人參皂苷rg3聯(lián)合rh-ES治療乳腺癌荷瘤小鼠的實驗研究

李根，陳文文，梁華，王玉蘭

（四川省成都市婦女兒童中心醫(yī)院 藥劑科，四川 成都 610091）

乳腺癌是女性高發(fā)腫瘤，流行性病學(xué)調(diào)查顯示，乳腺癌是女性首位惡性腫瘤，每年發(fā)病率約42/10萬，并且逐年增高[1]。放化療是乳腺癌常用治療方案，但傳統(tǒng)的放化療藥物具有較強毒副作用，并易出現(xiàn)耐藥。在這種情況下，臨床開始探究使用植物來源的天然化合物治療乳腺癌的可行性[2]。已有研究[3]表明，人參皂苷rg3是人參根部提取的單體成分，對多種腫瘤細胞生長、浸潤以及轉(zhuǎn)移具有抑制作用，并且毒副作用較低。重組人血管內(nèi)皮抑素（rh-ES，恩度）則是臨床常用的非小細胞肺癌治療藥物，其在乳腺癌中的價值如何，臨床研究較少。本研究分析了人參皂苷rg3及人參皂苷rg3聯(lián)合恩度對MCF-7乳腺癌細胞移植小鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

購買72只雌性裸小鼠，SPF級，體質(zhì)量15～20 g，購買自中科院國家嚙齒類上海實驗分中心，3～4周齡。

1.2 實驗儀器與藥品

流式細胞儀由美國DD細胞公司生產(chǎn)；PCR儀由美國MJ Research公司生產(chǎn)；紫外分光光度儀由日本Shimadzu公司生產(chǎn)；凝膠圖像分析系統(tǒng)由美國PALL公司生產(chǎn)。恩度由山東先聲麥得津生物制藥有限公司提供；人參皂苷rg3由遼寧生物醫(yī)藥科技有限公司提供；VEGF兔抗人單克隆抗體由美國eBioscience公司提供；BAD顯色試劑盒由福州邁新生物技術(shù)有限公司提供；小牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司提供。

1.3 模型制備與干預(yù)方法。

將MCF-7細胞取出后，于無菌環(huán)境下PBS洗點3次，滴入0.2 mL胰蛋白酶，置于溫箱內(nèi)培養(yǎng)10 min，待細胞復(fù)蘇后，置于100 mL 10%小牛血清+100 IU/mL青霉素+0.03%L-谷氨酞胺溶液內(nèi)，室溫環(huán)境培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)3代。取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，選用30 mL胰蛋白酶消化，并選用臺盼藍染液進行細胞計數(shù)，計數(shù)在95%顯示穿代成功。于顯微鏡下將細胞數(shù)調(diào)整至5×107個/mL，并其接種至小鼠右側(cè)乳房，待造模成功后，采用隨機數(shù)字表法分為對照組（等量生理鹽水注射）、人參皂苷組（靜注人參皂苷rg3 5 mg/kg，隔日1次）、恩度組（靜注10 mg/kg，隔日1次）、聯(lián)合組（靜注恩度10 mg/kg+人參皂苷rg3 5 mg/kg，隔日1次）各18只，干預(yù)時間3周。

1.4 指標檢測方法

1.4.1 腫瘤質(zhì)量、體積測量 干預(yù)3周后，脫頸處死小鼠，取出瘤體，計算瘤體質(zhì)量及體積：腫瘤體積=1/12πab2，抑瘤率=（1-治療組瘤重/對照組瘤重）×照組瘤重。

1.4.2 流式細胞術(shù) 取各組樣本剪碎后制備成細胞懸液，2 500r/min離心10 min，沉淀后懸PBS洗滌2次，70%酒精固定25 min，滴入15 mL 10%Trition X-100孵化15 min，滴入0.2 mg/mL Rnase孵化10 min，選用碘化丙啶幾Annexin-V進行雙染色，病選用流式細胞儀檢測細胞周期情況。

1.4.3 RT-PCR 根據(jù)TRIZol法提取樣本總RNA，收集沉淀下來的核酸，并選用冷乙醇洗滌2次，干燥后選用50 mL 0.2% DEPC進行水解，選用DNA/RNA紫外檢測儀檢測其含量。根據(jù)MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶方法進行cDNA制備操作，取5 μL cDNA選用Taq酶進行擴增，將樣本PCR反應(yīng)，條件為：95 ℃，60 s；55 ℃，60 s；72 ℃，30 s，32 個循環(huán)。將所得物置于1.5%瓊脂糖凝膠上電泳20 min，選用凝膠成像系統(tǒng)進行定量分析。

