陳 奇,袁金海, 劉自剛, 孫萬(wàn)倉(cāng), 方 彥, 趙新旺, 馬 驪, 蒲媛媛, 趙艷寧, 曾秀存

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白菜型冬油菜‘隴油7號(hào)’葉片響應(yīng)低溫脅迫的差異蛋白鑒定與分析*

陳 奇?,袁金海?, 劉自剛**, 孫萬(wàn)倉(cāng), 方 彥, 趙新旺, 馬 驪, 蒲媛媛, 趙艷寧, 曾秀存

(甘肅省油菜工程技術(shù)研究中心/甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 蘭州 730070)

為了從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度探討超強(qiáng)抗寒品種白菜型冬油菜‘隴油7號(hào)’的抗寒機(jī)理, 本研究采用TCA (三氯乙酸)-丙酮沉淀法, 提取低溫脅迫(4 ℃, 7 d)前后的葉片總蛋白, 對(duì)蛋白提取方法、IPG(固定pH梯度)膠條種類等環(huán)節(jié)進(jìn)行了優(yōu)化, 運(yùn)用雙向電泳和質(zhì)譜分析技術(shù), 鑒定了低溫脅迫下‘隴油7號(hào)’5葉期葉片總蛋白質(zhì)組分的表達(dá)差異模式。結(jié)果表明: 改進(jìn)后的蛋白質(zhì)提取液(含DTT, 二硫蘇糖醇)和PVPP(聚乙烯吡咯烷酮)得到的蛋白質(zhì)平均濃度較改進(jìn)前高3.42 μg·μL-1, 除鹽時(shí)間較改進(jìn)前短1.14 h; 同時(shí), 含蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)的蛋白提取液獲得的蛋白質(zhì)種類豐富, 凝膠圖譜中可檢測(cè)到661個(gè)蛋白點(diǎn), 較改進(jìn)前可測(cè)蛋白點(diǎn)數(shù)(587)提高11.2。采用17 cm pH 4~7的IPG膠條的電泳能更好地分離蛋白, 得到重復(fù)性好、分辨率高的蛋白質(zhì)組圖譜。利用PDQuest 8.0軟件分析比較了超強(qiáng)抗寒品種‘隴油7號(hào)’低溫脅迫前后的蛋白組表達(dá)譜, 發(fā)現(xiàn)低溫脅迫前后共有15個(gè)質(zhì)變的蛋白質(zhì)點(diǎn), 推測(cè)這些差異蛋白點(diǎn)可能與低溫脅迫的響應(yīng)有關(guān)。進(jìn)一步對(duì)質(zhì)變的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜分析, 鑒定出11個(gè)與低溫脅迫相關(guān)的蛋白質(zhì)點(diǎn), 這些蛋白包括光合作用相關(guān)的蛋白、糖代謝相關(guān)的蛋白、物質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)的蛋白和逆境響應(yīng)相關(guān)的蛋白。而且, 低溫脅迫處理前后, ‘隴油7號(hào)’葉片蛋白質(zhì)的表達(dá)水平存在明顯差異, 這些差異蛋白可能在冬油菜抗寒響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

白菜型冬油菜; 隴油7號(hào); 低溫脅迫; 雙向電泳; 蛋白組學(xué)

低溫是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見的一種嚴(yán)重自然災(zāi)害, 它可以使植物細(xì)胞脫水、結(jié)晶, 原生質(zhì)內(nèi)發(fā)生不可逆的凝膠化, 造成植物細(xì)胞的機(jī)械損害或死亡。相對(duì)于甘藍(lán)型油菜(), 白菜型油菜()具有抗寒性強(qiáng)、耐瘠薄等優(yōu)良性狀, 在北方寒旱區(qū)有著甘藍(lán)型油菜無(wú)法替代的作用[1]。自孫萬(wàn)倉(cāng)等[2]提出冬油菜向我國(guó)北方寒旱區(qū)北移的可行性后, 冬油菜的種植面積日益擴(kuò)增, 產(chǎn)生了巨大的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益。冬油菜的成功北移, 主要依賴于超強(qiáng)抗寒品種的成功選育。隴油系列白菜型冬油菜品種抗寒性優(yōu)異, 但其抗寒機(jī)理尚不完全清楚。目前, 對(duì)白菜型冬油菜的研究主要集中在其抗寒性的形態(tài)特征與生理特征[3]、抗寒響應(yīng)相關(guān)的基因克隆[4-6]等方面, 但是對(duì)其抗寒機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究甚少。目前, 蒲媛媛[7]僅在蛋白質(zhì)上樣量的比較和等電聚焦(IEF)的優(yōu)化方面作了初步研究, 尚未對(duì)低溫脅迫前后的差異蛋白作深入的探究。

蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者, 是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者。因此, 要對(duì)生命的復(fù)雜活動(dòng)有全面和深入的認(rèn)識(shí), 就必須進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究[8]。目前, 雙向凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)技術(shù)已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的首選技術(shù), 特別是用于抗逆性差異蛋白質(zhì)的分析及鑒定, 利用2-DE技術(shù)能夠比較分析生物樣品在不同條件下蛋白質(zhì)組學(xué)的動(dòng)態(tài)變化, 從而篩選和鑒定出功能特異性的蛋白質(zhì)及對(duì)應(yīng)的基因。近年來, 2-DE技術(shù)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)和微生物學(xué)等領(lǐng)域[9-11]。例如, 崔宇鵬等[12]對(duì)鹽脅迫下的棉花()葉片蛋白質(zhì)組進(jìn)行了分析, 發(fā)現(xiàn)24個(gè)蛋白點(diǎn)的豐度產(chǎn)生了顯著變化, 從而鑒定了一些鹽脅迫應(yīng)答蛋白。王哲等[13]用含磷和缺磷的完全營(yíng)養(yǎng)液處理水培6 d后的甘藍(lán)型油菜幼苗根系, 發(fā)現(xiàn)有62個(gè)在處理與對(duì)照之間差異顯著的蛋白點(diǎn)。其中25個(gè)蛋白受脅迫上調(diào)表達(dá), 37個(gè)蛋白受脅迫下調(diào)表達(dá)。王小麗等[14]對(duì)低溫脅迫下玉米()葉片蛋白質(zhì)組進(jìn)行了研究, 得到了5種新的蛋白點(diǎn), 推測(cè)其與抗寒性有關(guān)。低溫脅迫下, 植株通過自身的遺傳性和生理、生化等方面的反應(yīng), 導(dǎo)致一些代謝相關(guān)蛋白以及運(yùn)輸相關(guān)蛋白表達(dá)量變化, 從而誘導(dǎo)自身產(chǎn)生一些與抗逆相關(guān)的反應(yīng)來抵御外界脅迫[15]。因此, 本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法和技術(shù)分析低溫脅迫與正常生長(zhǎng)條件下白菜型冬油菜‘隴油7號(hào)’葉片蛋白質(zhì)組差異表達(dá)的變化, 篩選和鑒定一些與低溫脅迫響應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì), 加深對(duì)白菜型冬油菜響應(yīng)低溫脅迫分子機(jī)制的認(rèn)識(shí), 為進(jìn)一步利用基因工程技術(shù)培育新的抗寒品種以及篩選抗寒種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以超強(qiáng)抗寒(可耐-32 ℃, 越冬率為85%以上)白菜型冬油菜品種‘隴油7號(hào)’[16]為供試材料。于2015年9月24日選取籽粒飽滿、大小一致的油菜種子, 用10%過氧化氫處理30 min, 后用無(wú)菌水沖洗2~3次, 置于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行催芽(光照14 h, 30 ℃; 黑暗10 h, 28 ℃)。待種子露白后, 播種于裝有等量育苗基質(zhì)的花盆(14 cm×13 cm)中, 育苗基質(zhì)統(tǒng)一距花盆口2 cm處, 共20盆, 每盆4株幼苗, 于人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(培養(yǎng)條件為: 光照14 h, 25 ℃; 黑暗10 h, 20 ℃)。待幼苗至5葉期時(shí), 分2組處理, 每組10盆,一組繼續(xù)在上述條件下生長(zhǎng), 作為對(duì)照(CK); 另一為處理組(T)于人工培養(yǎng)箱4 ℃低溫脅迫處理(培養(yǎng)條件為: 光照14 h, 黑暗10 h)。連續(xù)處理7 d后, 分別取對(duì)照組和處理組混合葉片各3份, 液氮速凍, 置-80 ℃貯存用于提取組織總蛋白。試驗(yàn)材料所需養(yǎng)分來自育苗基質(zhì), 其成分為蛭石、珍珠巖、草炭和有機(jī)肥, 其氮磷鉀含量≥6%, 有機(jī)質(zhì) ≥45%。購(gòu)買于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 材料每隔1~2 d澆水1次, 每次澆水量均為花盆最大持水量, 進(jìn)行常規(guī)管理。

1.2 白菜型冬油菜葉片蛋白質(zhì)差異表達(dá)分析

1.2.1 總蛋白凝膠圖譜最佳pH IPG膠條的篩選

為篩選‘隴油7號(hào)’葉片總蛋白凝膠圖譜高豐度表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)分離清晰可觀、低豐度表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)分辨率高且蛋白質(zhì)點(diǎn)分布均勻的最佳pH范圍的IPG膠條, 分別選用17 cm pH 3~10和17 cm pH 4~7的IPG膠條檢測(cè)蛋白質(zhì)凝膠圖譜分離情況, 確定最佳IPG膠條pH范圍。

