張黃琴+嚴輝+錢大瑋+朱振華+郭盛+郭蘭萍+唐志書+段金廒

[摘要]該研究采用UPLCTQMS聯(lián)用技術(shù)，對百合中8種成分進行分析測定。35個批次百合藥材中王百合苷E、王百合苷F、王百合苷C及王百合苷B的質(zhì)量分數(shù)分別在0604 0×10-1～1862×10-1，0680 0×10-2～4475×10-2，0700 0×10-3～2965×10-1，0170 0×10-1～4724 mg·g-1；綠原酸、咖啡酸、原兒茶醛及阿魏酸的質(zhì)量分數(shù)分別在6827×10-3～1607×10-3，0111 0×104～7971×10-3，0593 7×10-3～2962×10-3，2606×10-2～4589×10-2 mg·g-1。進行主成分分析，繪制PCA（principal components analysis）得分圖及VIP圖，35批百合藥材被分成以產(chǎn)地為區(qū)分的2組，2個主產(chǎn)地百合樣品中，阿魏酸和咖啡酸在2個產(chǎn)地的百合中含量差異較大，其他6種成分含量在兩產(chǎn)地間相差較小。通過主成分分析的F綜合評分，可將樣品進行排序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在綜合排名的前10位，有8種百合為安徽霍山百合。建立基于的UPLCTQMS用于百合多指標(biāo)的質(zhì)量評價方法，具有準確、高效、便捷等優(yōu)點，為百合藥材質(zhì)量控制提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]百合； 含量測定； UPLCTQMS； 主成分分析； 相關(guān)性分析

Analysis and evaluation of eight active ingredients in

Lilium lancifolium from different regions

ZHANG Huangqin1， YAN Hui1， QIAN Dawei1*， ZHU Zhenhua1， GUO Sheng1，

GUO Lanping2， TANG Zhishu3， DUAN Jinao1

（1Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization， National and Local Collaborative

Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine， Nanjing University of

Chinese Medicine， Nanjing 210023， China；

2State Key Laboratory Breeding Base of Daodi Herbs， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

3Shanxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization， Shanxi University of Chinese Medicine，

Xianyang 712083， China）

[Abstract]This study established a rapid UPLCTQMS/MS method for determination of eight active ingredients in Lilium lancifolium The contents range of regaloside E， F， C and B are as follows： 0604 0×10-11862×10-1， 0680 0×10-24475×10-2， 0700 0×10-32965×10-1， 0170 0×10-14724 mg·g-1； the contents of chlorogenic acid， caffeic acid， protocatechualdehyde and ferulic acid， within the range of 6827×10-31607×10-3， 0011 1×10-37971×10-3， 0593 7×10-32962×10-3， 2606×10-24589×10-2 mg·g-1， respectively According to PCA （principal components analysis） plotting， 35 batches can be divided into two categories， namely Anhui Huoshan and Hunan Longshan The main different elements between these two categories are caffeic acid and ferulic acid according to the VIP （variable importance in the projection） points figure Based on comprehensive principal component values， there are eight batches of L lancifolium from Huoshan among the comprehensive ranking of ten The UPLCTQMS method for simultaneous analysis of eight active ingredients is accurate， efficient and convenient. This result can provide scientific basis for quality control of L lancifolium

[Key Words]Lilium lancifolium； determination； UPLCTQMS； principal components analysis； correlation analysis

百合藥材為百合科植物卷丹Lilium lancifolium Thunb、百合L brownii F E Brown var viridulum Baker或細葉百合L pumilum DC的干燥肉質(zhì)鱗葉[1]。其味甘，性寒，有養(yǎng)陰潤肺、清心安神、止咳祛痰之功。用于治療陰虛燥咳、勞嗽咳血、肺癰、老年人慢性支氣管炎、神經(jīng)衰弱、失眠心悸、精神恍惚等癥[23]?，F(xiàn)代研究表明，百合含酚性甘油酯類、有機酸類、生物堿類、甾體皂苷類和黃酮類等活性成分，其中酚性甘油酯類化合物，包括王百合苷E、王百合苷F、王百合苷C、王百合苷B、1O阿魏酰甘油等，具有抗氧化、抗腫瘤、抗增殖、免疫調(diào)節(jié)等作用[46]。目前有關(guān)百合中有效成分的分析方法主要是采用HPLCUV測定薯蕷皂苷元等皂苷類成分；總多糖及總黃酮的含量測定多運用紫外可見分光光度法；其元素含量采用ICPAES，ICPMS測定；亦有應(yīng)用LCMS測定百合中酚性甘油酯的含量的報道[714]，但所報道的測定方法中，每一種方法只針對單一結(jié)構(gòu)類型的成分進行測定，并且其中單黃酮成分及另一類活性成分有機酸的含量測定方法尚未見報道。本文建立了應(yīng)用UPLCTQ/MS同時測定百合中特征性成分酚性甘油酯、黃酮及有機酸類成分的分析方法，通過一次測定即能完成百合中3類活性成分的含量分析，是一個較全面快速的百合質(zhì)量評價方法。并用于目前我國百合藥材的主產(chǎn)地湖南龍山、安徽霍山[1517]栽培品種卷丹的分析評價。為百合藥材的質(zhì)量控制與臨床用藥提供依據(jù)。

