屠李嬋+張逸風(fēng)+蘇平+胡添源+童宇茹+關(guān)紅雨+趙瑜君+張夏楠+袁媛+高偉+黃璐琦

[摘要]根據(jù)雷公藤懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)特異引物，采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)克隆雷公藤牻牛兒基焦磷酸合酶基因TwGPPS1，TwGPPS2 全長cDNA，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析和蛋白表達(dá)研究。首次克隆得到TwGPPS1核苷酸的完整開放閱讀框長度為1 278 bp，編碼425個(gè)氨基酸蛋白，預(yù)測蛋白等電點(diǎn)為668，相對分子質(zhì)量為47189 kDa；TwGPPS2核苷酸的完整開放閱讀框長度為1 269 bp，編碼422個(gè)氨基酸蛋白，預(yù)測蛋白等電點(diǎn)為671，相對分子質(zhì)量為46774 kDa；進(jìn)一步構(gòu)建了原核重組表達(dá)載體pET32aTwGPPS1，pET32aTwGPPS2，并成功誘導(dǎo)出TwGPPS1，TwGPPS2重組蛋白，為深入研究此關(guān)鍵酶基因功能和雷公藤萜類生物合成途徑奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]雷公藤； 牻牛兒基焦磷酸合酶； 克隆； 生物信息學(xué)分析； 蛋白表達(dá)

Cloning and protein expression analysis of geranyl diphosphate synthase

genes in Tripterygium wilfordii

TU Lichan1 ， ZHANG Yifeng1，2， SU Ping1，2， HU Tianyuan1， TONG Yuru1，2， GUAN Hongyu 1，2，

ZHAO Yujun2， ZHANG Xianan1， YUAN Yuan2*， GAO Wei1*， HUANG Luqi2

（ 1School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China；

2State Key Laboratory of Daodi Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica，

Chinese Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract]Based on the transcriptome data， the study cloned fulllength cDNA of TwGPPS1 and TwGPPS2 genes from Tripterygium wilfordii suspension cells and then analyzed the bioinformation of the sequence and protein expression The cloned TwGPPS1 has a 1 278 bp open reading frame （ORF） encoding a polypeptide of 425 amino acids The deduced isoelectric point （pI） was 668， a calculated molecular weight was about 47189 kDa. The fulllength cDNA of the TwGPPS2 contains a 1 269 bp open reading frame （ORF） encoding a polypeptide of 422 amino acids The deduced isoelectric point （pI） was 671， a calculated molecular weight was about 46774 kDaThe entire reading frame of TwGPPS1，2 was cloned into the pET32a（+） vector and expressed in E. coli BL21 （DE3） cells to obtain the TwGPPS protein， which laid a basis for further study on the regulation of terpenoid secondary metabolism and biological synthesis.

[Key words]Tripterygium wilfordii； geranyl diphosphate synthase； cloning； bioinformatics analysis； protein expression

雷公藤Tripterygium wilfordii Hook f為衛(wèi)矛科雷公藤屬木質(zhì)藤本植物。作為一種傳統(tǒng)中藥，其味辛、苦，性寒，化學(xué)成分復(fù)雜，具有祛風(fēng)除濕、消腫活血、通絡(luò)止痛、解毒殺蟲的功效，被廣泛用于治療腎小球腎炎、紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病及多種皮膚病，同時(shí)雷公藤也可作為農(nóng)藥用以殺蟲、毒鼠、滅螺等，是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)天然藥物之一[12]。現(xiàn)雷公藤已分離出200多種單體化合物，其中，具有生物活性的主要是倍半萜類（包括倍半萜生物堿類）、二萜類、及三萜類等化合物[3]。萜類作為其主要的活性成分，在植物中的含量較低，且由于雷公藤的過度開發(fā)利用，導(dǎo)致資源面臨枯竭[45]。

