全永亮

（山東商務(wù)職業(yè)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264670）

泡菜中植物乳桿菌的鑒定及其發(fā)酵液抑菌活性研究

全永亮

（山東商務(wù)職業(yè)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264670）

從山東煙臺(tái)家庭自制泡菜中分離得到1株產(chǎn)抑菌物質(zhì)的乳酸菌菌株。綜合菌株的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和16SrDNA序列分析，鑒定該菌為植物乳桿菌并命名為L(zhǎng)actobacillusplantarumQYL-1。該菌株發(fā)酵上清液對(duì)短小芽孢桿菌（CMCC 63202）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、藤黃微球菌（CMCC 28001）、大腸桿菌（ATCC 25922）等有較好的抑菌作用，其中對(duì)大腸桿菌（ATCC 25922）的抑菌性最強(qiáng)，表現(xiàn)出廣譜抑菌活性。研究對(duì)于純種發(fā)酵及乳酸菌的抑菌活性，具有一定的啟發(fā)和借鑒價(jià)值。

泡菜；植物乳桿菌；抑菌活性

植物乳桿菌是乳酸菌的一種，厭氧或者兼性厭氧，桿狀，同型發(fā)酵，廣泛分布于自然界中，特別是發(fā)酵蔬菜中，比如LactobacillusplantarumKLDS1.0391［1］，LactobacillusplantarumLB-B1［2］。某些植物乳桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素能抑制病原微生物、腐敗性細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，在食品添加劑、飼料添加劑、醫(yī)藥等方面均有較好的應(yīng)用前景。煙臺(tái)氣候溫和，氣溫變幅較小，獨(dú)特的理環(huán)境孕育了豐富的微生物菌群。筆者從煙臺(tái)家庭自制泡菜中，分離篩選廣譜抑菌的乳酸菌，并對(duì)其產(chǎn)抑菌物質(zhì)進(jìn)行研究，以期得到生產(chǎn)純菌乳酸菌發(fā)酵劑以及乳酸菌細(xì)菌素。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

泡菜：山東煙臺(tái)家庭自制；實(shí)驗(yàn)菌：本實(shí)驗(yàn)室從泡菜中分離得到1株有抑菌效果的植物乳桿菌菌株；指示菌：短小芽孢桿菌（CMCC 63202）、蠟樣芽孢桿菌（AS 1.1846）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、藤黃微球菌（CMCC 28001）、熒光假單胞菌（AS 3.6452）、大腸桿菌（ATCC 25922）6株菌株。

MRS培養(yǎng)基；乳酸菌分離培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加0.3%CaCO3。

指示菌培養(yǎng)基（NA）；PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基，PYG培養(yǎng)基：PY培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加10g葡萄糖。

精氨酸產(chǎn)氨培養(yǎng)基，葡萄糖/葡萄糖酸鹽產(chǎn)酸產(chǎn)氣培養(yǎng)基：PY培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加30g葡萄糖和0.5mL吐溫80；碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基：PY培養(yǎng)基基礎(chǔ)上分別添加一種碳水化合物；產(chǎn)硫化氫培養(yǎng)基。

1.1.2 主要試劑

BTB-MR試劑：溴百里酚藍(lán)（BTB）0.2g，甲基紅（MR）0.1g，95%乙醇300mL，蒸餾水200mL。

革蘭氏染色試劑盒產(chǎn)自杭州百思生物技術(shù)有限公司，細(xì)菌基因組提取試劑盒（Bacterial DNA Kit（200），OMEGA），引物序列為16SF：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇（P1）；16SR：5＇-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3＇（P2），TaqTMDNA聚合酶（TaKaRa），Gel Extraction Kit（TaKaRa），菌株DNA提取試劑盒：上海生物工程有限公司；化學(xué)試劑：均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

YXQ.SG41.280手提式壓力蒸汽滅菌鍋，TOMYSX-700全自動(dòng)高壓滅菌，SW-CJ-IBU超凈工作臺(tái)，RE-6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，BCD-215YD海爾冰箱，Orion 3STAR pH計(jì)，PYX-DHS-50X65隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化及保存

