關黃柏對對乙酰氨基酚誘導大鼠急性肝損傷的保護作用

劉華，薛娟，唐振球，吳高松，王知斌，王秋紅，匡海學

(黑龍江中醫(yī)藥大學，教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

中藥研究

關黃柏對對乙酰氨基酚誘導大鼠急性肝損傷的保護作用

劉華，薛娟，唐振球，吳高松，王知斌，王秋紅，匡海學*

(黑龍江中醫(yī)藥大學，教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的:研究關黃柏對對乙酰氨基酚(APAP)誘導的大鼠急性肝損傷的保護作用。方法:采用對乙酰氨基酚所致大鼠急性肝損傷模型，給藥24 h后檢測大鼠血清中丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP);留取肝臟組織，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡觀察肝臟組織病理變化;制備肝勻漿，測定肝中還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的含量。結果:與空白組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST和ALP活性明顯升高，肝臟組織出現(xiàn)明顯的肝細胞變性壞死;與模型組相比，不同濃度的關黃柏可以明顯降低小鼠血清中ALT、AST和ALP的活性，降低肝組織中MDA的含量，升高GSH的含量，肝組織病理損傷也明顯減輕。結論:關黃柏對對乙酰氨基酚致小鼠急性肝損傷具有明顯的保護作用。

關黃柏;對乙酰氨基酚;急性肝損傷

關黃柏為蕓香科植物黃檗的干燥樹皮。性苦、寒，歸腎、膀胱經(jīng)。具有清熱燥濕，瀉火除蒸，解毒療瘡功效。用于濕熱瀉痢，黃疽尿赤，帶下陰癢等［1］，具有抗菌、抗真菌、鎮(zhèn)咳、抗肝炎、抗?jié)円约懊庖咭种频人幚碜饔茫?-3］。對于對乙酰氨基酚造成肝損傷，普遍認為原因是由于其在生物轉化過程中產(chǎn)生了大量的氧自由基等毒性代謝產(chǎn)物，與細胞膜結合產(chǎn)生脂質過氧化反應產(chǎn)生大量脂質過氧化產(chǎn)物，肝細胞抗氧化能力下降，進而產(chǎn)生氧化應激損傷［4］。本研究主要是通過對乙酰氨基酚導致的急性肝損傷模型來研究關黃柏對對乙酰氨基酚引起的急性肝損傷的保護作用，為找到對乙酰氨基酚肝損傷的臨床解毒劑提供依據(jù)。

1 材料與動物處理

1.1 實驗藥品

所選用的關黃柏購買于哈爾濱世一堂藥店，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學藥用植物學教研室蘇連杰教授鑒定為蕓香科植物黃檗的干燥根皮。

1.2 實驗試劑及儀器

考馬斯亮藍染料G250(Amesco);雙蒸水(本實驗室采用MilliQ純水儀制備);MDA、GSH、ALT、AST、ALP試劑盒(南京建成生物工程研究所);菜卡2135型切片機(德國);Moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)(美國);電熱恒溫箱(上海);羅氏cobas c311全自動生化分析儀(瑞士);Thermo Scientific Evolution 260 Bio紫外分光光度儀(美國);HITACHI高速離心機(日本)。

1.3 中藥水煎液的制備

按臨床常用方法對藥物進行處理。稱取定量的上述藥材，加入10倍量水，浸泡60 min，快速加熱至沸騰，煎煮60 min，傾出藥液，殘渣再加入8倍水，煎煮提取60 min。合并2次藥液，濾過，黃柏濃縮至含生藥量為1 g/mL的中藥水提液，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組及給藥

雌性SD大鼠36只，體質量(180±20)g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學醫(yī)學實驗動物中心，置于動物飼養(yǎng)籠中，保持室內溫度18～22℃，室內晝夜自然明暗交替照明，飼養(yǎng)標準大鼠飼料。將大鼠隨機分為6組，分別為:空白對照組、聯(lián)苯雙脂陽性藥組(0.3 g/kg)、模型組、關黃柏高劑量組(280 mg/kg)、中劑量組(140 mg/kg)、低劑量組(70 mg/kg)，每組6只。大鼠在鼠籠里適應7天后，空白組給予生理鹽水，連續(xù)灌胃(每 100 g體質量1 ml)15天最后1次給藥30 min后，除正常對照組其余各組均皮下注射對乙酰氨基酚(450 mg/kg)制備大鼠急性肝損傷模型。各組飼養(yǎng)過程中保持溫度、光照、濕度等環(huán)境條件均衡，自由進食飲水。

