雷公藤屬植物物種間的化學(xué)成分差異性研究

陳一龍+劉翔+瞿顯友+姚媛媛+勵(lì)娜+梁旭明+張渝渝+楊大堅(jiān)+張小梅

[摘要]以主成分分析（PCA）和方差分析法（ANOVA）研究雷公藤屬植物化學(xué)成分的含量與物種相關(guān)性，并比較3個(gè)物種間的差異。采用PF6離子液體超聲輔助萃取，HPLC法測定28批雷公藤屬植物中雷公藤晉堿、雷公藤堿庚、雷酚內(nèi)酯、雷公藤次堿、雷公藤醌A、雷公藤甲素、雷公藤紅素、兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素和沒食子兒茶素11個(gè)成分的含量，并進(jìn)行主成分分析（PCA）、偏最小二乘法（PLS）和方差分析（ANOVA）。結(jié)果顯示，雷公藤屬植物3個(gè)物種中11個(gè)化學(xué)成分的含量測定結(jié)果在PCA和PLS分析結(jié)果中分別聚集在3個(gè)區(qū)域，其中雷公藤醌A是影響3個(gè)物種分別聚集的最大因素；而且11個(gè)化學(xué)成分的含量在3個(gè)物種間有顯著性差異（P<0000 1），表明化學(xué)成分與物種的分類有一定的相關(guān)性，3個(gè)物種間化學(xué)成分含量差異明顯。該實(shí)驗(yàn)含量測定方法快速準(zhǔn)確，分析方法簡單方便，為雷公藤屬植物的物種分類、藥效和毒性研究等提供參考。

[關(guān)鍵詞]雷公藤屬； 化學(xué)成分； 含量測定； 主成分分析； 偏最小二乘法； 方差分析； 差異性

Studies on difference of chemical compositions in plant

species of Tripterygium genus

CHEN Yilong， LIU Xiang， QU Xianyou， YAO Yuanyuan， LI Na， LIANG Xuming，

ZHANG Yuyu， YANG Dajian*， ZHANG Xiaomei*

（Chongqing Academy of Chinese Traditional Materia Medica， Chongqing 400065， China）

[Abstract]We studied the content of chemical compositions and correlation among species of Tripterygium genus by principal component analysis（PCA） and variance analysis（ANOVA）， and we also studied the difference among the 3 speciesUsing PF6 ionic liquidbased ultrasonicassisted extraction， we determined the contents of 11 compounds including wilforgine， wilforzine， triptophenolide， wilforine， triptoquinone A， triptolide， tripterin， egallocatechin， epigallocatechin， catechin， and epicatechin in 28 batches of the Tripterygium species by HPLC and PCA Partial least squares analysis （PLS） and ANOVA were also performed to verify the resultsThe analysis results of PCA and PLS showed that three species of Tripterygium genus were clustered into three regions respectively， and triptoquinone A was the important factor which affected the aggregation of these three speciesThere was a significant difference among the contents of 11 chemical components in the three species（P<0000 1）These results indicated that there was a certain correlation between the chemical compositions and the classification of the species， and the difference of the chemical compositions among the three species was obvious In this work， the content determination method is rapid and accurate， and the analysis method is simple and convenient， which provides a reference for the classification， the efficacy and the toxicity of the species

[Key words]Tripterygium genus plants； chemical compositions； content determination； principal component analysis； partial least squares analysis； variance analysis； difference

雷公藤屬植物系衛(wèi)矛科植物，中國雷公藤全屬有3個(gè)種雷公藤Tripterygium wilfordii Hook、昆明山海棠T hypoglaucum（Levl） Hutch和東北雷公藤T regelii Sprague et Takeda 3個(gè)物種[1]，作為傳統(tǒng)中藥材，有著悠久的沿用歷史，具有祛風(fēng)除濕，活血通絡(luò)，消腫止痛等功效，廣泛用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等自身免疫性疾病。該屬植物在分類學(xué)上一直存在一定的爭議，修訂版《Flora of China》將上述3個(gè)種合并為雷公藤T wilfordii [2]，劉萬水等[3]通過RAPD分析發(fā)現(xiàn)雷公藤與昆明山海棠的種間界限模糊，Sue KaYee[4]通過 ITS 和 5S rDNA序列表明雷公藤與昆明山海棠區(qū)分不明顯；劉超[56]發(fā)現(xiàn)雷公藤和昆明山海棠根和葉的代謝產(chǎn)物差異顯著，呈地方區(qū)域性不同。而在毒性研究[78]結(jié)果中同樣差異顯著，表明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)有一定的差異。