1材料

11儀器

ACQUITY UPLC系統(tǒng)（二元高壓泵，自動進樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測器，Waters公司）；Xevo TQ/MS質(zhì)譜系統(tǒng)（Waters公司）；MassLynxTM質(zhì)譜工作站（Waters公司）；ML204電子分析天平（1/10萬）、MS105電子分析天平（1/1萬）（梅特勒托尼多儀器有限公司）；Millipore Q純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；KQ250E型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；Anke GL16G Ⅱ型離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

12試藥與試劑

王百合苷E、王百合苷F、王百合苷C、王百合苷B均為本實驗室從百合藥材中分離自制，其化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)1HNMR，13CNMR及ESIMS分析確認，純度經(jīng)HPLCUV檢測均大于98%。乙腈、甲醇、甲酸（TEDIA）、綠原酸、咖啡酸、原兒茶醛、阿魏酸（成都普菲德生物科技有限公司）。

百合樣品為實地采集，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定為百合科植物卷丹L lancifolium的干燥肉質(zhì)鱗葉，共采集了35批百合樣品，其中S1～S18為湖南龍山百合，S19～S35為安徽霍山百合，憑證標(biāo)本存放于江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心。

2方法

21供試品溶液的制備

取各批次百合藥材供試品（40目）約05 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶，加50%甲醇20 mL，稱重，靜置2 h，室溫超聲30 min，稱重，以50%甲醇補足失重，搖勻，離心10 min（13 000 r·min-1）。取上清液適量，經(jīng)022 μm的微孔濾膜濾過后，取續(xù)濾液作為供試品溶液。以干燥品計算供試品各類成分的含量。

22對照品溶液的制備

分別取綠原酸、咖啡酸、原兒茶醛、阿魏酸、王百合苷E、王百合苷F、王百合苷C、王百合苷B對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解配制成對照品儲備液；取適量各成分儲備液，加甲醇稀釋定容，配制成混合對照品溶液，其中各成分質(zhì)量濃度分別為0484 0，0436 0，0420 0，0620 0，0638 0，0717 0，1064，2010 g·L-1的混合對照品儲備液。取上述混合對照品溶液用甲醇稀釋成6份不同濃度的混標(biāo)工作液。

23UPLCTQMS分析條件

色譜分析條件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（21 mm ×100 mm，17 μm）色譜柱；柱溫35 ℃。流動相乙腈（A），01%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～ 2 min，3% A；2 ～ 6 min，3%～ 10% A；6 ～ 9 min，10%～15% A。流速04 mL·min-1；進樣量 2 μL。

質(zhì)譜檢測條件ESI源；掃描方式ESI+，ESI-模式；多反應(yīng)檢測（MRM）；毛細管電壓30 kV；錐孔電壓30 V；萃取電壓30 V；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度500 ℃；錐孔氣流量50 L·h-1；脫溶劑氣流量1 000 L·h-1，輔助氣流015 mL·min-1。各類成分的質(zhì)譜參數(shù)見表1，色譜圖見圖1。

張黃琴等：不同產(chǎn)地百合藥材中8種活性成分的分析與評價

24線性試驗及方法學(xué)考察

241標(biāo)準曲線與定量限

精密量取22項下混標(biāo)工作液按23項下的分析條件進行測定。以被測化合物的峰面積（Y）對濃度（X）進行線性回歸，并按信噪比（S/N）為10和3分別計算被測組分的定量限（LOQ）和檢測限（LOD）。結(jié)果見表2，各成分線性良好，r均在0995 8以上。

242精密度試驗

取中濃度混合對照品溶液，在上述色譜條件下分別在1日內(nèi)重復(fù)進樣6次和在連續(xù)3日內(nèi)重復(fù)進樣3次以測定所分析的化學(xué)成分的峰面積，以各指標(biāo)成分含量的RSD來評價日內(nèi)及日間精密度。

結(jié)果見表3，各成分日內(nèi)精密度RSD≤28%，日間精密度RSD≤30%。

243重復(fù)性試驗

取S1號樣品6 份，按照21項下方法制備供試品溶液，分別進樣分析，以樣品中各指標(biāo)成分含量的 RSD 值來評價其重復(fù)性。結(jié)果見表3，重復(fù)性RSD≤31%。