1.4.4 Western blot 將樣本剪碎后加入至400 μL裂解液內(nèi)，碾碎組織，裂解30 min后，2 500r/min離心10 min，取上清并冷藏待用。取100 μg樣本，滴入10 mL Tris2HCL，15 mL二硫蘇糖醇，10 mL PL，震蕩均勻，于100 ℃下變性5 min，滴至不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠樣品孔內(nèi)，電泳，VEGF兔抗人單克隆抗體一抗，山羊IgG二抗，ECL顯色，并鏡檢[4]。

1.4.5 免疫組化 將樣本常規(guī)包埋切片后，脫蠟水化，并選用500 mL檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復(fù)，PBS洗滌3次，MMP-2、MMP-9兔抗人單克隆抗體一抗，羊抗兔IgG二抗；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鏡檢。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計軟件采用SPSS 16.0，采用均數(shù)±標準差（±s）進行統(tǒng)計描述，多組間比較采用單因素方差分析法，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠腫瘤質(zhì)量、體積及抑制率比較

人參皂苷組、恩度組、聯(lián)合組組小鼠的腫瘤質(zhì)量、體積均明顯低于對照組（均P＜0.05）；聯(lián)合組的腫瘤質(zhì)量、體積均明顯低于人參皂苷組、恩度組（均P＜0.05），抑制率明顯大于人參皂苷組、恩度組（均P＜0.05）；人參皂苷組與恩度組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（表1）。

表1 各組小鼠腫瘤質(zhì)量、體積及抑制率比較（n=18，±s）

表1 各組小鼠腫瘤質(zhì)量、體積及抑制率比較（n=18，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與聯(lián)合組比較，P＜0.05

組別 腫瘤質(zhì)量（g） 腫瘤體積（mm3）抑制率（%）對照組 1.351±0.045 1766.9±97.1 —人參皂苷組 1.070±0.0421),2)1320.1±83.91),2)20.80±1.902)恩度組 1.014±0.0491),2)1281.7±90.01),2)24.94±1.862)聯(lián)合組 0.881±0.0391) 819.6±52.41) 34.79±2.11 F 26.135 25.007 34.198 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 各組小鼠腫瘤組織中細胞周期分布情況比較

人參皂苷組、恩度組、聯(lián)合組3組小鼠的G0/G1期、S期細胞比例均明顯低于對照組，G2/M期細胞比例高于對照組（均P＜0.05）；聯(lián)合組的G0/G1期、S期明顯低于人參皂苷組、恩度組，G2/M期細胞比例明顯高于人參皂苷組、恩度組（均P＜0.05）；人參皂苷組與恩度組間無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）（表2）。

2.3 各組小鼠腫瘤組織中VEGF mRNA、蛋白的表達率比較

人參皂苷組、恩度組、聯(lián)合組3組小鼠的V E G F m R N A、蛋白均明顯低于對照組（均P＜0.05）；聯(lián)合組的VEGF mRNA、蛋白均明顯低于人參皂苷組、恩度組（均P＜0.05）；人參皂苷組與恩度組間無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）（圖1）（表3）。

表2 各組小鼠腫瘤組織中細胞周期分布情況比較（%，n=18，±s）

表2 各組小鼠腫瘤組織中細胞周期分布情況比較（%，n=18，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與聯(lián)合組比較，P＜0.05

組別 G0/G1期 S期 G2/M期對照組 53.29 33.18 12.46人參皂苷組 41.171),2) 29.111),2) 27.411),2)恩度組 38.201),2) 28.641),2) 29.531),2)聯(lián)合組 31.161) 24.131) 34.881)F 42.180 21.694 49.807 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖1 腫瘤組織中VEGF表達檢測 A：VEGF mRNA檢測；B：VEGF蛋白表達檢測 1：對照組；2：人參皂苷組；3：恩度組；4：聯(lián)合組

表3 各組小鼠腫瘤組織中VEGF mRNA、蛋白表達水平比較（光密度值，n=18，±s）

表3 各組小鼠腫瘤組織中VEGF mRNA、蛋白表達水平比較（光密度值，n=18，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與聯(lián)合組比較，P＜0.05

組別 VEGF mRNA VEGF蛋白對照組 1.294 0.562人參皂苷組 1.0441),2) 0.4611),2)恩度組 0.9381),2) 0.4451),2)聯(lián)合組 0.7291) 0.2761)F 22.008 14.796 P＜0.001 ＜0.001