在無菌操作臺(tái)上，將泡菜與汁液混合均勻，用已滅菌過的生理鹽水，按照10倍稀釋法處理，選取10－4，10－5，10－6的稀釋濃度，分別涂布于MRS固體培養(yǎng)基，于30℃條件下培養(yǎng)2～3天；挑取單菌落，在乳酸菌分離培養(yǎng)基平板上，于30℃條件下培養(yǎng)2～3天；繼續(xù)觀察培養(yǎng)基，反復(fù)劃線篩選，挑取單菌落；將其轉(zhuǎn)移到MRS斜面上，做好標(biāo)記，于4℃條件下保存。

1.2.2 乳酸菌的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：參照微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［4］進(jìn)行，鏡檢、糖發(fā)酵等生理生化試驗(yàn)參考乳酸菌-生物學(xué)基礎(chǔ)及應(yīng)用［5］進(jìn)行。

接觸酶試驗(yàn)，乳酸菌屬過氧化氫酶陰性；菌株精氨酸產(chǎn)氨試驗(yàn)；菌株葡萄糖和葡萄糖酸鹽產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)；菌株產(chǎn)硫化氫能力檢測(cè)參考試驗(yàn)［6］進(jìn)行；菌株碳水化合物發(fā)酵試驗(yàn)，用BTB-MR指示劑檢測(cè)發(fā)酵液，觀察顏色反應(yīng)。

1.2.3 總DNA制備、PCR反應(yīng)擴(kuò)增、16SrDNA與序列分析、同源性比較

保藏的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基30℃靜置培養(yǎng)14h活化后，按照細(xì)菌基因組提取試劑盒［Bacterial DNA Kit（200），OMEGA］操作說明提取細(xì)菌總DNA。

16SrDNA分子鑒定，選用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，PCR擴(kuò)增引物，循環(huán)30次；72℃終延伸10min，4℃保存，并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。

PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳觀察，利用TaKaRa公司Gel Extraction Kit試劑盒割膠回收，由金斯瑞生物科技有限公司（南京）測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI上的GeneBank序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析，在非重復(fù)的GeneBank＋EMBI＋PDB基因庫(kù)中進(jìn)行同源性比較。

1.2.4 發(fā)酵上清液的抑菌試驗(yàn)

1.2.4.1 乳酸菌的產(chǎn)酸曲線與生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將經(jīng)活化的乳酸菌，接入液體MRS培養(yǎng)基中，于30℃條件下靜置培養(yǎng)，用分光光度計(jì)，選取波長(zhǎng)600nm，每隔3h測(cè)定液體培養(yǎng)基的吸光度值（OD值），同時(shí)并用pH計(jì)每隔3h測(cè)定1次pH值，連續(xù)測(cè)定54h，以不接種的液體MRS培養(yǎng)基作對(duì)照，以pH值和OD值分別為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制乳酸菌的產(chǎn)酸曲線與生長(zhǎng)曲線。

1.2.4.2 上清液的抑菌試驗(yàn)

取經(jīng)過12h培養(yǎng)活化的乳酸菌菌株3～5環(huán)接種于10mL滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，30℃條件下培養(yǎng)24h，取此培養(yǎng)液1mL接入100mL已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，30℃條件下培養(yǎng)48h，將發(fā)酵液裝入發(fā)酵液測(cè)定離心管，于4℃，在10000r/min下離心5min，獲得上清液。對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的6株指示菌株進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。打孔器公稱內(nèi)徑為6mm，故抑菌圈直徑大于6mm的視為具有抑菌性。同時(shí)用pH值4.5的乳酸和生理鹽水作對(duì)照。

1.2.4.3 上清液調(diào)節(jié)pH值后的抑菌試驗(yàn)

發(fā)酵液離心步驟同1.2.4.2，為提高效果，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上清液濃縮2倍，以短小芽孢桿菌（CMCC 63202）為指示菌，分別將上清液pH值調(diào)到4.5，5.0，5.5，用pH值為4.5的乳酸作對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)及個(gè)體形態(tài)