244穩(wěn)定性試驗

取S1號樣品6 份，按照21項下方法制備供試品溶液，置于4 ℃保存，分別于0，2，4，8，12，24 h分別取樣，進行UPLCMS/MS分析，以各指標(biāo)成分含量，計算RSD，考察方法的穩(wěn)定性。結(jié)果見表3，穩(wěn)定性RSD≤35%。

245加樣回收率試驗

取025 g已知含量的樣品9份（S1），每份精密稱定，加入樣品中各成分量的80%，100%，120%的對照品，各平行3份，按照供試品溶液的制備方法處理并按上述條件測定，計算平均回收率和RSD。結(jié)果見表3，平均加樣回收率9521%～1060%，RSD≤41%均符合分析要求。

25數(shù)據(jù)處理

將測得數(shù)據(jù)導(dǎo)入EZ info軟件（Waters公司），進行主成分分析（principal components analysis，PCA），得各樣品的得分圖。采用偏最小二乘法（partial least squares method，PLS）分析得到各指標(biāo)的VIP值，依據(jù)VIP值的大小判斷各個指標(biāo)對分類的重要程度。利用SPSS得出各指標(biāo)的綜合因子，根據(jù)綜合得分，給出各批次的排名。相關(guān)性分析使用SPSS210。

3結(jié)果

31樣品測定

各樣品按21項下的方法制得供試品溶液。取各供試品溶液，按23項下的條件進樣測定，測定結(jié)果見表4。百合樣品中王百合苷E的范圍為0604 0×10-1～1862×10-1 mg·g-1；王百合苷F的范圍為0680 0×10-2～4475×10-2 mg·g-1；王百合苷C的范圍為0700 0×10-3～2965×10-1 mg·g-1；王百合苷B的范圍為0170 0×10-1～4724 mg·g-1；綠原酸的范圍為6827×10-3～1607×10-3 mg·g-1；咖啡酸的范圍為0111 0×10-4～7971×10-3 mg·g-1；原兒茶醛的范圍為0593 7×10-3～2962×10-3 mg·g-1；阿魏酸的范圍為2606×10-2～4589×10-2 mg·g-1。

32各項指標(biāo)間的主成分分析

將測得百合中8種成分進行分析，應(yīng)用EZ info，SPSS 210統(tǒng)計軟件對原始數(shù)據(jù)進行標(biāo)準化處理。

321EZ info軟件繪制PCA得分圖及VIP圖

將測定數(shù)據(jù)導(dǎo)入EZ info（Waters公司）軟件進行主成分分析，通過降維建立包含第1個主成分

t[1]與第2個主成分t[2]二維空間的PLSDA分類模型，見圖2。第1個主成分軸是原始數(shù)據(jù)矩陣方差最大方向，第2個主成分軸是方差次大方向，降維時，最大限度保留有用信息，尋找能夠使不同產(chǎn)地樣品得到最大分離的方向。由圖2分析得出，以8種物質(zhì)含量為變量，進行主成分分析，繪制PCA得分圖，35批百合藥材被分成以產(chǎn)地為區(qū)分的2組。

采用偏最小二乘法分析得到各個指標(biāo)的VIP值，見圖3，阿魏酸、咖啡酸的VIP值均大于1，表明這2種成分在2個產(chǎn)地的百合中含量差異性較大；綠原酸，原兒茶醛，RegC，RegE，RegB，RegF的VIP值較小，表明這些成分含量在2個產(chǎn)地間相差較小。

322SPSS軟件進行主成分分析

為比較不同批次百合藥材的質(zhì)量差異，用SPSS進行主成分分析，根據(jù)綜合因子，給出各批次的排名。

3221主成分篩選及其貢獻率主成分的特征值及貢獻率是選擇主成分的依據(jù)，見表5，描述了主成

分分析初始值對原有變量的總體描述情況。從表中可知前2個主成分的累積方差貢獻率達到8536%，因此選擇前2個主成分，它們基本代表百合樣品中此8種成分的信息。

經(jīng)方差最大正交旋轉(zhuǎn)后的因子載荷矩陣，用以鑒別有實際意義的因子見表6。從中可以看到第1個主因子和王百合苷E、王百合苷F、王百合苷C、王百合苷B、綠原酸呈高度正相關(guān)；第2個主因子和咖啡酸、阿魏酸呈高度正相關(guān)。因為總方差85%以上的貢獻來自前2個主因子，所以可以認為王百合苷E、王百合苷F、王百合苷C、王百合苷B、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸是百合的特征成分。

3222計算因子得分因子得分系數(shù)矩陣，根據(jù)主成分計算公式可以得到前2個主成分與原來8項指標(biāo)的線性組合：F1=0210 RegE+0210 RegF+0211 RegC+0196 RegB+0204綠原酸-0029咖啡酸+0061原兒茶醛-0031阿魏酸；F2=-0036RegE+0019 RegF-0016RegC-0040 RegB+0103綠原酸+0428咖啡酸+0260原兒茶醛+0426阿魏酸；計算綜合得分F=0574 1F1+0279 5F2，見表7。