萜類共同前體異戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）和二甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）來源于胞質(zhì)內(nèi)的MVA（mevalonate）途徑與質(zhì)體內(nèi)的MEP（2CmethylDerythritol4phosphate）途徑。雷公藤牻牛兒基焦磷酸合酶（geranyl diphosphate synthase， GPPS）屬于短鏈異戊烯基合酶家族成員，可以催化1分子的IPP和1分子DMAPP縮合形成牻牛兒基焦磷酸（geranyl diphosphate，GPP），為單萜提供碳骨架。目前已從滇龍膽[6]、薄荷[78]、長春花[9]、金魚草[10]等植物中成功克隆得到。本研究克隆得到雷公藤萜類生物合成的關(guān)鍵酶基因TwGPPS1，TwGPPS2基因全長序列，為研究該基因功能以及探討雷公藤萜類次生代謝調(diào)控提供靶基因。

1材料

11植物雷公藤懸浮細(xì)胞，05 mg·L-1 2，4D+01 mg·L-1 KT+05 mg·L-1 IBA+MS液體培養(yǎng)基，25 ℃，120 r·min-1黑暗條件振蕩培養(yǎng)。

12菌株Escherichia coli Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

13載體表達(dá)載體pET32a（+） 由本實(shí)驗(yàn)室保存提供，pEASYT3 vector購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

14試劑和儀器BamHⅠHF，SacⅠHF，T4 DNA Ligase， PhusionHighFidelity PCR Master Mix with HF Buffer購自美國NEB公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、FastQuant RT Kit （with gDNase）、快速質(zhì)粒小提試劑盒、RNA 純化試劑盒購自天根生化科技（北京） 有限公司，IPTG（isopropylβDthiogalactoside），PMSF（phenylmethanesulfonyl fluoride）購自美國Sigma公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純，DYY6D型電腦三恒多用電泳儀為北京市六一儀器廠，凝膠成像分析系統(tǒng)，VeritiTM 96孔梯度PCR儀為美國Applied Biosystems公司、微量移液器為德國Eppendorf公司，引物合成及測序服務(wù)由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。

2方法

21雷公藤懸浮細(xì)胞總RNA的提取取新鮮雷公藤懸浮細(xì)胞用CTAB法提取總RNA，依據(jù)RNA純化試劑盒操作，進(jìn)行RNA的精制，采用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA的質(zhì)量。

22TwGPPS cDNA全長克隆根據(jù)雷公藤懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析并設(shè)計(jì)全長特異性引物，引物序列見表1。以提取的總RNA為模板，依據(jù)FastQuant RT Kit （With gDNase）說明書，將RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物在PCR儀上進(jìn)行全長PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：25 μL Phusion HF PCR（2×），25 μL Primer F（10 μmol·L-1），25 μL Primer R（10 μmol·L-1），1 μL cDNA模板，19 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：98 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)（98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s），72 ℃ 8 min。將獲得的PCR產(chǎn)物依據(jù)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書操作，進(jìn)行切膠回收，與pEASYT3 vector進(jìn)行TA連接，轉(zhuǎn)化至E coli Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞及陽性克隆PCR鑒定，根據(jù)測序結(jié)果，確定TwGPPS1，TwGPPS2的cDNA全長序列。

23TwGPPS基因的生物信息學(xué)分析采用InterPro在線軟件（http：// wwwebiacuk /Tools/InterProScan）進(jìn)行結(jié)構(gòu)域比對，ExPAS ProtParam tool（http：//webexpasyorg/protparam/）預(yù)測蛋白性質(zhì)，TargetP11 server （http：//wwwcbsdtudk/services/TargetP/）進(jìn)行信號肽分析，Psort（http：//psorthgcjp/）及Wolfpsort（http：//wolfpsortorg/）分析亞細(xì)胞定位，TRMHMM server v20 （http：//wwwcbsdtudk/services/TMHMM20/）進(jìn)行跨膜域分析，PRABIGERLAND（https：//npsaprabiibcpfr/）進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，SWISSMODEL（http：//swissmodelexpasyorg/） 進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析和結(jié)構(gòu)域的三維同源建模。使用DNAMAN軟件對序列進(jìn)行多重比對，根據(jù)同源比對結(jié)果用MEGA 50軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

