陶絲雨+肖叢瑞+王晶+張淑靜+高譽(yù)珊+穆芳園+王一程+閆興麗

[摘要]該研究旨在通過探討蜘蛛香環(huán)烯醚萜類成分纈草醛對(duì)腸易激綜合征（IBS）大鼠結(jié)腸中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（CRF）、色氨酸羥化酶1（TPH1） mRNA表達(dá)及5羥色胺（5HT）含量的影響，闡釋纈草醛通過5HT通路治療IBS的作用機(jī)制。將54只SD 雄性大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、纈草醛高、中、低劑量組、匹維溴銨組，每組9只。采用孤養(yǎng)結(jié)合慢急性不可預(yù)見性應(yīng)激法建立IBS大鼠模型，免疫組化法測定大鼠結(jié)腸CRF表達(dá)，RTPCR法測定結(jié)腸中TPH1 mRNA表達(dá)，高效液相色譜法測定大鼠結(jié)腸中5HT含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，孤養(yǎng)結(jié)合慢急性不可預(yù)見性應(yīng)激可造成大鼠結(jié)腸中CRF，TPH1 mRNA表達(dá)以及5HT含量升高（P<005），纈草醛各劑量組中CRF，TPH1 mRNA及5HT含量較模型組明顯下降（P<005）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腸易激綜合征能夠?qū)е陆Y(jié)腸中CRF，TPH1 mRNA的表達(dá)以及5HT的含量升高，而纈草醛通過降低結(jié)腸中CRF，TPH1 mRNA的表達(dá)以及5HT的含量，而改善胃腸道的相關(guān)癥狀。

[關(guān)鍵詞]纈草醛； 腸易激綜合征； 促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子； 色氨酸羥化酶1； 5羥色胺

Effects of baldrinal of Valeriana jatamansi on expression of CRF，

TPH1 mRNA and 5HT in rats with irritable bowel syndrome

TAO Siyu 1， XIAO Congrui 2， WANG Jing 2， ZHANG Shujing1， GAO Yushan1，

MU Fangyuan1， WANG Yicheng1， YAN Xingli1*

（1. School of Preclinical Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China；

2. School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract]This study aimed to investigate the effects of baldrinal of Valeriana jatamansi on the expression of corticotropin releasing factor （CRF） and tryptophan hydroxylase 1 （TPH1） mRNA and levels of 5hydroxytryptamine （5HT） in colon of rats with irritable bowel syndrome （IBS）， and to explain its therapeutic mechanism on IBS through 5HT pathway Fiftyfour male SD rats were randomly divided into 6 groups： blank group， model group， baldrinal high， medium and low dose groups， and pinaverium bromide group， n=9 in each group The IBS rat models were established by using unpredictable chronic stress for 3 weeks followed by 1hour acute restraint stress （CAS） after 7 days of rest and independent feeding CRF expression was detected by IHCP； TPH1 mRNA expression was detected by using RTPCR and the 5HT level was measured by high performance liquid chromatography（HPLC） The results indicated that the method of chronic stress with acute restrain stress method and independent feeding could lead to the increase in expressions of CRF and TPH1 mRNA and levels of 5HT in IBS rats（P<005） The expressions of CRF， TPH1 mRNA and 5HT in baldrinal groups were significantly lower than those in model group（P<005） The experimental results showed that IBS could result in increase in the expressions of CRF， TPH1 mRNA and levels of 5HT， and the baldrinal of V jatamansi could improve the symptoms of IBS by reducing the expressions of CRF， TPH1 mRNA and levels of 5HT in colon of rats

[Key words]baldrinal； IBS； CRF； TPH1； 5HT

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS） 是一種臨床常見的胃腸功能紊亂性疾病，以腹痛、腹瀉、排便習(xí)慣和排便性狀異常為主要癥狀，持續(xù)存在或間歇發(fā)作，而無形態(tài)學(xué)和生化異常改變的癥候群[1]。IBS發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前普遍認(rèn)為內(nèi)臟敏感性和腸道動(dòng)力異常是IBS特征性的病理生理學(xué)基礎(chǔ)[2]。5羥色胺（5HT）含量的改變與IBS患者腹痛、腹瀉及內(nèi)臟敏感等癥狀密切相關(guān)。