雷公藤屬植物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究主要集中在生物堿和萜類，黃酮類研究較少。本文采用離子液體超聲輔助HPLC法同時(shí)測定28個(gè)產(chǎn)地雷公藤屬植物中黃酮類成分沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素和表兒茶素的含量，測定生物堿、萜類和內(nèi)酯類成分雷公藤晉堿、雷公藤堿庚、雷酚內(nèi)酯、雷公藤次堿、雷公藤醌A、雷公藤甲素和雷公藤紅素的含量，并通過PCA，PLS和方差分析等方法分析雷公藤屬植物3個(gè)物種化學(xué)成分上的差異，以期在化學(xué)成分方面為雷公藤屬植物的分類、研究和臨床應(yīng)用等提供依據(jù)。

1材料

島津HPLC LC30A高效液相色譜儀，AEG45SM電子天平（1/10萬，日本島津公司），BP121S（1/1萬）[ 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司 ]。KQ250DB型數(shù)控超聲波清洗器（功率250 W，頻率40 kHz，鞏義市予華儀器有限公司），BJ100多功能粉碎機(jī)（德清拜杰電器有限公司），HHS24恒溫水浴鍋水浴鍋（金壇梅香儀器有限公司）；沒食子兒茶素（批號FY10540924），表沒食子兒茶素（批號FY10510801），兒茶素（批號FY10480928），純度≥980%，均由成都普菲德生物科技有限公司提供，表兒茶素（批號14082007），雷公藤紅素（批號14000508），雷公藤甲素（批號14110509），純度≥980%，均由南京景竹生物科技有限公司提供。1丁基3甲基咪唑溴鹽（Br，純度≥99%），1丁基3甲基咪唑四氟硼酸鹽（BF4，純度≥99%），1丁基3甲基咪唑六氟磷酸鹽（PF6，純度≥99%），1己基3甲基咪唑四氟硼酸鹽（[HMIm]BF4，純度≥99%），1己基3甲基咪唑六氟磷酸鹽（[HMIm]PF4，純度≥99%），1辛基3甲基咪唑四氟硼酸鹽（[OMIm]BF4，純度≥99%），均由中科院蘭州化學(xué)物理研究所提供。乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純（重慶川東化工集團(tuán)化學(xué)試劑廠）。

本實(shí)驗(yàn)所用藥材由重慶市中藥院生藥研究所野外采集，經(jīng)重慶市中藥研究院瞿顯友研究員鑒定為雷公藤T wilfordii、昆明山海棠T hypoglaucum和東北雷公藤T regelii 的干燥根。

2方法與結(jié)果

21色譜條件的建立色譜柱Inertsil ODS4（46 mm×250 mm，3 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）01%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～35 min，8%～10% A；35～47 min，10%～20% A；47～60 min，20% A；60～65 min，20%～10% A）；檢測波長210 nm；柱溫30 ℃；流速075 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL；對照品、樣品及空白樣品色譜圖（沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素和表兒茶素），見圖1。

色譜柱Inertsil ODS4（46 mm×250 mm，3 μm）；流動(dòng)相乙腈1%磷酸水溶液（30∶70）洗脫，流速075 mL·min-1；檢測波長220 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。雷公藤甲素對照品、樣品及空白樣品色譜圖（雷公藤甲素），見圖2。

陳一龍等：雷公藤屬植物物種間的化學(xué)成分差異性研究

本文中雷公藤晉堿、雷公藤堿庚、雷酚內(nèi)酯、雷公藤次堿、雷公藤醌A和雷公藤紅素的含量采用離子液體超聲輔助HPLC測定[911]。

22對照品溶液的制備分別精密稱取沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素和表兒茶素適量，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得，含沒食子兒茶素對照品0010 7 g·L-1、表沒食子兒茶素對照品0023 0 g·L-1、兒茶素對照品0005 8 g·L-1和表兒茶素對照品0021 4 g·L-1的混合溶液；精密稱取雷公藤甲素適量，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得含甲素0064 4 g· L-1的對照品溶液。

23供試品溶液的制備取昆明山海棠粉末（過3號篩）05 g，精密稱定，置于具塞離心試管中，精密加入06 mol·L-1 PF6乙酸乙酯溶液2 mL，超聲萃取30 min，乙酸乙酯補(bǔ)足初重，離心5 min（12 000 r·min-1），上清液微孔濾膜濾過，即得（沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素和雷公藤甲素）。

24線性關(guān)系的考察分別精密吸取混合對照品溶液1，5，8，10，15，20，25 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積[1214]。分別以沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素和表兒茶素的含量（μg）為橫坐標(biāo)（X）、峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行回歸，同時(shí)測定各待測物的定量限（S/N=10）和檢測限（S/N=3），回歸方程及線性關(guān)系見表1（沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素和表兒茶素）。