24原核表達(dá)載體構(gòu)建以含有雷公藤牻牛兒基焦磷酸合酶基因全長cDNA的載體pEASYT3TwGPPS1，pEASYT3TwGPPS2質(zhì)粒為模板，用含SacⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增基因編碼區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行膠回收。經(jīng)純化后的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，采用NEB公司T4 DNA 連接酶定向連入經(jīng)相同雙酶切的表達(dá)載體pET32a（+） 中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E coli Trans 5α、菌落篩選及陽性克隆的初步篩選后送樣測序鑒定。

25重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)將酶切鑒定正確且經(jīng)測序驗(yàn)證的含目的基因的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，涂布LB+Amp固體平板，37 ℃黑暗倒置培養(yǎng)12～16 h，挑取單克隆菌落經(jīng)陽性鑒定后轉(zhuǎn)到含100 mg·L-1 Amp的LB液體培養(yǎng)基中，加入一定量IPTG誘導(dǎo)劑（終濃度為1 mmol·L-1），低溫下（16 ℃）誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h，4 ℃ 9 000×g離心30 min 收獲菌體，-80 ℃冷凍保存。用預(yù)冷的6 mL 1×PBS緩沖液（含2 mmol·L-1 DTT） 重懸；置冰浴中超聲破菌；大腸桿菌破碎液在4 ℃，9 000×g離心2次，分離上清和沉淀；進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（SDSPAGE）凝膠電泳檢測，以空質(zhì)粒表達(dá)載體pET32a轉(zhuǎn)化BL21（DE3）表達(dá)菌進(jìn)行表達(dá)為對照。

3結(jié)果

31雷公藤TwGPPS1，2全長克隆以雷公藤的cDNA為模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增、凝膠電泳檢測的產(chǎn)物條帶片段長度在1 200 bp左右，與預(yù)期的目的條帶長度相符合。經(jīng)測序后，表明TwGPPS1長度為1 278 bp，TwGPPS2長度為1 269 bp，見圖1。

32TwGPPS1，2序列同源性比對及結(jié)構(gòu)域分析TwGPPS1的核苷酸的完整開放閱讀框?yàn)? 278 bp，編碼425個(gè)氨基酸蛋白，TwGPPS2的核苷酸的完整

MDNA Marker （2 kb）；1，2TwGPPS1，TwGPPS2全長PCR產(chǎn)物。

開放閱讀框?yàn)? 269 bp，編碼422個(gè)氨基酸蛋白。TwGPPS1，2 Blast結(jié)果見表2。InterproScan進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，預(yù)測 TwGPPS1，2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，TwGPPS1，2具有聚丙烯合成酶（polyprenyl synthetase）、類異戊二烯合成酶（isoprenoid synthase domain）、聚丙烯相關(guān)合成酶 （polyprenyl synthetaserelated）。將TwGPPS1，2與9種其他植物GPPS氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對，結(jié)果表明TwGPPS1，2蛋白與已知蛋白序列同源性高達(dá)7858%，見圖2。

33TwGPPS1，2氨基酸序列的分子系統(tǒng)進(jìn)化分析將TwGPPS1，TwGPPS2與GenBank 中的8種蛋白進(jìn)行比對分析，在軟件 MEGA 50平臺上采用相鄰連接法構(gòu)建GPPS家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹，見圖3。氨基酸進(jìn)化樹分析表明，TwGPPS1與TwGPPS2處在同一分支上，與雷蒙德氏棉Gossypium raimondii、大豆Glycine max、毛果楊Populus trichocarpa、芒果Mangifera indica、克萊門柚Citrus clementina聚為一類，親緣較近。與裸子植物北美冷杉Abies grandis親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