經(jīng)過初篩、復(fù)篩，挑選出1株抗菌作用強(qiáng)的菌株，該實(shí)驗(yàn)菌劃線接種于MRS培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48h，觀察該實(shí)驗(yàn)菌的菌落形態(tài)為圓形，呈白色，中間略有隆起，表面光滑，邊緣整齊，不透明，見圖1。

革蘭氏染色結(jié)果顯示為革蘭氏陽(yáng)性菌，呈桿狀或棒形，多數(shù)成對(duì)出現(xiàn)，見圖2。

圖2 革蘭氏染色Fig.2Gram staining

進(jìn)一步進(jìn)行芽孢染色和鞭毛染色實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)菌不生芽孢，無鞭毛，不運(yùn)動(dòng)，這一特征與革蘭氏陽(yáng)性、兼性厭氧桿菌的特征描述一致，從形態(tài)學(xué)特征判斷該株菌符合乳酸桿菌屬特征分離出乳酸菌的特性，見表1。

表1 分離出乳酸菌的特性Table 1The characteristics of isolated strains

表2 實(shí)驗(yàn)菌的生理生化特征及糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Table 2Physiological and biochemical properties and sugar fermentation results of tested lactic acid bacteria

根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》［7］及《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》［8］，該實(shí)驗(yàn)菌的一系列生理生化實(shí)驗(yàn)表明，過氧化氫酶試驗(yàn)為陰性，不產(chǎn)氣，不產(chǎn)H2S，不液化明膠，產(chǎn)酸，耐酸，能在40℃條件下生長(zhǎng)，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能水解精氨酸，無精氨酸水解酶，能利用乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸，但不能利用鼠李糖產(chǎn)酸，結(jié)合表1和表2，這些生理生化反應(yīng)與常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)可以初步鑒定該株菌為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）乳酸菌。

2.2 乳酸菌的產(chǎn)酸曲線與生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)菌的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線見圖3，該菌株的延滯期相對(duì)較長(zhǎng)，約為9h左右，說明其對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力不是太強(qiáng)。在菌株進(jìn)入平衡期后，可以大量產(chǎn)酸，產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，使發(fā)酵液的酸度急劇下降至pH值3.82，可以防止有害菌的繁殖。

圖3 乳酸菌的產(chǎn)酸曲線與生長(zhǎng)曲線Fig.3The curves of growth and acid-producing of the strain

2.3 16SrDNA擴(kuò)增、序列測(cè)定與構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

16SrDNA鑒定是目前被最常用來作為細(xì)菌鑒定的方法［9－11］。以該實(shí)驗(yàn)菌株的總DNA為模板，以細(xì)菌16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1300bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，并將所測(cè)定的序列從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast分析后發(fā)現(xiàn)，該實(shí)驗(yàn)菌株擴(kuò)增產(chǎn)物與植物乳桿菌亞種的菌株NR＿075041.1，NR＿104573.1，NR＿117813.1等5株菌相似性高達(dá)100%，而與其他菌株NR＿113338.1，NR＿115605.1，NR＿025447.1等10株菌種序列相似性則均在99%，對(duì)Blast結(jié)果中該菌株的89個(gè)近緣種群進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，將實(shí)驗(yàn)菌株命名為L(zhǎng)actobacillusplantarumQYL-1，見圖4，結(jié)果表明：其可歸屬于植物乳桿菌，且與植物乳酸桿菌亞種更為接近。

圖4 植物乳桿菌QYL-1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4The phylogenetic tree ofLactobacillusplantarumQYL-1

2.4 上清液的抑菌試驗(yàn)

通過對(duì)6種指示菌的抑菌實(shí)驗(yàn)可以看出，菌株LactobacillusplantarumQYL-1對(duì)短小芽孢桿菌（CMCC 63202）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、藤黃微球菌（CMCC 28001）、大腸桿菌（ATCC 25922）4株指示菌的抑菌效果較好，均超過孔徑的2倍，而其中對(duì)大腸桿菌（ATCC 25922）的抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)到18.38mm，達(dá)到打孔器直徑的3倍，見圖5。而對(duì)熒光假單胞菌（AS 3.6452），蠟樣芽孢桿菌（AS 1.1846）的抑菌效果相對(duì)較差，僅僅在8mm左右。本抑菌測(cè)試結(jié)果表明該細(xì)菌素具有較廣的抗菌譜。

