王鵬+郭麗+周鳳超

摘要：以玉米皮為原料，分析液料比、乙醇體積分數、提取溫度和超聲時間等單因素對類黃酮得率的影響，利用響應面法優(yōu)化超聲波輔助提取類黃酮物質工藝，優(yōu)化玉米皮制備天然抗氧化劑的提取工藝；通過測定所提取類黃酮物質的清除自由基能力，評價玉米皮類黃酮物質的抗氧化活性。結果表明：玉米皮類黃酮物質提取的最佳工藝條件為料液比1 g ∶25 mL、乙醇體積分數50%、提取溫度33 ℃、超聲時間57 min，類黃酮物質的得率為12.96 mg/g；在優(yōu)化條件下，類黃酮物質得率的試驗驗證值與預測值誤差在±1.0%之內。在上述優(yōu)化工藝前提下，發(fā)現玉米皮類黃酮物質對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基均具有較強清除作用，其半數抑制濃度分別為8.436、0.825、0.621 mg/mL。

關鍵詞：玉米皮；類黃酮；響應面法；超聲波；抗氧化

中圖分類號： R284.2 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0337-04

玉米是禾本科蜀黍屬一年生草本植物，我國玉米產量位居世界第2位，其中玉米皮作為玉米深加工的副產物，年產量可達到2 000萬t。玉米皮的綜合利用，多以飼料為主。近年來，玉米皮的開發(fā)利用集中在功能性物質的提取方面，有研究者從玉米皮中提取了多肽、多糖、黃色素等功能性物質[1-3]。研究發(fā)現，在玉米等禾本科植物細胞壁中含有一定量的阿魏酸、對香豆酸、芥子酸等類黃酮物質[4]，在細胞壁中與多糖和木質素進行交聯。這些類黃酮物質具有許多生理功能，如清除自由基、抗紫外線輻射、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌消炎、止痛、抗突變、防癌、增強精子活力以及調節(jié)人體免疫功能等[5-7]。超聲波提取技術廣泛應用于植物類原料類黃酮物質的提取工藝中，該技術利用超聲波具有的機械效應、熱效應和空化效應，通過破壞細胞組織、增大提取溶劑分子的運動速度和穿透力以獲得生物有效成分，具有提取時間短、效率高的優(yōu)勢[8-10]。本試驗采用響應面法優(yōu)化超聲波輔助提取玉米皮類黃酮物質工藝，并進一步研究玉米皮類黃酮物質的抗氧化活性，以期為開發(fā)利用類黃酮等天然抗氧化劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米皮：購自黑龍江省綏化市望奎縣，分離、粉碎成粉后過20目篩。

試劑：1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、蕓香苷、三羥基氨基甲烷（Tris）均購自美國Sigma-Aldrich公司，維生素C、鄰二氮菲、FeSO4、鄰苯三酚、無水乙醇均為分析純。

1.2 儀器

KQ-200VDE型雙頻數控超聲波清洗器，購自昆山市超聲儀器有限公司；TU1901紫外-可見分光光度計，購自北京普析通用儀器有限責任公司；FW100高速萬能粉碎機，購自天津市泰斯特儀器有限公司；XT120A電子天平，購自瑞士普利賽斯有限公司；GL-16G-Ⅱ冷凍離心機，購自上海安亭科學儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 玉米皮類黃酮物質的提取 準確稱取2.0 g玉米皮粉，加入乙醇溶液，放入功率180 W、45 kHz超聲波清洗儀中，在不同溫度和時間下超聲處理提取類黃酮，以3 000 r/min離心10 min，上清液為玉米皮類黃酮提取液。

1.3.2 類黃酮物質含量的測定 采用Chun等的方法[11]測定玉米皮類黃酮物質含量。精確吸取蘆丁標準溶液體積分別為0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL比色管中。加入0.4 mL 5%亞硝酸鈉溶液搖勻，放置6 min，再加入0.4 mL 10%氯化鋁溶液，搖勻，放置6 min，加入4.0 mL 4%氫氧化鈉溶液，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻后放置15 min。使用紫外-可見分光光度計在510 nm測定吸光度，并繪制標準曲線。所得標準曲線方程為：y=0.029 900x-0.013 623（r2=0.990 4）。取一定稀釋倍數的樣品溶液按標準曲線制作方法測定吸光度，利用標準曲線計算樣品中類黃酮含量。

1.3.3 玉米皮類黃酮物質提取工藝優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗 研究料液比、乙醇體積分數、提取溫度和超聲時間對玉米皮類黃酮物質提取得率的影響。料液比分別取1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g ∶mL）；乙醇體積分數分別取20%、30%、40%、50%、60%、70%；提取溫度分別為20、30、40、50、60 ℃；超聲時間分別為0、30、60、90、120 min。

1.3.3.2 響應面試驗 在單因素試驗基礎上，以X1料液比、X2乙醇體積分數、X3提取溫度、X4超聲時間為自變量，以玉米皮類黃酮物質提取得率Y為響應值，設計4因素3水平的響應面優(yōu)化試驗。因素水平選取見表1。