蜘蛛香Valeriano jatamansi Jones為敗醬科纈草屬植物，常用于治療脘腹脹痛，消化不良，腹瀉等疾病。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蜘蛛香原粉[3]以及蜘蛛香環(huán)烯醚萜類成分11ethoxyviburtinal具有止瀉作用，并且可以通過降低結(jié)腸中5HT含量，改善IBS 模型大鼠的腸道功能紊亂[45]；同時(shí)降低結(jié)腸中P物質(zhì)、血管活性肽和生長抑制素等胃腸激素的分泌水平[6]，抑制結(jié)腸嗜鉻細(xì)胞（EC）和肥大細(xì)胞（MC）的表達(dá)[7]，降低內(nèi)臟敏感性，緩解IBS模型大鼠的癥狀。本實(shí)驗(yàn)通過研究蜘蛛香另一環(huán)烯醚萜類成分纈草醛（baldrinal）對(duì)IBS模型大鼠結(jié)腸中與5HT合成相關(guān)的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（CRF）及色氨酸羥化酶1（TPH1）的表達(dá)水平及5HT含量的影響，闡釋纈草醛治療IBS的作用機(jī)制。

1材料

11動(dòng)物SD大鼠，體重120～140 g，雄性。北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）20150001。動(dòng)物于20～24 ℃，濕度60%～70%，12 h明暗的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開始實(shí)驗(yàn)。

12試劑免疫組化超敏SP試劑盒（兔、KIT9706）、DAB顯色試劑盒（DAB0031）：福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；AntiCorticotropin Releasing Factor antibody（ab8901）：美國Abcam公司。Trizol（98903）：ambion；三氯甲烷（20120704）、異丙醇（20140417）：北京化工廠；反轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒（00322404）、Power SYBR Green PCR Master Mix（1511510）：Thermo Scientific。5HT（028K1582）：SIGMA；檸檬酸（051024）、乙二胺四乙酸二鈉（990730）：北京化學(xué)試劑公司；高氯酸（SHBG2241V）：SIGMAALDRICH。

13儀器1510型石蠟薄片切片機(jī)（德國LETIZ公司）；顯微鏡及分析系統(tǒng)（日本尼康公司）；液相色譜儀（Waters e2695）；電化學(xué)檢測器（Waters 2465）；C18柱（Waters，21 mm×150 mm，3 μm，Lot No：0159341691）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（Applied BiosystemsTM）；溫度梯度PCR儀（美國伯樂BioRad）；UV2600（A）紫外可見分光光度計(jì)（尤尼柯）。

14藥物蜘蛛香環(huán)烯醚萜類成分纈草醛：取適量纈草醛（纈草醛從蜘蛛香藥材中提取分離得到，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)系提供），用蒸餾水配制成所需劑量的混懸液。纈草醛高、中、低劑量分別為06，03，015 mg·kg-1。其中纈草醛中劑量相當(dāng)于人臨床等效量[8]。陽性藥物：得舒特（匹維溴銨片）：Abbott Products SAS，批號(hào)637753。用蒸餾水配制成所需劑量的混懸液，灌胃給藥量為25 mg·kg-1。給藥劑量相當(dāng)于人臨床等效量（為人用劑量的7 倍）[9]。

2方法

21腸易激綜合征大鼠模型的制備及給藥SD雄性大鼠54只，按照隨機(jī)分組原則分為空白對(duì)照組、IBS模型組、纈草醛高、中、低劑量組、匹維溴銨組，每組9只?？瞻讓?duì)照組不加任何刺激。其余各組的大鼠每籠1只孤養(yǎng)，60 d內(nèi)隨機(jī)循環(huán)接收7種不同慢性刺激：①斷水（24 h）；②斷食（24 h）；③晝夜顛倒；④冷水刺激（4 ℃，5 min）；⑤潮濕飼養(yǎng)（24 h）；⑥夾尾致痛（1 min）；⑦束縛制動(dòng)（5 h）。同時(shí)每30 d對(duì)大鼠進(jìn)行急性束縛刺激1 h。各給藥組自實(shí)驗(yàn)第33天開始灌胃給藥，給藥時(shí)間：每日上午9時(shí)，給藥體積為10 mL·kg-1，空白對(duì)照組與模型組給予同容量的蒸餾水，總計(jì)治療30 d[10]。

22免疫組化法測定結(jié)腸中CRF的表達(dá)治療結(jié)束后，給予10%水合氯醛麻醉后開胸，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液灌注，取肛門上方7cm處結(jié)腸，放入4%多聚甲醛固定3 d，脫水、包埋、制蠟塊，切片制片后進(jìn)行免疫組化。

切片常規(guī)脫蠟脫水后，PBS沖洗3次（每次3 min）；檸檬酸修復(fù)煮沸10 min；冷卻至室溫后PBS沖洗3次（每次3 min）；H2O2室溫封閉10 min；PBS沖洗3次（每次3 min）；滴加正常山羊血清封閉液，室溫10 min，甩去多余液體；滴加一抗80 μL，4 ℃過夜；次日PBS沖洗3次（每次5 min）；滴加生物素化二抗，室溫10 min；PBS沖洗3次（每次3 min）；滴加生物素化三抗，室溫10 min；PBS沖洗3次（每次3 min）；DAB試劑盒顯色劑顯色，室溫10 min（避光）；自來水沖洗3次（每次3 min）；常規(guī)脫水脫蠟后中性樹膠封片。顯微鏡觀察，記錄總積分光密度值（integrated option density，IOD）。