2.2 樣品制備

各給藥組連續(xù)誘導15天后，實驗取材前一天晚8點大鼠禁食不禁水，次日上午SD大鼠腹腔內注射1%戊巴比妥鈉麻醉(每100 g體質量0.15 ml)，迅速打開腹腔，腹腔采血，從門靜脈注射冰冷的生理鹽水，清除殘留血液，取出肝臟，用冰冷緩沖液洗凈，去除肝臟表面的血液，用濾紙吸干表面液體，切成0.5～1.0 cm3大小，用10%中性福爾馬林固定，以使固定液能迅速而均勻地滲入組織內部，常規(guī)石蠟制片，HE染色，光鏡觀察。

2.3 生化指標檢測

取分離好的血清，采用羅氏Cobas c311全自動生化分析儀上測定丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)。

2.4 檢測肝臟中GSH和MDA的含量

按照實驗方法學上組織勻漿的制備:稱取一定量的肝臟組織，按照肝臟組織重量(g):體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積0.9%的生理鹽水，在冰上進行研磨，制備成10%的勻漿液，3 000 r/min，離心10 min，取上清液進行測定。取10%的勻漿液500 μL根據(jù)試劑盒法對谷胱甘肽(GSH)含量進行測定。在420 nm的吸光度進行測定，單位為mg/g。取10%的勻漿液100 μL，采用TBA(硫代巴比妥酸)在532 nm處測定MDA的含量，單位為μmol/g。GSH和MDA及蛋白質含量測定嚴格按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

3 實驗結果

3.1 生化指標

關黃柏對對乙酰氨基酚致大鼠血清ALP、ALT和AST中的影響結果見圖1(A-C)。肝臟是最大的解毒器官，ALT主要存在于肝臟、心臟和骨骼肌中，AST作為重要的轉氨酶之一，臨床上是肝功能檢查的指標，主要用來判斷肝臟是否受到損傷。主要分布在心、肝、腎和骨骼肌中。ALT和AST是肝內的主要功能酶，在肝細胞或者組織損傷及壞死時，肝細胞膜通透性增加，轉氨酶從細胞內溢入血液，使得血清相關轉氨酶的水平顯著升高。ALP是一組催化磷酸單酯水解的酶類，分布范圍比較廣，主要存在肝臟、骨骼、腎臟等組織中，是從肝臟經(jīng)膽汁排泄的一種酶。中藥導致肝毒性時，使膽汁排泄受到抑制，造成血清ALP升高。臨床上ALT、ALP和AST是肝毒性的重要指標。我們的實驗結果表明，與正常對照組相比較，模型組血清ALT、AST和ALP均顯著升高，具有顯著差異(P＜0.01)。不同濃度黃柏及陽性藥可以顯著降低模型組的大鼠血清轉氨酶，具有極顯著差異(P＜0.01)。其中高濃度關黃柏作用最強，表現(xiàn)出較好的保肝效果。

表1 各組ALT、AST、ALP水平比較(±s，n=6)

表1 各組ALT、AST、ALP水平比較(±s，n=6)

注:與空白組相比，*P＜0.01;與模型組相比，＊＊P＜0.01。

組別ALT AST ALP正常組18.96±4.96 58.23±8.12 43.13±6.11模型組 62.06±9.54*84.12±10.07*79.12±9.04*陽性藥組 28.57±6.32＊＊60.42±7.16＊＊59.67±7.29＊＊低劑量組 30.09±7.12＊＊60.72±7.25＊＊48.87±6.11＊＊中劑量組 27.45±5.12＊＊48.97±5.21＊＊44.34±5.38＊＊高劑量組 20.62±4.11＊＊48.17±6.09＊＊39.92±6.20＊＊