1.3.4 抗氧化特性分析 響應面試驗的結果獲得了最佳提取條件，在此基礎上制備玉米皮類黃酮物質提取液，以維生素C為對照，分析玉米皮類黃酮物質抗氧化特性。

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力的測定 DPPH自由基清除率的測定參照Yamaguchi等的方法[12]進行。精確稱取 4 mg DPPH自由基，用無水乙醇溶解并定容于250 mL棕色容量瓶中，配制成1×10-4 mol/L的DPPH自由基溶液，于0～4 ℃ 避光保存，備用。分別取2 mL待測提取溶液與2 mL DPPH溶液均勻混合，在黑暗中放置30、60 min后，于517 nm波長處測定2次吸光度，空白處理以無水乙醇取代樣品，2次重復。DPPH自由基清除率可表示為：

2 結果與分析

2.1 玉米皮類黃酮物質提取單因素試驗

以乙醇體積分數50%、提取溫度40 ℃、超聲時間60 min為提取條件，研究料液比對玉米皮類黃酮物質得率的影響（圖1-A）。隨著料液比的變大，玉米皮類黃酮得率呈現先增加后下降的趨勢，在料液比為1 g ∶25 mL時得率最大，類黃酮物質從原料中溶出最多。從節(jié)約溶劑角度考慮，選擇料液比的研究范圍為 1 g ∶（20～30） mL。

以料液比1 g ∶25 mL、提取溫度40 ℃、超聲時間60 min為提取條件，研究乙醇體積分數對玉米皮類黃酮物質得率的影響（圖1-B）。隨著乙醇體積分數的增加，玉米皮類黃酮物質得率呈現先增加后下降的趨勢，在乙醇體積分數為50%時得率最大，不同體積分數的乙醇極性不同，因而對類黃酮物質的溶解能力也有所不同[10]。

以料液比1 g ∶25 mL、乙醇體積分數50%、超聲時間 60 min 為提取條件，研究溫度對玉米皮類黃酮物質得率的影響（圖1-C）。隨溫度的升高，玉米皮類黃酮物質得率呈現先升高后下降的趨勢，在30 ℃時，玉米皮類黃酮物質得率最高。溫度大于30 ℃類黃酮物質得率降低，可能是乙醇揮發(fā)使液料比發(fā)生變化影響得率，也可能是溫度高使類黃酮物質的化學結構被破壞影響類黃酮的得率[13]。

以料液比1 g ∶25 mL、乙醇體積分數50%、提取溫度 30 ℃ 為提取條件，研究超聲時間對玉米皮類黃酮物質得率的影響（圖1-D）。提取60 min時類黃酮物質得率達到最大，原因是玉米皮細胞破碎，提取劑充分進入細胞內，加速了類黃酮物質的溶出。超聲提取60 min后，由于長時間超聲振動導致類黃酮物質結構破壞而分解，類黃酮物質得率呈現下降趨勢[14-15]。

2.2 響應面優(yōu)化玉米皮類黃酮物質提取工藝

在數學模型中固定2個因素，分析其他2個因素交互作用對類黃酮物質得率的影響，結果見圖2。

采用Design-Expert.V8.0.6軟件對回歸模型進行優(yōu)化，對響應面優(yōu)化超聲波提取玉米皮類黃酮物質工藝結果擬合分析得到最佳提取工藝條件為料液比1 g ∶25 mL、乙醇體積分數50%、提取溫度33 ℃、超聲時間57 min，在此條件下對類黃酮得率的預測值為12.96 mg/g。在優(yōu)化條件下，驗證試驗中玉米皮類黃酮物質得率為12.84 mg/g，驗證值與預測值誤差在±1.0%之內，說明試驗結果符合模型，優(yōu)化的提取工藝參數是可靠的，此響應面模型具有可行性。

2.3 玉米皮類黃酮物質抗氧化性研究

對優(yōu)化條件下得到的玉米皮類黃酮物質進行抗氧化性研究，以維生素C為對照，結果如表4所示，類黃酮物質對 DPPH 自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基均具有一定的清除能力。玉米皮類黃酮物質對DPPH自由基的清除能力明顯高于維生素C，對超氧陰離子自由基的清除能力與坑壞血酸相近，對羥自由基的清除能力低于維生素C。玉米皮類黃酮物質清除自由基能力的差異可能與其純度有關。

3 結論

玉米皮類黃酮物質超聲波提取工藝最佳條件為料液比 1 g ∶25 mL、乙醇體積分數50%、提取溫度33 ℃、超聲時間57 min，在此條件下類黃酮物質得率達到12.96 mg/g。響應面優(yōu)化模型能夠有效地提高玉米皮中類黃酮物質得率，在今后的研究中可再結合酶法進行工藝優(yōu)化，以期得到更高的類黃酮物質得率。

玉米皮類黃酮提取物對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基均具有較強清除作用，半數抑制濃度分別為8.436、0.825、0.621 mg/mL。本研究結果對天然抗氧化劑的開發(fā)利用具有一定的指導意義。

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