1.2.2 白菜型冬油菜葉片總蛋白提取與蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

冬油菜葉片總蛋白提取采用TCA-丙酮沉淀法[17-20]。并分別采用本研究改進(jìn)后和改進(jìn)前的方法。

改進(jìn)后: ①取油菜葉片, 用蒸餾水沖洗干凈, 濾紙擦干后, 置于經(jīng)滅菌并預(yù)冷的研缽中, 加入少量PVPP后, 加入液氮充分研磨至粉末狀, 將粉末轉(zhuǎn)入若干個(gè)經(jīng)液氮預(yù)冷的2 mL離心管中; ②每個(gè)離心管中加入-20 ℃預(yù)冷的TCA-丙酮(含10% TCA、0.07% DTT和0.015% PMSF), 渦旋混勻,-20 ℃冰箱過夜, 次日4 ℃、20 000×g離心30 min, 棄上清留沉淀; ③每管加入約2 mL 100%冷丙酮(含0.07% DTT和0.015% PMSF), 渦旋混勻,-20 ℃靜置1 h后4 ℃、20 000 ×g離心20 min, 棄上清留沉淀, 重復(fù)此步驟1~2次, 待沉淀呈乳白狀, 上清透明為宜; ④加入約2 mL 80%冷丙酮(含0.07% DTT和0.015% PMSF), 渦旋混勻,-20 ℃靜置30 min后4 ℃, 20 000 ×g離心15 min, 棄上清留沉淀, 重復(fù)此操作1~2次; ⑤將裝有沉淀的離心管放入冷凍干燥機(jī)中干燥至白色粉末狀后加入一定量的蛋白裂解液(DTT現(xiàn)加), 室溫裂解2 h, 期間每隔30 min進(jìn)行渦旋混勻, 4 ℃、20 000 ×g離心30 min, 取上清即為油菜葉片總蛋白質(zhì), 定量分裝,-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

改進(jìn)前: 蛋白提取液中未加入PVPP、DTT和PMSF, 其余步驟同改進(jìn)后方法。

1.2.3 蛋白質(zhì)定量

采用Bradford[20]法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.4 蛋白質(zhì)雙向電泳

對(duì)低溫脅迫處理和對(duì)照(CK)的油菜葉片總蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳, 第1向等點(diǎn)聚焦(IEF)分別使用pH 3~10和pH 4~7的IPG膠條, 按照GE Healthcare雙向電泳操作手冊(cè)操作, 樣品上樣量為1 000 μg, 將樣品與水化液按體積比1∶4混勻, 總體積500 μL, 按表1 程序進(jìn)行, 第2向采用濃度為12%丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后通過UMAX的Powerlook 2100XL掃描采集圖像, 用PDQuest 8.0分析軟件對(duì)凝膠圖譜標(biāo)準(zhǔn)化處理, 蛋白質(zhì)點(diǎn)匹配和生物統(tǒng)計(jì), 確定差異表達(dá)蛋白點(diǎn)。各組蛋白檢測(cè)重復(fù)3次。

表1 等電聚焦電泳程序

1.2.5 差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

運(yùn)用PDQuest 8.0分析3次重復(fù)凝膠圖譜。將3張圖譜在同一位置出現(xiàn)的差異蛋白點(diǎn)確定為差異蛋白點(diǎn), 差異蛋白點(diǎn)回收、酶解[21]后送往上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行MALDI-TOF-TOF MS 分析, 將所得到的肽片段質(zhì)量數(shù)據(jù)運(yùn)用PMF分析軟件MASCOT 2.2進(jìn)行分析, 鑒定相關(guān)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。所得蛋白質(zhì)結(jié)果信息檢索于數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI: http://www. ncbi.nlm.nih.gov/protein/)和EMBL-EBL(http://www. ebi.ac.uk/services/proteins)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)處理制表和SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法對(duì)油菜葉片總蛋白濃度和除鹽時(shí)間的影響

由表2可以看出, 經(jīng)過多次重復(fù)試驗(yàn), 改進(jìn)前提取方法(未加PVPP和DTT)得到的冬油菜葉片總蛋白濃度平均為8.11 μg·μL-1, IEF除鹽時(shí)間平均為6.51 h; 改進(jìn)后(加入PVPP和DTT)得到的全蛋白濃度平均為11.53 μg·μL-1, IEF除鹽時(shí)間平均為5.37 h。由表2可知改進(jìn)后蛋白濃度及除鹽時(shí)間與改進(jìn)前差異達(dá)極顯著水平(<0.01)。因此, 通過蛋白提取液的改進(jìn), 使得葉片中蛋白質(zhì)溶解更加充分, 蛋白質(zhì)濃度更高, 可以更好地滿足雙向電泳上樣量的要求; 另外, 提取液中加入PVPP, 可以有效地去除樣品中酚類等雜質(zhì), 提高蛋白純度, 減少樣品中的鹽分, 有利于雙向電泳等電聚焦IEF過程的進(jìn)行。