分別精密吸取雷公藤甲素對照品溶液1，5，8，10，15，20，25 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積。以雷公藤甲素的含量（μg）為橫坐標(biāo)（X）、峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，同時(shí)測定待測物的定量限（S/N=10）和檢測限（S/N=3），得到回歸方程及線性關(guān)系見表1（雷公藤甲素）。

25精密度試驗(yàn)精密吸取同一沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素和表兒茶素混合對照品溶液，雷公藤甲素對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算RSD。沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素和雷公藤甲素的RSD依次為070%，14%，14%，16%，040%，表明儀器具有較好的精密度。

26穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取對照品溶液和重復(fù)性考察項(xiàng)下的樣品溶液各10 μL，分別在0，2，4，8，12，24，48 h進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果，對照

品中沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素和雷公藤甲素的RSD依次為25%，23%，12%，23%，097%；樣品中沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素和雷公藤甲素含量的RSD依次為29%，15%，30%，19%，14%，表明對照品溶液和供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

27重復(fù)性試驗(yàn)按擬定方法制備樣品，取樣品約05 g，共12份（6份1組，共2組），精密稱定，按擬定測定方法測定峰面積，計(jì)算含量和RSD，結(jié)果沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素和雷公藤甲素的RSD依次為12%，14%，18%，14%，22%，6份樣品測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于3%，表明本法具有較好的重復(fù)性。

28加樣回收率試驗(yàn)取昆明山海棠粉末（約025 g/份），精密稱定，精密加入沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素和雷公藤甲素混合對照品溶液適量（3種不同水平，各3份），分別加入含量相當(dāng)量的50%，100%，150%，測定含量，計(jì)算回收率，沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素和雷公藤甲素的平均回收率分別為1008%，1002%，1000%，9962%，1005%；RSD分別為19%，22%，20%，11%，19%。

29供試品含量測定按23項(xiàng)下的制備方法制備供試溶液，按21項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算含量，以及雷公藤晉堿、雷公藤堿庚、雷酚內(nèi)酯、雷公藤次堿、雷公藤醌A和雷公藤紅素含量[911]見表2。

210統(tǒng)計(jì)學(xué)分析雷公藤屬3個(gè)物種化學(xué)成分含

量數(shù)據(jù)導(dǎo)入Graphpad Prism進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并方差分析見表3。結(jié)果顯示，11個(gè)化學(xué)成分含量在物種上有顯著性差異，P<0000 1。單個(gè)成分東北雷公藤與雷公藤的雷公藤晉堿、雷公藤醌A和雷公藤紅素單個(gè)成分含量有顯著性差異，P<0005；東北雷公藤與昆明山海棠的雷公藤紅素和表兒茶素單個(gè)成分含量有顯著性差異，P<0005見圖3。

211化學(xué)模式識(shí)別法分析雷公藤屬3個(gè)物種化

學(xué)成分含量主成分分析得分圖顯示見圖4，前2個(gè)主成分貢獻(xiàn)率為60%（PC1=36%，PC2=24%），3個(gè)品種聚集密集程度相似，雷公藤和東北雷公藤分別聚在一起，昆明山海棠大部分聚在一起，昆明山海棠樣品V18和V19與雷公藤更接近，V6樣品偏離較大，可能是該樣品采集地海拔明顯高于其他產(chǎn)地的原因。

雷公藤屬3個(gè)品種化學(xué)成分含量數(shù)據(jù)PLSDA分析，參數(shù)為R2X=267%，R2Y=301%，Q2=25%，昆明山海棠、雷公藤和東北雷公藤分成3個(gè)聚集區(qū)，雷公藤和東北雷公藤相對昆明山海棠聚集的更密集，昆明山海棠聚集的相對松散，見圖5。載荷圖顯示對其分類影響最大的成分是雷公藤醌A，見圖6。

3討論

31離子液體溶液可以有效提高中藥待測成分的提取率前期研究考察了離子液體的種類、離子液體濃度、固液比、分散劑、提取方式、提取時(shí)間和不同粉碎度等方法，表明加離子液體的溶液提取率高于相應(yīng)的不加離子液體溶劑，其中離子液體PF6的提取效率最高。

PF6溶液提取雷公藤晉堿、雷公藤堿庚、雷酚內(nèi)酯、雷公藤次堿、雷公藤醌A和雷公藤紅素6個(gè)成分比相應(yīng)的單純?nèi)軇┨崛〉馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)分別高出1047%，831%，288%，1418%，111%，810%[910]。同時(shí)離子液體PF6乙酸乙酯溶液提取雷公藤甲素、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素和表兒茶素5個(gè)成分的含量比單純用乙酸乙酯提取分別高570%，430%，670%，830%，420%[11]見表4。采用離子液體結(jié)合超聲波提取法可以有效的提取昆明山海棠中11種活性成分，該方法穩(wěn)定、簡單、綠色環(huán)保。