23熒光定量PCR測定結(jié)腸中TPH1 mRNA表達(dá)[11]治療結(jié)束后，大鼠斷頭處死，在低溫環(huán)境中迅速取截取距動(dòng)物肛門5 cm處結(jié)腸1 cm，約100 mg，投入液氮中速凍后于-80 ℃保存。根據(jù)GenBank中登錄的TPH1和內(nèi)參βactin基因序列設(shè)計(jì)引物（由上海英濰捷基公司合成）。TPH1的上游引物為5′GATGGTCAGTCTGGATGCTATG3′，TPH1的下游引物為5′GTCTCCTTGAAGTCTAGTGTGTG3′；βactin上游引物序列為5′ACCGTGAAAAGATGACCCAGAT3′，βactin下游引物序列為5′CCAGAGGCATACAGGGACAA3′。使用Trizol提取結(jié)腸組織中總RNA，并以其為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板PCR擴(kuò)增TPH1基因。以2 μL cDNA作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min。以后95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)；融解曲線：PCR結(jié)束后，95 ℃，15 s，冷卻至60 ℃，1 min；60～95 ℃，每升高03 ℃，收集1次熒光信號(hào)，最后95 ℃，15 s。

相對(duì)表達(dá)量（relative qualification，RQ）=2（Ct對(duì)照目的基因-Ct對(duì)照內(nèi)參基因）-（Ct處理目的基因-Ct處理內(nèi)參基因）

24高效液相電化學(xué)法測定結(jié)腸中5HT的含量[12]治療結(jié)束后，動(dòng)物斷頭處死，截取距大鼠肛門5 cm 處結(jié)腸1～2 cm，稱重后加入3倍體積的01 mol·L-1高氯酸溶液，粉碎后勻漿，離心取上清20 μL進(jìn)樣。色譜條件：流動(dòng)相緩沖鹽甲醇（96∶4）；流速030 mL·min-1；電化學(xué)檢測器工作電壓075 V；進(jìn)樣量20 μL，柱溫35 ℃。進(jìn)樣25，5，10，20，40，80 μL求出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

25數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以±s表示，采用SAS82軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多個(gè)樣本均數(shù)比較用單因素方差分析（OneWay ANOVA），其中方差齊者用LSD法進(jìn)行組間比較，方差不齊者采用Dunnett′s T3法進(jìn)行組間比較。以P<005判斷差異顯著性。

3結(jié)果

31纈草醛對(duì)IBS模型大鼠結(jié)腸CRF表達(dá)的影響CRF主要表達(dá)在腸黏膜固有層和下層的胞漿中，陽性細(xì)胞呈棕褐色。對(duì)照組的陽性細(xì)胞數(shù)量少，著色較淺；IBS模型組的陽性細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯增多，著色較重；纈草醛各劑量組及匹維溴銨組的陽性細(xì)胞數(shù)量較模型組有所減少，著色較淺。各組大鼠的總IOD值均高于對(duì)照組（P<005），說明孤養(yǎng)結(jié)合慢急性不可預(yù)見性刺激的造模方法能夠促進(jìn)大鼠結(jié)腸CRF的表達(dá)；對(duì)照組與纈草醛高劑量組的IOD值低于模型組（P<005），見圖1，表1。

陶絲雨等：纈草醛對(duì)腸易激綜合征模型大鼠結(jié)腸CRF，TPH1 mRNA及5HT表達(dá)的影響

32纈草醛對(duì)IBS模型大鼠結(jié)腸TPH1 mRNA表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，IBS模型組大鼠結(jié)腸中TPH1 mRNA表達(dá)明顯增高（P<005），與IBS模型組比較，纈草醛中、低劑量組及匹維溴銨組大鼠結(jié)腸中TPH1 mRNA表達(dá)下降明顯（P<005），見表2。

33纈草醛對(duì)IBS模型大鼠結(jié)腸5HT含量的影響以峰面積為縱坐標(biāo)，5HT質(zhì)量為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=20 418X+25 941，R2=0996；以峰面積為縱坐標(biāo)，此方法線性良好，可用于生物樣品中5HT含量測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，與對(duì)照組相比較，模型組5HT含量明顯升高（P<005），纈草醛高、中、低劑量組較模型組5HT含量明顯下降（P<005）。