2.4 各組小鼠腫瘤組織中MMP-2、MMP-9蛋白的表達率比較

人參皂苷組、恩度組、聯(lián)合組3組小鼠腫瘤組織的MMP-2、MMP-9蛋白表達率明顯低于對照組（均P＜0.05）；聯(lián)合組的MMP-2、MMP-9蛋白明顯低于人參皂苷組、恩度組（P＜0.05）；人參皂苷組與恩度組間無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）（表4）。

表4 各組小鼠腫瘤組織中MMP-2、MMP-9蛋白表達率比較（%，n=18，±s）

表4 各組小鼠腫瘤組織中MMP-2、MMP-9蛋白表達率比較（%，n=18，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與聯(lián)合組比較，P＜0.05

組別 MMP-2 MMP-9對照組 34.06 32.96人參皂苷組 31.841),2) 28.501),2)恩度組 30.771),2) 28.111),2)聯(lián)合組 27.091) 25.941)F 20.085 24.462 P＜0.001 ＜0.001

3 討 論

流行性病學(xué)研究[5]顯示，乳腺癌與雌激素暴露存在密切聯(lián)系，而我國日益增長的工業(yè)污染則進一步加劇了女性雌激素實際負荷量，最終導(dǎo)致我國乳腺癌發(fā)病率逐年增高。MCF-7細胞是一組以雌激素受體陽性為特征的人乳腺癌細胞，可特異性被雌激素及雌激素樣活性因子激活，并增殖、分化[5-7]，所以本研究選用MCF-7細胞進行乳腺癌小鼠的造模并研究了人參皂苷rg3聯(lián)合恩度對腫瘤細胞的作用。

人參皂苷rg3是紅參中提取的一種皂苷，對多種疾病具有改善、預(yù)防作用，如心腦血管疾病、冠心病、記憶力衰退等[8]。研究[9]表明，人參皂苷rg3對包括肺癌、胃癌等在內(nèi)的多種腫瘤細胞具有抑制作用。本研究中，人參皂苷組、恩度組、聯(lián)合組3組小鼠的腫瘤質(zhì)量、體積均顯著的低于對照組，并且聯(lián)合組的腫瘤質(zhì)量、體積均顯著的低于人參皂苷組、恩度組，這表明人參皂苷rg3在抑制小鼠腫瘤增殖上具有顯著療效，如與恩度聯(lián)合使用，這一抑制效用可進一步增強。對比各組小鼠腫瘤組織細胞周期發(fā)現(xiàn)，人參皂苷組、恩度組、聯(lián)合組3組小鼠的G0/G1期、S期均顯著的低于對照組，G2/M期細胞比例高于對照組；聯(lián)合組的G0/G1期、S期顯著的低于人參皂苷組、恩度組，G2/M期細胞比例顯著的高于人參皂苷組、恩度組，這表明人參皂苷rg3可通過將腫瘤細胞周期阻滯在G2/M期來抑制腫瘤細胞增殖、侵襲，并且聯(lián)合恩度使用，療效更佳。

血管新生理論認為腫瘤增殖、分化與其內(nèi)部毛細血管異常增生有關(guān)，而腫瘤新生血管生成影響因素則可能與以下幾方面有關(guān)：⑴ 促血管生成因子與抑制因子平衡破壞；⑵ 內(nèi)皮細胞與血管外基質(zhì)幾間質(zhì)細胞相互作用[10]；⑶ 血管內(nèi)皮細胞內(nèi)的相應(yīng)靶點被激活，促使血管內(nèi)皮基底膜降解，并誘導(dǎo)細胞外基質(zhì)重塑[11]。VEGF是人體內(nèi)最為重要的促血管生成因子，可與血管內(nèi)皮細胞上的特異受體結(jié)合，并誘導(dǎo)血管生成[12]。本研究中，人參皂苷組、恩度組、聯(lián)合組3組小鼠的VEGF mRNA、蛋白顯著的低于對照組，提示人參皂苷rg3可通過抑制VEGF表達來降低腫瘤血管生成，并以此抑制腫瘤增殖、分化。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組的VEGF mRNA、蛋白顯著的低于人參皂苷組、恩度組，這表明聯(lián)合使用時，小鼠腫瘤VEGF的抑制作用更強。