34TwGPPS1，2理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位及3D結(jié)構(gòu)預(yù)測①TwGPPS1：利用 ProtParam工具，TwGPPS1編碼氨基酸的理化性質(zhì)，結(jié)果TwGPPS1 相對分子質(zhì)量為47 1890、理論等電點(diǎn)為668，分子式為C2079H3345N587O630S17，總原子數(shù)為6 658，TwGPPS1氨基酸組成中 Leu 所占比例最高為120%，trp 所占比例最低為 05%，TwGPPS1不穩(wěn)定指數(shù)為 3690，脂肪指數(shù)為 9593，TwGPPS1蛋白穩(wěn)定。TwGPPS1

基因品名相似度/%序列號TwGPPS1雷蒙德氏棉Gossypium raimondii85KJB698781大豆Glycine max 82XP_0066009301毛果楊Populus trichocarpa82XP_0023083602印楝Azadirachta indica80AIG154481克萊門柚Citrus clementina 80XP_0064489891TwGPPS2雷蒙德氏棉G. raimondii81XP_0124537881大豆G. max81XP_0066009301毛果楊P. trichocarpa 79XP_0023083602克萊門柚C. clementina78XP_0064489891印楝A. indica78AIG154481

全長cDNA序列編碼的氨基酸為非分泌蛋白，信號肽分析表明無信號肽，跨膜域分析表明為非膜蛋白。對TwGPPS1蛋白進(jìn)行親/疏水性預(yù)測表明該蛋白為親水性蛋白。采用PSORT Ⅱ Prediction進(jìn)行亞細(xì)胞定位，TwGPPS1蛋白序列定位在胞質(zhì)中。TwGPPS1蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，無規(guī)則卷曲和α螺旋結(jié)構(gòu)是其主要結(jié)構(gòu)原件，α螺旋結(jié)構(gòu)為主占5388%，其次為無規(guī)則卷曲占3953%，β轉(zhuǎn)角占659%。三維同源模型見圖4（A），其三維同源模型以3apz1A蛋白為模板， 用于建立該模型的氨基酸殘基范圍為85～425位，序列同源性為7925%。②TwGPPS2：利用 ProtParam工具，TwGPPS2編碼氨基酸的理化性質(zhì)，結(jié)果TwGPPS2 相對分子質(zhì)量為46 7736、理論等電點(diǎn)為671，分子式為C2064H3316N586O618S17，總原子數(shù)為6 601，TwGPPS2氨基酸組成中 Leu 所占比例最高為126%，trp 所占比例最低為06%。TwGPPS2不穩(wěn)定指數(shù)為3701，脂肪指數(shù)為9941，TwGPPS2蛋白穩(wěn)定。TwGPPS2全長cDNA序列編碼的氨基酸為非分泌蛋白，信號肽分析表明無信號肽，跨膜域分析表明為非膜蛋白。對TwGPPS2蛋白進(jìn)行親/疏水性預(yù)測表明該蛋白為親水性蛋白。采用PSORT Ⅱ Prediction進(jìn)行亞細(xì)胞定位，TwGPPS2蛋白序列定位在線粒體中。TwGPPS2蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，無規(guī)則卷曲和α螺旋結(jié)構(gòu)是其主要結(jié)構(gòu)原件，α螺旋結(jié)構(gòu)為主占5664%，其次為無規(guī)則卷曲占3602%，β轉(zhuǎn)角占735%。三維同源模型見圖4（B），其三維同源模型以3aq02A蛋白為模板， 用于建立該模型的氨基酸殘基范圍為82～422位，序列同源性為7781%。

35TwGPPS1，2原核表達(dá)載體構(gòu)建對重組質(zhì)粒見圖5，pET32aTwGPPS1，pET32aTwGPPS2進(jìn)行測序分析，結(jié)果表明，插入表達(dá)載體中的片段與目的序列一致，證明成功構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET32aTwGPPS1，pET32aTwGPPS2。