2.2 不同pH IPG膠條分離的油菜葉片蛋白點(diǎn)比較

由圖1(A、B)可知, 冬油菜‘隴油7號(hào)’葉片總蛋白采用寬范圍(17 cm, pH 3~10)非線性IPG膠條進(jìn)行分離, 低溫脅迫前后蛋白點(diǎn)主要集中在酸性(pH 4~7)范圍內(nèi)。蛋白凝膠圖譜經(jīng)PDQuest 8.0軟件檢測(cè)分析, 可以檢測(cè)到800~900個(gè)蛋白點(diǎn)。為了讓蛋白點(diǎn)分離更加明顯清晰, 本試驗(yàn)又采用了窄范圍(17 cm, pH 4~7)的IPG膠條進(jìn)行蛋白點(diǎn)的分離(圖2、圖3), 與寬范圍(pH 3~10)非線性膠條相比, 窄范圍(pH 4~7)膠條對(duì)‘隴油7號(hào)’葉片蛋白質(zhì)分離效果好, 分辨率高且蛋白點(diǎn)分布均勻, 在凝膠圖譜上可檢測(cè)到600~700個(gè)蛋白點(diǎn)?？梢? 17 cm、pH4~7線性IPG膠條更適合于油菜葉片總蛋白質(zhì)的分離。

表2 冬油菜葉片總蛋白提取方法改進(jìn)前后蛋白濃度和除鹽時(shí)間的比較

不同字母表示在0.01水平差異顯著。Different letters indicate significant differences at< 0.01.

2.3 蛋白酶抑制劑(PMSF)對(duì)油菜葉片蛋白質(zhì)2-DE圖譜分離的影響

植物細(xì)胞破碎后, 釋放的蛋白酶會(huì)降解蛋白質(zhì), 使得雙向電泳凝膠圖譜中的部分蛋白點(diǎn)缺失(圖2A)。因此, 本試驗(yàn)在樣品提取液中加入蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)有效防止了蛋白質(zhì)的降解(圖2B)。經(jīng)PDQuest 8.0軟件分析表明, 未加PMSF的凝膠圖譜中可檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)數(shù)為587個(gè), 而加入PMSF的凝膠圖譜中可檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)數(shù)為661個(gè)。所以, 在樣品制備過程中應(yīng)盡可能的避免因蛋白質(zhì)的降解而使得蛋白質(zhì)種類減少, 給試驗(yàn)結(jié)果帶來分析誤差。

A: 提取液不含PMSF條件下的蛋白表達(dá)圖譜; B: 提取液含有PMSF條件下的蛋白表達(dá)圖譜。A: the two-dimensional electrophoresis protein graphs without PMSF in extraction solution; B: the two-dimensional electrophoresis protein graphs with PMSF in extraction solution.

2.4 低溫脅迫下油菜葉片差異蛋白點(diǎn)圖譜分析

掃描得到了蛋白質(zhì)斑點(diǎn)清晰的低溫脅迫前后油菜葉片雙向電泳圖譜, 且每個(gè)樣品的3次電泳重復(fù)圖譜基本一致。使用PDQuest 8.0軟件分析2-DE的考染圖(圖3中A、B)進(jìn)行自動(dòng)匹配, 并結(jié)合肉眼觀察及手動(dòng)調(diào)整, 檢測(cè)到低溫脅迫前平均蛋白點(diǎn)數(shù)672個(gè), 匹配率為93%, 脅迫后平均蛋白點(diǎn)數(shù)689個(gè), 匹配率為90%。對(duì)表達(dá)量變化在2倍以上的新出現(xiàn)的蛋白點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè), 共檢測(cè)到‘隴油7號(hào)’葉片低溫脅迫前和低溫脅迫后之間有15個(gè)質(zhì)變表達(dá)差異的新蛋白質(zhì)點(diǎn)。在低溫脅迫下, 植株體內(nèi)原有蛋白質(zhì)的含量發(fā)生明顯變化, 以適應(yīng)逆境脅迫, 其雙向電泳凝膠圖譜與對(duì)照不同, 這意味著低溫脅迫影響油菜葉片可溶性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與組分的變化。當(dāng)植物受低溫脅迫刺激時(shí), 誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá), 合成一些新的蛋白質(zhì)(圖3B中6-15, 圖4), 即誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。這些結(jié)果表明, 在正常條件下, 某些蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度較低或不表達(dá)。但是, 在低溫脅迫下, 這些蛋白質(zhì)才表達(dá)、并發(fā)揮功能, 使植物體內(nèi)發(fā)生一系列生理生化變化, 進(jìn)而使植物耐受或抵御低溫的脅迫。同時(shí), 低溫導(dǎo)致一些正?；虮磉_(dá)通路受阻, 使體內(nèi)部分原有蛋白質(zhì)的表達(dá)受到抑制(圖3A中1-5, 圖4), 即抑制表達(dá)蛋白點(diǎn)。低溫脅迫下, 相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)和下調(diào)表達(dá), 是植物對(duì)不良生存環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)。