MMPs是中性膚鏈內(nèi)切酶家族，對多種細胞外基質(zhì)具有降解作用。被破壞結(jié)構(gòu)的血管將釋放大量的血管生成因子，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞遷移，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展[13]。MMP-9是MMPs家族分子量最大的酶，可被多種具有轉(zhuǎn)移傾向的腫瘤細胞合成，并通過降解結(jié)構(gòu)蛋白Ⅳ型膠原等來幫助腫瘤細胞突破各種屏障[14]。MMP-2同為MMPs家族成員，可作為酶原、糖基化參與物存在于人體各處。MMP-2對明膠，I、IV以及V型膠原具有裂解能力，并以此參與腫瘤侵襲過程[15]。本組研究中，人參皂苷組、恩度組、聯(lián)合組三組小鼠的MMP-2、MMP-9蛋白顯著的低于對照組；聯(lián)合組的MMP-2、MMP-9蛋白顯著的低于人參皂苷組、恩度組，這表明人參皂苷rg3+恩度對MMP-2、MMP-9的抑制效用最大，并以此降低腫瘤的侵襲性。本研究通過動物實驗，對人參皂苷rg3+恩度的臨床價值及作用機制進行分析，發(fā)現(xiàn)人參皂苷rg3+恩度可通過抑制促血管生成因子、MMPs家族表達，阻滯腫瘤細胞周期并降低腫瘤的侵襲性。但對于參皂苷rg3+恩度作用MCF-7乳腺癌細胞的信號路徑以及具體靶點，我們尚無明確結(jié)論，這有待后續(xù)的研究。

綜上所述，人參皂苷rg3聯(lián)合恩度治療MCF-7乳腺癌細胞移植小鼠，能顯著減低M M P-2、MMP-9蛋白、VEGF mRNA、蛋白的表達，調(diào)節(jié)細胞周期分布，降低腫瘤侵襲性，從而達到抑制腫瘤的目的。

[1]孫大鵬, 顧立學(xué), 李晨光, 等. 人參皂苷Rg3通過人乳腺珠蛋白A促進乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡及其可能的機制[J]. 中國腫瘤生物治療雜志, 2017, 24(6):615–619. doi:10.3872/j.issn.1007–385X.2017.06.007.Sun DP, Gu LX, Li CG, et al. Ginsenoside Rg3 promotes the apoptosis of breast cancer MDA-MB-231 cells via regulation of mammaglobin-A expression[J]. Chinese Journal of Cancer Biotherapy, 2017, 24(6):615–619. doi:10.3872/j.issn.1007–385X.2017.06.007.

[2]陸玲玲. 人參皂苷Rg3聯(lián)合索拉非尼對人肝癌細胞株侵襲與轉(zhuǎn)移的影響[J]. 中國老年學(xué)雜志, 2016, 36(5):1067–1069. doi:10.3969/j.issn.1005–9202.2016.05.020.Lu LL. Effect of ginsenoside Rg3 plus sorafenib on invasiveness and metastasis of human liver cancer cells[J]. Chinese Journal of Gerontology, 2016, 36(5):1067–1069. doi:10.3969/j.issn.1005–9202.2016.05.020.

[3]孫大鵬, 魯明明, 王碩, 等. 人參皂苷Rg3通過Ca2+/CaM信號系統(tǒng)抑制胃癌BGC-823細胞增殖及其可能的機制[J]. 中國腫瘤生物治療雜志, 2015, 22(2):225–229. doi:10.3872/j.issn.1007–385X.2015.02.015.Sun DP, Lu MM, Wang S, et al. Ginsenoside Rg3 inhibits gastric cancer cell proliferation through Ca2 +/CaM kinase downregulation and NF-κ B inactivation[J]. Chinese Journal of Cancer Biotherapy,2015, 22(2):225–229. doi:10.3872/j.issn.1007–385X.2015.02.015.

[4]耿良, 范敬, 高啟龍, 等. 人參皂苷Rg3和 PEG-PLGA-Rg3納米微粒對Lewis 肺癌小鼠的作用及其機制[J]. 北京大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2016, 48(3):496–501. doi:10.3969/j.issn.1671–167X.2016.03.021.Geng L, Fan J, Gao QL, et al. Preliminary study for the roles and mechanisms of 20(R)-ginsenoside Rg3 and PEG-PLGA-Rg3 nanoparticles in the Lewis lung cancer mice[J]. Journal of Peking University: Health Sciences, 2016, 48(3):496–501. doi:10.3969/j.issn.1671–167X.2016.03.021.

[5]Zhang Y, Liu QZ, Xing SP, et al. Inhibiting effect of Endostar combined with ginsenoside Rg3 on breast cancer tumor growth in tumor-bearing mice[J]. Asian Pac J Trop Med, 2016, 9(2):180–183.doi: 10.1016/j.apjtm.2016.01.010.