32化學(xué)模式識(shí)別法和統(tǒng)計(jì)分析雷公藤屬植物的差異PCA得分圖中雷公藤屬植物3個(gè)物種分布在3個(gè)區(qū)域，PLS載荷圖顯示雷公藤醌A為影響3個(gè)物種聚類的最大因素。這與方差分析結(jié)果相同，說明雷公藤屬植物在11個(gè)成分方面有一定差異。

昆明山海棠樣品中除了V6偏離太遠(yuǎn)，V1～13樣品聚集在一個(gè)范圍，其產(chǎn)地為四川、貴州與云南；V14～17號樣品聚集在另一個(gè)范圍，產(chǎn)地為湖南重慶。樣品V18 和V19與典型的雷公藤更接近，典型的雷公藤和昆明山海棠樣品則各自聚集在一起，呈現(xiàn)區(qū)域性聚集。得分圖的下面部分為昆明山海棠，上面部分為雷公藤，同樣呈現(xiàn)一個(gè)漸變的趨勢，與產(chǎn)地從西部到東部的變化相似。

雷公藤屬3個(gè)物種的含量測定結(jié)果方差分析顯示雷公藤與昆明山海棠的單個(gè)成分未表現(xiàn)出顯著性差異，但是東北雷公藤與雷公藤的雷公藤晉堿、雷公藤醌A和雷公藤紅素單個(gè)成分含量差異顯著，P<0005，東北雷公藤與昆明山海棠的雷公藤紅素和表兒茶素單個(gè)成分含量差異顯著，P<0005。這與文獻(xiàn)報(bào)道的東北雷公藤可以作為一個(gè)獨(dú)立的物種，雷公藤和昆明山海棠之間的區(qū)分不明顯結(jié)果一致。而11個(gè)成分則在雷公藤屬植物中有顯著性差異，P<0000 1，說明雷公藤3個(gè)物種中單一成分無明顯差異，但物種間化學(xué)成分整體上有顯著差異。

33雷公藤屬植物分類學(xué)爭議雷公藤屬植物在分類學(xué)上一直存在爭議，《中國植物志》的中英文版分別將該屬植物分為了3個(gè)種和1個(gè)種。文獻(xiàn)報(bào)道[34，15]顯示，從遺傳分類角度分析，存在大量的中間類型，使種間界限模糊；化學(xué)角度分析發(fā)現(xiàn)根和葉的代謝產(chǎn)物差異顯著[56]；毒性角度分析[78]發(fā)現(xiàn)昆明山海棠乙醇提取液的毒性小于雷公藤乙醇提取液。昆明山海棠和雷公藤乙醇提取液的LD50分別為3484，1631 g·kg-1，毒性差異較大，同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道毒性成分即為有效成分[16]，這就導(dǎo)致在藥用生產(chǎn)時(shí)，若兩者混用，藥材來源為昆明山海棠，以雷公藤入藥會(huì)造成毒性過大，增加安全隱患，相反，藥材來源為雷公藤，以昆明山海棠入藥則可能使耐用雷公藤制劑的患者治療的療效降低甚至無效[17]。

雷公藤與昆明山海棠的形態(tài)變異具有連續(xù)性，存在大量的中間類型，連接了這2個(gè)種物，導(dǎo)致種間界限模糊，但雷公藤與昆明山海棠作為藥用植物，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)有一定差異，其毒性差異較大，而東北雷公藤尚無藥用歷史，從藥用歷史、臨床不良反應(yīng)和臨床的產(chǎn)品應(yīng)用上，為保證臨床上雷公藤類制劑的安全有效，建議3個(gè)種在藥用基源上分列3個(gè)種。

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[責(zé)任編輯丁廣治]

[收稿日期]20160720

[基金項(xiàng)目]重慶市集成示范計(jì)劃（重大）項(xiàng)目（cstc2013jcsf10011）；重慶市科委應(yīng)用開發(fā)計(jì)劃（重大）項(xiàng)目（cstc2014yykfC10005）；重慶市青年科技人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（cstc2014kjrcqnrc10006）；重慶市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)中醫(yī)藥科技項(xiàng)目（zy201601011）

[通信作者]*楊大堅(jiān)，博士，研究員，主要從事中藥品種及品質(zhì)研究工作，Tel：（028）89029081，Email：yangdajian@foxmailcom； *張小梅，博士，副研究員，主要從事中藥新藥開發(fā)及物質(zhì)基礎(chǔ)研究工作，Email：605050963@qqcom