2.5 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

對(duì)低溫脅迫后15個(gè)差異蛋白點(diǎn)檢測(cè)，成功鑒定出11蛋白點(diǎn)，未成功鑒定點(diǎn)4個(gè)，將成功鑒定的11個(gè)蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)與NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比, 獲取差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)的相關(guān)信息(表3), 所鑒定得到的11個(gè)差異蛋白質(zhì)分別為光合作用相關(guān)的蛋白(蛋白點(diǎn)1、5、8、15)、糖代謝相關(guān)的蛋白(蛋白點(diǎn)7)、物質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)的蛋白(蛋白點(diǎn)2、6)和脅迫響應(yīng)的蛋白(蛋白點(diǎn)9、10、13、14)。

橢圓區(qū)域?yàn)榈蜏孛{迫前后差異表達(dá)蛋白點(diǎn)。The elliptical areas denote the differentially expressed proteins before and after low temperature stress.

3 討論

3.1 制備葉片總蛋白樣品及蛋白水化的上樣量是雙向電泳成敗的首要因子

為了完整地獲取某一組織或器官在特定時(shí)期表達(dá)的蛋白種類和數(shù)量, 最大限度地避免蛋白損失和降解, 是雙向電泳成敗的首要環(huán)節(jié)[22]。由于白菜型冬油菜葉片中含有大量的酚類、醌類、多糖類、脂類和色素等植物次生代謝產(chǎn)物, 這些物質(zhì)的存在會(huì)嚴(yán)重干擾第一向IEF[23-25]。所以, 本試驗(yàn)在樣品提取過程中加入適量的PVPP, 有效地減少了上述物質(zhì)對(duì)聚焦過程造成影響, 再通過加大離心力及延長(zhǎng)離心時(shí)間可以除去樣品中的鹽分從而避免因鹽分過高導(dǎo)致聚焦電壓達(dá)不到預(yù)設(shè)電壓的問題。王晉峰等[26]發(fā)現(xiàn), 濃度為80%的丙酮對(duì)蛋白質(zhì)沉淀效果最佳, 因此, 本試驗(yàn)選擇用80%的冷丙酮做最后的抽提, 更加徹底地清洗了提取液中無(wú)機(jī)離子, 減少了由無(wú)機(jī)離子引起的導(dǎo)電性, 并達(dá)到除雜的目的。由于植物細(xì)胞內(nèi)含有蛋白水解酶, 在樣品研磨過程中, 細(xì)胞破碎會(huì)釋放到溶液中, 引起蛋白質(zhì)的水解[27]。所以本試驗(yàn)在蛋白提取液中加入了0.015% PMSF蛋白酶抑制劑, 有效地防止了油菜總蛋白的水解。雙向電泳要求樣品中的蛋白質(zhì)必須完全溶解、解聚、變性和還原, 使蛋白質(zhì)在第一向等電聚焦電泳中有效分離。由于β-巰基乙醇還原能力較差, 且具有特殊臭味、揮發(fā)性強(qiáng), 故本試驗(yàn)采用還原性較強(qiáng)、揮發(fā)性弱的DTT替代, 以充分破壞蛋白質(zhì)間的二硫鍵, 使蛋白更好地分離。在蛋白質(zhì)組學(xué)中, 研究差異蛋白質(zhì)時(shí), 作為比對(duì)兩種狀態(tài)下的總蛋白在上樣量上應(yīng)該處于同一水平。一般情況下, 雙向電泳的蛋白質(zhì)上樣量在0.5~1.2 mg之間。上樣量過高, 一方面導(dǎo)致膠條對(duì)樣品吸收不充分, 產(chǎn)生縱橫條紋, 蛋白點(diǎn)分離效果不好; 另一方面使一些低豐度的蛋白點(diǎn)被高豐度蛋白點(diǎn)所掩蓋, 難以準(zhǔn)確地挖取目標(biāo)蛋白點(diǎn), 導(dǎo)致質(zhì)譜分析的蛋白種類繁多, 鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確。上樣量過低, 一方面不能滿足考馬斯亮藍(lán)顯色的要求[28]; 另一方面會(huì)造成凝膠圖譜中蛋白點(diǎn)模糊不清, 從而導(dǎo)致凝膠圖譜中假陽(yáng)性存在, 給后續(xù)的分析工作帶來困難。所以, 本試驗(yàn)蛋白上樣量為1 mg, 獲得的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)清晰、沒有條紋狀蛋白, 得到了較好的2-DE圖譜, 有利于后續(xù)的分析研究。