4討論

苗藥蜘蛛香是敗醬科纈草屬植物的根及根莖，曾載《本草綱目》，1977年版和2010年版《中國藥典》（一部）中亦有收載。蜘蛛香性味辛、苦、溫，用于治療胃腸道疾病有較好的療效，如消化不良，嘔吐腹瀉，小兒疳積、腹脹、食少、胃氣痛等[13]。纈草醛（baldrinal）是蜘蛛香中環(huán)烯醚萜類降解后的主要成分，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，提取分離量大[14]。

現(xiàn)代研究表明，IBS的發(fā)病機(jī)制主要包括內(nèi)臟感知障礙、胃腸動(dòng)力異常以及胃腸分泌異常等，5羥色胺（5HT）作為一種具有多種生物功能的廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道的神經(jīng)遞質(zhì)，被發(fā)現(xiàn)積極參與了上述生理病理過程，并與IBS患者腹痛、腹瀉及內(nèi)臟敏感等癥狀密切相關(guān)[15]。腸道內(nèi)5HT的增加，會(huì)導(dǎo)致腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS）高度敏感，激活多種神經(jīng)活性物質(zhì)，導(dǎo)致腦腸軸內(nèi)信號(hào)異常；而5HT還作用于相關(guān)受體，導(dǎo)致患者腸道的感知、運(yùn)動(dòng)和分泌改變，產(chǎn)生IBS的癥狀[1617]。

促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（CRF）是一種能夠介導(dǎo)下丘腦垂體腎上腺軸（HPA軸）產(chǎn)生各種應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)肽。應(yīng)激可以刺激下丘腦的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞釋放CRF，CRF能夠激活肥大細(xì)胞，使其脫顆粒釋放5HT，改變胃腸動(dòng)力，提高內(nèi)臟敏感性。因此，CRF可能通過對(duì)5HT表達(dá)的調(diào)控來影響IBS的內(nèi)臟敏感性[1820]。

色氨酸羥化酶（TPH）是機(jī)體外周系統(tǒng)合成5HT的關(guān)鍵限速酶，TPH1是其主要異構(gòu)體之一，主要在腸嗜鉻細(xì)胞（EC）中表達(dá)。TPH1可以介導(dǎo)EC細(xì)胞重?cái)z取的色氨酸（Trp）分解成為5羥色氨酸（5HTP），進(jìn)而脫羧生成5HT。因此，TPH1直接影響5HT的生成，其表達(dá)的增強(qiáng)會(huì)引起5HT水平的升高[21]。應(yīng)激狀態(tài)下，CRF與TPH1同時(shí)作用，促進(jìn)5HT的分泌與生成，導(dǎo)致結(jié)腸5HT水平的異常升高，從而產(chǎn)生IBS的相關(guān)癥狀[22]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激可以使IBS大鼠5HT分泌增加，EC細(xì)胞數(shù)量增多，內(nèi)臟敏感性增加，而束縛應(yīng)激也可以促進(jìn)EC細(xì)胞釋放5HT[2324]。本實(shí)驗(yàn)中采用孤養(yǎng)結(jié)合慢急性不可預(yù)見性應(yīng)激法制備腸易激綜合征大鼠模型[25]，結(jié)果表明，IBS模型組大鼠結(jié)腸組織中CRF與TPH1表達(dá)均顯著升高，5HT含量也明顯升高，說明5HT含量升高可能與CRF，TPH1表達(dá)升高有關(guān)，而5HT的異常升高會(huì)導(dǎo)致腸道內(nèi)臟敏感性和腸道動(dòng)力異常，證明CRF和TPH1的表達(dá)異常與IBS的發(fā)生有密切關(guān)系。給予纈草醛治療后，纈草醛能夠明顯降低IBS模型大鼠結(jié)腸內(nèi)5HT的含量，結(jié)腸中CRF，TPH1表達(dá)較模型組顯著下降，說明纈草醛可能是通過降低IBS模型大鼠結(jié)腸CRF的表達(dá)水平，影響肥大細(xì)胞釋放5HT；通過調(diào)控TPH1影響了5HT的合成，降低了結(jié)腸內(nèi)5HT的含量，從而改善了IBS的相關(guān)癥狀。

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[責(zé)任編輯張寧寧]

[收稿日期]20160907

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81374044）；校級(jí)自主課題項(xiàng)目（2016JYBXS028）

[通信作者]*閆興麗，博士，研究員，研究方向：傳統(tǒng)中醫(yī)藥用藥規(guī)律、作用規(guī)律及應(yīng)用基礎(chǔ)研究，Email：xingliyan3@126com

[作者簡介]陶絲雨，碩士研究生，Email：siluhuayu9229@163com