按綜合評價函數(shù)計算得出不同樣品的綜合得分（F）及得分排名見表8。綜合排序的名次越前，表明就該8項指標(biāo)而言，該樣品的質(zhì)量較好，反之，質(zhì)量就較差。

根據(jù)主成分分析結(jié)果，在綜合排名的前10位，有8種百合為安徽霍山百合。初步判斷，以該8種成分為評價指標(biāo)時，安徽霍山百合質(zhì)量略好于湖南龍山。

33各項指標(biāo)間的相關(guān)性分析

百合藥材中該8項指標(biāo)的相關(guān)性見表9。結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地百合中該8項指標(biāo)之間有RegFRegE、RegC綠原酸、阿魏酸咖啡酸等共12對呈顯著正相關(guān)；且無呈顯著負相關(guān)對。

4討論

41供試品溶液制備方法的確定

在正式實驗前，對提取溶劑及料液比分別做了相關(guān)單因素考察。在溶劑倍量一定時，分別用30%，50%，80%甲醇、乙醇進行提??；在溶劑體積分數(shù)確定時，分別考察了20，40，60，80倍量料液比提取百合藥材，經(jīng)過進樣分析得出以50%的甲醇為提取溶劑，料液比為40倍時，提取效果最好。

42分析方法的選擇

本實驗測得百合樣品中酚性甘油酯類、有機酸類及黃酮類成分量低至千分之幾，如綠原酸的為0000 682 7%～0007 971%。HPLC與UPLC雖對百合樣品中成分均有紫外吸收，但檢測靈敏度較低，而各類成分含量均較低，因此本研究選擇靈敏度高的UPLCTQMS分析方法同時測定百合藥材中的8種成分。

43不同產(chǎn)地百合藥材的質(zhì)量評價

運用主成分分析法對藥材多指標(biāo)進行綜合評價，是一個科學(xué)、合理、全面的評價藥材質(zhì)量的統(tǒng)計方法[18]。本研究中，首先為研究2個產(chǎn)地百合藥材組分上的差異，對2個產(chǎn)地共35批百合藥材中8個成分進行分析，對于該類復(fù)雜數(shù)據(jù)，利用主成分分析對數(shù)據(jù)降維處理得PCA得分圖及VIP圖，圖2可以清楚、直觀地看出，百合樣品被分成以產(chǎn)地為區(qū)分的2組，圖3反映出阿魏酸、咖啡酸的VIP均大于1，表明這兩種成分在2個產(chǎn)地的百合中含量差異性較大，由此可以基本判定2個產(chǎn)地的劃分是以阿魏酸和咖啡酸為指標(biāo)的。隨之，為比較不同批次百合藥材的質(zhì)量差異，用SPSS進行主成分分析，根據(jù)綜合因子，給出各批次的排名，在綜合排名的前10位，有8種百合為安徽霍山百合。初步判斷，以該8種成分為評價指標(biāo)時，安徽霍山百合質(zhì)量略好于湖南龍山。

相關(guān)性分析旨在研究2個變量之間的變化趨勢[19]，本研究對百合藥材中的8個成分進行了相關(guān)性分析，由相關(guān)性分析結(jié)果可知，4種酚性甘油酯類成分含量相互間均有極大的相關(guān)性，提示該4種酚性甘油酯類成分在百合藥材中的含量是相互促進的，某種酚性甘油酯含量高，其余的也會協(xié)同升高。

同時值得注意的是，酸類成分中綠原酸的含量與4種酚性甘油酯類成分含量也成高度相關(guān)，這一特點的具體原因有待實驗的進一步探討。

百合藥材中除了含量較高的多糖及皂苷類，本文所測的這幾類成分亦是百合的特征性成分與活性成分。酚性甘油酯是百合的特征性成分亦是其功效成分，研究表明酚性甘油酯類有一定的抗氧化活性，與百合養(yǎng)陰潤肺、清心安神、止咳祛痰等功效緊密相關(guān)。黃酮類成分、有機酸類也具有較好的生物活性[9，13]。雖然這些成分的含量較低，卻亦是其主要的功效成分。故本文所建立的同時測定百合中這3類成分的方法，可以為全面評價百合藥材的質(zhì)量提供一種切實可行的參考。

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[責(zé)任編輯丁廣治]

[收稿日期]20160922

[基金項目]中央本級重大增減支項目（2060302）；國家自然科學(xué)基金項目（81373978）

[通信作者]*錢大瑋，研究員，碩士生導(dǎo)師，Tel： （025） 85811916，Email： qiandwnj@126com