3.2 pH 4~7的非線性IPG膠條是白菜型冬油菜葉片總蛋白圖譜分離鑒定的最佳膠條

試驗(yàn)初期采用寬范圍(17 cm, pH 3~10)非線性IPG膠條進(jìn)行了蛋白點(diǎn)的預(yù)分離, 發(fā)現(xiàn)蛋白點(diǎn)主要集中在酸性(pH 4~7)區(qū)域內(nèi), 許多蛋白點(diǎn)呈簇狀出現(xiàn), 未能有效分離, 凝膠圖譜經(jīng)PDQuest 8.0軟件可檢測(cè)到800~900個(gè)蛋白點(diǎn)。但是, 目前大多數(shù)參與植物體生命活動(dòng)(如光合作用、呼吸代謝及響應(yīng)逆境等)的功能蛋白都屬低豐度蛋白[29]。因而本試驗(yàn)選用17 cm, pH 4~7的IPG膠條進(jìn)行蛋白點(diǎn)的分離, 可檢測(cè)到600~700個(gè)蛋白點(diǎn), 雖然損失了一部分蛋白點(diǎn), 但是分離效果明顯優(yōu)于前者, 分離所得蛋白點(diǎn)在凝膠圖譜上分布較為均勻且蛋白點(diǎn)清晰, 為尋找和鑒定與冬油菜抗寒功能相關(guān)的蛋白奠定了基礎(chǔ)。

表3 低溫脅迫下‘隴油7號(hào)’幼苗葉片特異蛋白點(diǎn)MALDI-TOF-TOF MS質(zhì)譜鑒定結(jié)果

3.3 低溫脅迫相關(guān)蛋白的功能分析

3.3.1 光合作用相關(guān)蛋白

放氧增強(qiáng)蛋白(蛋白點(diǎn)1)主要功能是催化水裂解而放出氧氣, 還原質(zhì)體醌, 產(chǎn)生跨膜質(zhì)子電化學(xué)勢(shì)梯度。Sugihara等[30]和Yamada等[31]研究發(fā)現(xiàn), 植物受到低溫、干旱和鹽等逆境脅迫會(huì)導(dǎo)致與光合作用相關(guān)蛋白發(fā)生降解, 使植物光能利用效率下降, 更容易受到光抑制。核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(蛋白點(diǎn)5)是植物光合作用過程中的關(guān)鍵酶, 其活性與光合作用密切相關(guān)[32]。本研究發(fā)現(xiàn)該蛋白點(diǎn)在低溫脅迫后被抑制表達(dá), 說明低溫環(huán)境下, ‘隴油7號(hào)’葉片的光合機(jī)構(gòu)受損, 進(jìn)行光合作用的質(zhì)子傳遞和光合磷酸化過程受到低溫抑制。光系統(tǒng)Ⅱ23 kD外周蛋白(蛋白點(diǎn)15), 結(jié)合于類囊體膜的囊腔側(cè), 具有維持PSⅡ水裂解活性的功能[33]。低溫脅迫后, ‘隴油7號(hào)’葉片為了維持穩(wěn)定的光合速率進(jìn)而誘導(dǎo)外周蛋白的表達(dá)來抵抗低溫脅迫; 碳酸酐酶(蛋白點(diǎn)8), 是細(xì)胞內(nèi)催化CO2可逆水合反應(yīng)的一種含鋅金屬水化酶, 與光合作用密切相關(guān)。鄧秋紅等[33]研究證明碳酸酐酶參與逆境脅迫的生物化學(xué)途徑; 陳虎等[34]以龍眼()為材料, 利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定了CA蛋白, 從蛋白質(zhì)水平研究表明, CA蛋白在低溫脅迫下表現(xiàn)上調(diào), 說明其基因與低溫逆境之間存在一定關(guān)系?！]油7號(hào)’在低溫脅迫后, 碳酸酐酶被誘導(dǎo)表達(dá), 可能是植物為了適應(yīng)低溫脅迫需要能量來維持自身的生長(zhǎng)。

3.3.2 糖代謝相關(guān)蛋白

果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(蛋白點(diǎn)7)是糖酵解和糖異生過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶, 該酶主要參與可溶性糖的合成及響應(yīng)低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá), 可溶性糖作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì), 一方面可以防止細(xì)胞質(zhì)內(nèi)冷凝, 避免形成的冰晶對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械損傷; 另一方面可以維持細(xì)胞內(nèi)滲透壓, 提高組織含水量, 降低細(xì)胞質(zhì)冰點(diǎn), 從而提高植物對(duì)低溫的耐受性。本研究表明, 該酶屬于誘導(dǎo)性表達(dá)蛋白質(zhì)，低溫脅迫后, 該蛋白迅速表達(dá)并積累, 從而保證了‘隴油7號(hào)’葉片響應(yīng)低溫脅迫過程中正常的糖代謝途徑。湯曉麗[35]在擬南芥()的研究中通過表型分析及基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn), 在低溫致死突變體中, 果糖-1,6-二磷酸醛縮酶基因()的表達(dá)明顯上調(diào)。孫得壬[36]研究發(fā)現(xiàn), 在一定閾值的低溫脅迫下, 都會(huì)誘導(dǎo)不同小麥()品種的表達(dá)響應(yīng), 表達(dá)量顯著上調(diào), 從而使相應(yīng)蛋白質(zhì)合成并不斷積累, 這與本研究結(jié)果相類似。