圖5 上清液抑菌圈大小Fig.5The size of supernate inhibition zone

2.5 上清液調(diào)節(jié)pH值后的抑菌試驗(yàn)

將菌株LactobacillusplantarumQYL-1發(fā)酵上清液濃縮2倍，以此濃縮液分別調(diào)整出3個(gè)不同的pH值，以短小芽孢桿菌為指示菌做抑菌實(shí)驗(yàn)，由圖6可知，濃縮液pH值調(diào)整至4.5，其抑菌效果降低24.56%；pH值調(diào)整至5.0，其抑菌效果降低45.69%，下降明顯，pH值調(diào)整至5.5，其抑菌效果降低64.01%，下降最明顯，說明該菌株培養(yǎng)的上清液在酸性較強(qiáng)的環(huán)境中抑菌效果更好。

圖6 調(diào)整pH值后抑菌圈大小Fig.6The size of supernate inhibition zone after adjusting pH values

3 結(jié)論與討論

許多乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過程中，會(huì)產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸和過氧化氫，此外還能產(chǎn)生多種具有抑菌或殺菌生物活性的細(xì)菌素（bacteriocin），在抑制多種病原微生物和食物腐敗菌等方面具有重要的作用［12］。本研究從泡菜中分離得到1株優(yōu)良乳酸菌，并對(duì)其生理生化特性及抑菌特性進(jìn)行研究，運(yùn)用16SrDNA鑒定，在www.ncbi.nlm.nlh.gov網(wǎng)站中通過BLAST，在GENBANK＋EMBL＋DDBJ＋PDB基因庫(kù)中進(jìn)行同源性搜索，鑒定出實(shí)驗(yàn)菌株為植物乳桿菌，將該實(shí)驗(yàn)菌株命名為L(zhǎng)actobacillusplantarumQYL-1，并且利用mega5構(gòu)建出該菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹。生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果顯示：菌株Lactobacillus plantarumQYL-1具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，但其發(fā)酵延遲期較長(zhǎng)，產(chǎn)酸能力較強(qiáng)。抑菌試驗(yàn)顯示其發(fā)酵上清液能對(duì)短小芽孢桿菌（CMCC 63202）、蠟樣芽孢桿菌（AS 1.1846）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、藤黃微球菌（CMCC 28001）、熒光假單胞菌（AS 3.6452）、大腸桿菌（ATCC 25922）6株菌株，均有較好的抑菌活性，但具體抑菌物質(zhì)還需深入研究確定。該研究結(jié)果對(duì)于純種發(fā)酵以及乳酸菌的開發(fā)應(yīng)用具有一定的啟發(fā)和借鑒價(jià)值。

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Study on the Identification ofLactobacillusplantarumand Antimicrobial Activity of the Pickled Vegetable

QUAN Yong-liang
（Shandong Business Institute，Yantai 264670，China）

The bacteriocin-producing strain is isolated from Yantai home-made pickled vegetable.Through the morphological observation，physiological and biochemical characteristics and sequencing of 16SrDNA，the strain is identified to be a gram-positiveLactobacillusplantarumQYL-1.The results of antimicrobial test show that the supernatant could effectively inhibit the growth ofBacilluspumilus（CMCC 63202），Staphylococcusaureus（ATCC 25923），Micrococcusluteus（CMCC 28001）andEscherichiacoli（ATCC 25922），which indicates that it has broad-spectrum antibiotic activity.Therefore，the result could provide the reference value for development and application of the fermentation and antimicrobial activity of lactic acid bacteria.

pickled vegetable；Lactobacillusplantarum；antimicrobial activity

TS255.54

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.015

1000-9973（2017）03-0064-05

2016－09－13

山東省高等學(xué)校青年骨干教師國(guó)內(nèi)訪問學(xué)者項(xiàng)目

全永亮（1977－），男，山東菏澤人，副教授，碩士，研究方向：食品微生物。