌（C.chauvoei）時(shí)，形成“金標(biāo)單抗-C.chauvoei”復(fù)合物，由于毛細(xì)虹吸作用，該復(fù)合物以及未結(jié)合的金標(biāo)單抗往上走，在檢測(cè)線(xiàn)上形成“金標(biāo)單抗-C.chauvoei-多抗”復(fù)合物，因有金顆粒在此沉積，故出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)紅色條帶，未結(jié)合的金標(biāo)單抗繼續(xù)上行，與控制線(xiàn)上的羊抗鼠IgG結(jié)合，又形成1條紅色條帶；若待檢樣液中不含C.chauvoei，則只出現(xiàn)1條紅色條帶，只在試紙條上端的C線(xiàn)上出現(xiàn)紅色沉淀線(xiàn)。試驗(yàn)證明該試紙條的檢測(cè)不僅耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，而且成本較低，適用于氣腫疽的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)及鑒別診斷，可以在實(shí)踐中推廣使用。

參考文獻(xiàn)：

[1]陸安法，徐官紅，簡(jiǎn)廷安，等. 牛氣腫疽的防制[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2003，24（6）：131-131.

[2]Quinn P J，Carter M E，Markey B，et al. Clostridium species[M]//Clinical veterinary microbiology. London：Elsevier，1994：191-208.

[3]Timoney J F，Gillespie J H，Scott F W，et al. The genus Clostridium[M]//Hagan and Bruners microbiology and infectious diseases of domestic animals. 8th ed. New York：Cornell University Press，Comstock Publishing Associates，1988：214-240.

[4]Wierup M，Sandstedt K. Backleg and pulpy kidney disease-two actual clostridial diseases in Sweden[J]. Sv Vet Tidn，1983，35：23-24.

[5]Sasaki Y，Yamamoto K，Kojima A，et al. Rapid identification and differentiation of pathogenic clostridia in gas gangrene by polymerase chain reaction based on the 16S-23S rDNA spacer region[J]. Research in Veterinary Science，2000，69（3）：289-294.

[6]Moussa R S. Antigenic formulae for Clostridium septicum and Clostridium chauvoei[J]. The Journal of Pathology and Bacteriology，1959，77（2）：341-350.

[7]Songer J G. Clostridial diseases of small ruminants[J]. Veterinary Research，1998，29（3/4）：219-232.

[8]Sathish S，Swaminathan K. Molecular characterization of the diversity of Clostridium chauvoei isolates collected from two bovine slaughterhouses：analysis of cross-contamination[J]. Anaerobe，2008，14（3）：190-199.

[9]Hatheway C L. Toxigenic clostridia[J]. Clinical Microbiology Reviews，1990，3（1）：66-98.

[10]Vilei E M，Johansson A，Schlatter Y，et al. Genetic and functional characterization of the NanA sialidase from Clostridium chauvoei[J]. Veterinary Research，2011，42（1）：2.

[11]楊小姣.膠體金免疫層析快速檢測(cè)氯霉素技術(shù)研究[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2007.

[12]Faulk M P，Taylor G M.An Immunocolloid method for the electron microscope[J]. Immunochemistry，1971，8（11）：1081-1083.

[13]Chandler J，Gurmin T，Robinson N. The place of gold in rapid tests[J]. IVD Technology，2000，6（2）：37-49.

[14]蒲 丹. SARS病毒重組核衣殼蛋白膠體金試紙條研制和臨床驗(yàn)證[D]. 重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2004.