3.3.3 物質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)蛋白

轉(zhuǎn)錄調(diào)控鋅指蛋白(蛋白點(diǎn)2)是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。它可以通過特定的結(jié)構(gòu)域與抗寒靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式調(diào)控元件特異結(jié)合來應(yīng)答外界環(huán)境脅迫[37]。此類蛋白的表達(dá)可使植物更有效地應(yīng)對(duì)低溫脅迫。目前從棉花、矮牽牛()等植物中獲得的該類基因一般都參與植物生長(zhǎng)發(fā)育與抗逆反應(yīng)[38-39]。但是, 在本研究中該蛋白在低溫脅迫后被抑制表達(dá), 說明‘隴油7號(hào)’葉片在長(zhǎng)時(shí)間低溫脅迫后, 葉片組織蛋白的結(jié)構(gòu)域受到破壞, 致使抗寒靶基因未能與蛋白結(jié)構(gòu)域特異結(jié)合。膜聯(lián)蛋白(蛋白點(diǎn)6)是一類Ca2+及磷脂結(jié)合蛋白, 植物細(xì)胞中annexin的研究起步較晚。目前, 已發(fā)現(xiàn)annexin蛋白在植物體廣泛分布, 在植物生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫過程中起重要作用, 主要參與了抗寒反應(yīng)、細(xì)胞分泌、Ca2+代謝、耐鹽脅迫、干旱脅迫以及ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[39]。何美敬等[40]研究發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白在細(xì)胞內(nèi)具有過氧化物酶活性, 可以推測(cè)該蛋白點(diǎn)的誘導(dǎo)表達(dá)?？梢娹D(zhuǎn)錄調(diào)控鋅指蛋白對(duì)于清除低溫脅迫下‘隴油7號(hào)’葉片中積累的活性氧, 以此保證逆境脅迫下物質(zhì)的正常運(yùn)輸具有重要作用。

3.3.4 逆境響應(yīng)相關(guān)蛋白

巰基蛋白酶抑制劑(蛋白點(diǎn)9、10)具有保護(hù)細(xì)胞、組織及器官中蛋白質(zhì)免遭外源蛋白水解酶水解的作用[41]。此外, 研究表明, 蛋白水解酶抑制劑基因的超表達(dá)也能提高轉(zhuǎn)基因植物抗低溫、干旱等非生物脅迫能力。沙冬青()是我國(guó)西北重要的抗逆植物資源, Liu等[42]克隆到了沙冬青低溫誘導(dǎo)基因, 經(jīng)鑒定屬于巰基蛋白酶抑制劑基因。類甜蛋白(蛋白點(diǎn)13)是一種具有多種生物學(xué)活性及重要功能的植物防御蛋白, 植物受到生物或非生物脅迫時(shí), 類甜蛋白在植物組織中迅速表達(dá)并積累, 從而快速提高植物抗性[43]。Hiilovaara等[44]研究發(fā)現(xiàn), 冬黑麥()葉片質(zhì)外體在低溫誘導(dǎo)下分泌的類甜蛋白, 其抗凍活性與抗凍蛋白相同。抗病毒蛋白(蛋白點(diǎn)14), 一方面能夠誘導(dǎo)植物病程相關(guān)蛋白的表達(dá), 此蛋白在低溫脅迫下不斷積累進(jìn)而誘導(dǎo)植株獲得抗寒性[45]; 另一方面能夠誘導(dǎo)其他蛋白或物質(zhì)的產(chǎn)生, 使植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗性, 從而抵御外界脅迫對(duì)植株造成的傷害[46]。本研究中, 低溫下‘隴油7號(hào)’抗寒響應(yīng)相關(guān)蛋白的表達(dá)與積累, 可有效防止低溫對(duì)細(xì)胞生理、結(jié)構(gòu)的損傷, 從而大大提高其抗寒能力。