[6]周彤, 張麗紅, 辛穎, 等. 20 (S)人參皂苷Rg3對糖尿病大鼠腎小管上皮細胞TGF-大鼠表達及凋亡的影響[J]. 中國老年學(xué)雜志, 2015, 35(18):5093–5094. doi:10.3969/j.issn.1005–9202.2015.18.020.Zhou T, Zhang LH, Xin Y, et al. Influence of 20 (S) ginsenoside Rg3 on TGF-β1 expression and apoptosis in renal tubular epithelial cells from diabetic rats[J]. Chinese Journal of Gerontology , 2015,35(18):5093–5094. doi:10.3969/j.issn.1005–9202.2015.18.020.

[7]李健瑩, 欒曉嬌, 王凱乾, 等. 人參皂苷Rg3固體分散體的制備及表征[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2015, 50(10):872–875.Li JY, Nuan XJ, Wang KQ, et al. Preparation and Characterization of Ginsenoside Rg3 Solid Dispersion[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2015, 50(10):872–875.

[8]何斌, 錢立庭, 江浩. 人參皂苷Rg3對鼻咽癌放療患者細胞免疫功能的影響[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2015, 50(9):1293–1296.He B, Qian LT, Jiang H. The effect of Rg3 ginsenosides on cellular immune function of nasopharyngeal carcinoma patients with radiotherapy[J]. Acta Universitatis Medicinalis Anhui, 2015,50(9):1293–1296.

[9]Wong AS, Che CM, Leung KW. Recent advances in ginseng as cancer therapeutics: a functional and mechanistic overview[J]. Nat Prod Rep, 2015, 32(2):256–272. doi: 10.1039/c4np00080c.

[10]成樂琴, 金富標. 檸檬汁輔助雪梨汁催化轉(zhuǎn)化原人參二醇組皂苷制備稀有人參皂苷Rg3[J]. 河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版, 2015,36(5):82–86.Cheng LQ, Jin FB. Snow pear juice catalytic conversion of protopanaxadiol type saponins to ginsenoside rg3 assisted by lemon juice[J]. Journal of Henan University of Technology: Natural Science Edition, 2015, 36(5):82–86.

[11]潘翠珊, 王風(fēng)華, 翁藝芳, 等. 人參皂苷Rg3脂質(zhì)體的處方優(yōu)化及制備工藝研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2015, 26(1):113–117.Pan CS, Wang FH, Weng YF, et al. Study on Optimization of Formulation and Preparation Process of Ginsenoside Rg3 Liposomes[J]. Traditional Chinese Drug Research & Clinical Pharmacology, 2015, 26(1):113–117.

[12]蔣杰, 吳超, 魯明明, 等. 介孔二氧化硅MCM-41 包載人參皂苷Rg3 納米粒對人肺癌A549 細胞的作用研究[J]. 中國藥學(xué)雜志,2016, 51(17):1478–1482.Jiang J, Wu C, Lu MM, et al. The Research of Mesoporous Silica Nanoparticles MCM-41 Loading Ginsenoside Rg3 for Human Lung Cancer Cells A549[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2016,51(17):1478–1482.

[13]Kim SJ, An KK. Anti-breast cancer activity of Fine Black ginseng(Panax ginseng Meyer) and ginsenoside Rg5[J]. J Ginseng Res,2015, 39(2):125–134. doi: 10.1016/j.jgr.2014.09.003.

[14]郭躍龍, 錢靜, 狄留慶, 等. 人參皂苷Rg3及人參皂苷Rh2在腸道菌群失調(diào)大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究[J]. 中草藥, 2016, 47(23):4198–4203. doi:10.7501/j.issn.0253–2670.2016.23.014.Guo YL, Qian J, Di LQ, et al. Pharmacokinetic study on ginsenoside Rg3 and ginsenoside Rh2 in gut microbiota dysbiosis rats[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2016, 47(23):4198–4203.doi:10.7501/j.issn.0253–2670.2016.23.014.

[15]張柘, 吳劍, 鄭勇, 等. 人參皂苷Rg3抗骨肉瘤LJH-OS細胞裸鼠移植瘤的作用及其對腫瘤血管生成擬態(tài)的影響[J]. 中華實驗外科雜志, 2015, 32(7):1569–1571. doi:10.3760/cma.j.issn.1001–9030.2015.07.024.Zhang Z, Wu J, Zheng Y, et al. Effect of ginsenoside-Rg3 on osteosrcoma cells LJH-OS xenograft in nude mice and vasculogenic mimicry[J]. Chinese Journal of Experimental Surgery, 2015,32(7):1569–1571. doi:10.3760/cma.j.issn.1001–9030.2015.07.024.