36TwGPPS1，2重組蛋白表達(dá)將成功構(gòu)建的pET32aTwGPPS1和pET32aTwGPPS2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌Ecoli BL21（DE3），挑取單克隆菌落于LB（100 mg·L-1 Amp）液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待菌液A600為06～08 時(shí)，在16 ℃，1 mmol·L-1 IPTG，170 r·min-1條件下培養(yǎng)12 h后，對誘導(dǎo)前后的大腸桿菌總蛋白進(jìn)行SDSPAGE分析。含pET32aTwGPPS1，2質(zhì)粒的表達(dá)菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在約58 kDa處出現(xiàn)誘導(dǎo)蛋白條帶，而pET32a載體菌株在相應(yīng)位置無蛋白表達(dá)見圖6。經(jīng)驗(yàn)證，58 kDa大小符合TwGPPS1，2與pET32a載體融合蛋白，該處為TwGPPS1，2重組蛋白目的條帶。結(jié)果表明，TwGPPS1，2蛋白成功在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)。

4討論

目前，對牻牛兒基焦磷酸合酶研究較少，僅有少數(shù)對牻牛兒基焦磷酸合酶的功能進(jìn)行研究[1113]。本研究在雷公藤懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，通過設(shè)計(jì)全長特異引物，從雷公藤中克隆得到長度為1 278 bp的TwGPPS1完整ORF cDNA序列和長度為1 269 bp的TwGPPS2完整ORF cDNA序列。TwGPPS1，2與雷蒙德氏棉具有較高相似性，經(jīng)預(yù)測，均具有聚丙烯合成酶、類異戊二烯合成酶、聚丙

進(jìn)行多重比對的氨基酸序列為：TwGPPS1，TwGPPS2，Gossypium raimondii（KJB698781），Glycine max（gKRH580111），Populus trichocarpa（XP_0023083602），Citrus sinensis（KDO753891），C unshiu（AAN860611），Theobroma cacao（XP_0070249791），Quercus robur（CAC208521），Medicago truncatula（XP_0134574801），G. soja（KHN214171）。

烯相關(guān)合成酶結(jié)構(gòu)域，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示2條基因聚為一支，具有較大同源性。本研究成功構(gòu)建了原核重組表達(dá)載體pET32aTwGPPS1，pET32aTwGPPS2，并成功誘導(dǎo)出TwGPPS1，TwGPPS2重組蛋白。

MMarker；1誘導(dǎo)后pET32a菌體；2誘導(dǎo)后pET32a上清；3未誘導(dǎo)pET32aTwGPPS1菌體；4誘導(dǎo)后pET32aTwGPPS1菌體；5誘導(dǎo)后pET32aTwGPPS1菌體上清；6誘導(dǎo)后pET32aTwGPPS1菌體沉淀；7未誘導(dǎo)的pET32aTwGPPS2菌體；8誘導(dǎo)后pET32aTwGPPS2菌體；9誘導(dǎo)后pET32aTwGPPS2菌體上清；10誘導(dǎo)后pET32aTwGPPS2菌體沉淀。

成功獲得了可溶性蛋白，但其表達(dá)量較少，為進(jìn)一步提高可溶性蛋白含量，實(shí)驗(yàn)中還成功構(gòu)建了pMALc2XTwGPPS1， pMALc2XTwGPPS2原核重組表達(dá)載體，經(jīng)SDSPAGE檢測可溶性蛋白表達(dá)量并未顯著提升，其原因仍需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)為深入研究雷公藤牻牛兒基焦磷酸合酶基因功能和雷公藤萜類生物合成途徑奠定基礎(chǔ)，為雷公藤基因資源的保護(hù)和合理利用提供參考。

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[責(zé)任編輯呂冬梅]

[收稿日期]20160626

[基金項(xiàng)目]北京高等學(xué)校高水平人才交叉培養(yǎng)“實(shí)培計(jì)劃”項(xiàng)目；國家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81422053）

[通信作者]*高偉，教授，Tel：（010）83911633，Email： weigao@ccmueducn； *袁媛，研究員， Email：y_yuan0732@163com

[作者簡介]屠李嬋，Tel： （010）83911633，Email：tulichan@163com