4 結(jié)論

17 cm、pH 4~7的IPG膠條最適于油菜葉片的蛋白點(diǎn)的分離。低溫脅迫后, 超強(qiáng)抗寒白菜型冬油菜品種‘隴油7號(hào)’葉片部分光合作用相關(guān)蛋白表達(dá)受抑制, 同時(shí)又誘導(dǎo)部分光合作用相關(guān)蛋白的表達(dá), 抑制表達(dá)的蛋白可能是在長(zhǎng)時(shí)間低溫條件下植物組織受到不可逆轉(zhuǎn)的損傷所致。同時(shí), 植物為了維持正常的光合作用, 誘導(dǎo)碳酸酐酶等光合作用關(guān)鍵酶的表達(dá), 維持植株的正常生長(zhǎng); 膜聯(lián)蛋白等物質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)蛋白的表達(dá), 有助于維持細(xì)胞結(jié)構(gòu), 促進(jìn)離子的跨膜運(yùn)輸, 維持植株體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)平衡; 此外, 低溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的類甜蛋白, 與其他逆境響應(yīng)蛋白協(xié)同發(fā)揮作用來抵御低溫的脅迫。由可以推測(cè), 穩(wěn)定的光合作用、高效的物質(zhì)代謝系統(tǒng)以及強(qiáng)大的抗逆防御機(jī)制對(duì)低溫條件下維持超強(qiáng)抗寒品種‘隴油7號(hào)’的生長(zhǎng)起重要的作用。

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Differentially expressed proteins in response to low temperature in‘Long-you No. 7’ seedlings*

CHEN Qi?, YUAN Jinhai?, LIU Zigang**, SUN Wancang, FANG Yan, ZHAO Xinwang, MA Li, PU Yuanyuan, ZHAO Yanning, ZENG Xiucun

(Gansu Research Center of Rapeseed Engineering and Technology / Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement of Gansu Province / Gansu Provincial Key Laboratory of Arid Land Crop Sciences / College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

Successful northward expansion of winter rapeseed depends on breeding of super cold-resistant varieties. The ‘Longyou’ series ofvarieties is cold-resistant, but this mechanism has still not been fully understood. In this study, seedlings of‘Long-you No. 7’ variety (a strong cold-resistant variety) was used to determine the cold-resistance mechanism at proteomic scale. The TCA (trichloroacetic acid)-acetone precipitation method was used to extract total protein in leaves before and after low temperature stress (4 ℃ for 7 days). Then the protein extraction method and different pH range of IPG gels was improved and optimized. Furthermore, by using the two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry methods, the differentially-expressing patterns of total protein in the leaves of ‘Long-you No. 7’ at five-leaf stage under low temperature stress was determined. The results showed that the average concentration of leaf protein extracted with the improved protein extraction solution containing DDT (DL-Dithiothreitol) and PVPP (crosslinking polyvingypyrrolidone) increased by 3.42 μg·μL-1and the desalting time deceased by 1.14 h. This indicated an improvement in extraction efficiency by the addition of DTT and PVPP to protein extraction solutions. In addition, the addition of protease inhibitor containing PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) to protein extraction solutions led to the detection of more protein categories; further increasing the number of protein spots by 11.2% (661 versus 587) in the gel pattern. It was also found that by using 17 cm IPG gel (which isolated proteins in a better way) with pH range of 4–7 at vertical electrophoresis stage, higher quality proteomic maps with good repeatability were produced. By using PDQuest 8.0 software, proteomic expression profile of a strong cold-resistant ‘Long-you No. 7’ seedling before and after low temperature stress was analyzed and a total of 15 differentially-expressed protein spots detected, which was supposedly related to the response to low temperature stress. After further analysis of the protein spots by mass spectrometry, 11 different categories related to low temperature stress were identified, including photosynthesis protein, sugar metabolism protein, material transportation protein and adversity response protein. The findings also showed that the expression level of leaf proteins in ‘Long-you No. 7’ seedlings differed obviously. Such differentially-expressed proteins were probably critical for cold resistance of, which provided a useful basis for further research.

; Long-you No. 7; Low temperature stress;Two-dimensional electrophoresis; Proteomics

10.13930/j.cnki.cjea.160581

Q945.78; Q946

A

1671-3990(2017)03-0381-10

2016-06-30 接受日期: 2016-09-21

* 國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(2015CB150206)、國(guó)家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(2014G10000317)和甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(145RJZG050)資助

** 通訊作者:劉自剛, 主要從事油菜遺傳育種研究。E-mail: lzgworking@163.com

* The study was supported by the National Key Basic Research Program (2015CB150206), the National Agricultural Science and Technology

** Corresponding author, E-mail: lzgworking@163.com

? 同等貢獻(xiàn)者: 陳奇, 主要從事油菜遺傳育種研究, E-mail: 309678971@qq.com; 袁金海, 主要從事油菜遺傳育種研究, E-mail: 954152476@qq.com

Achievements Transformation Project (2014G10000317) and the Gansu Provincial Natural Science Foundation Project (145RJZG050).

? Equal contributors

Jun. 30, 2016; accepted Sep. 21, 2016