3.2 對大鼠肝組織還原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的影響

關黃柏對對乙酰氨基酚致大鼠肝組織GSH和MDA的影響結果見圖2。GSH是機體內主要的抗氧化劑和自由基清除劑，主要的功能是清除自由基、抗衰老、抗氧化。具體機制是與自由基、重金屬等結合，使機體內有毒的物質轉化為無毒的物質，排出體外，同時對抗自由基對臟器組織的損害，保護肝細胞［5］。實驗研究表明，與空白組比較，模型組GSH含量降低，具有顯著差異(P＜0.01)。與模型組比較，不同濃度的關黃柏組可以顯著地提高 GSH水平，具有顯著差異(P＜0.01)，說明關黃柏能保護肝細胞免受氧化應激損傷。關黃柏可通過升高肝臟GSH水平有效的減輕或消除對氨基酚肝臟毒性、改善肝細胞壞死程度。

圖1 血清ALP(A)，ALT(B)和AST(C)在各實驗組大鼠的活性(n=6)

在生物體內，MDA是自由基氧化的最終產(chǎn)物之一，MDA增多能加劇膜的損傷，可引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細胞毒性。因此在肝損傷中MDA含量是一個常用指標，可通過MDA含量了解過氧化的程度［6-8］，以間接測定損傷程度。實驗研究表明，與空白組比較，模型組MDA含量升高，具有顯著差異(P＜0.01)。與模型組比較，黃柏能顯著地降低MDA水平，具有顯著差異(P＜0.01)。其中關黃柏組與空白組比較MDA降低，有顯著性差異(P＜ 0.01)，GSH水平升高，具有顯著差異(P＜0.01)。

表2 各組GSH、MDA水平比較(±s，n=6)

表2 各組GSH、MDA水平比較(±s，n=6)

注:與空白組相比，*P＜0.01;與模型組相比，＊＊P＜0.01。

組別GSH MDA正常組6.38±1.01 2.01±0.41模型組 3.73±0.50*4.41±0.86*陽性藥組 6.35±1.16＊＊2.24±0.62＊＊低劑量組 6.44±1.05＊＊2.52±0.67＊＊中劑量組 6.53±1.03＊＊2.34±0.77＊＊高劑量組 6.97±1.24＊＊2.26±0.62＊＊

圖2 肝組織中GSH，MDA在各實驗組大鼠的活性(n=6)

3.3 肝組織細胞的病理學變化

光鏡下觀察空白組肝細胞排列整齊，沒有出現(xiàn)脂肪樣變性，肝小葉結構完整，沒有發(fā)生病理改變(圖3-A)。模型組肝細胞間間隙有大量炎癥細胞，肝組織可見局部點狀、片狀水腫變(圖3-B)。陽性藥及不同濃度的關黃柏可改善對對氨基酚引起的大鼠肝組織細胞形態(tài)變化，陽性藥及低、中、高濃度的關黃柏對肝臟病理損害改善較為明顯(圖3C～F)。

圖3 不同組別的HE染色病理切片圖(×400)

4 討論

對乙酰氨基酚是建立肝損傷的常用模型藥物，而血清學指標ALT，AST，ALP是反應肝實質損害的常見的主要酶學指標，所以本實驗選用對乙酰氨基酚作為造模藥物，用ALT，AST，ALP作為判斷肝損傷的程度［9］。從本實驗結果可以看出，模型組小鼠血清的3個酶學指標均顯著增高，表明小鼠肝臟受到損害，肝損傷模型是成功的。而給予不同濃度的關黃柏小鼠的酶學指標均顯著降低，并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴關系。經(jīng)過檢測肝功能指標和病理結果表明，關黃柏具有明顯的減毒效果，隨著濃度增加，效果更加明顯肝臟是最大的解毒器官，體內的代謝及去除毒素都在肝臟中完成，因而肝臟易受多種有害因素攻擊。肝損傷主要是由于細胞膜的氧化損傷或生物轉化異常導致［10］，對乙酰氨基酚具有抑制肝臟中的GST，升高MDA的活性，說明其毒性作用的產(chǎn)生與抗氧化酶相關。關黃柏對對乙酰氨基酚造成的肝損傷具有保護作用，能減輕肝細胞壞死，防止纖維化和脂肪變性，同時可以提高肝臟內GSH和降低MDA活性，能保護對氨基酚引起的肝細胞膜脂質過氧化損傷，提高肝細胞存活率，增強機體抗氧化作用。

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Protective Effect of Phellodendri Amurensis Cortex on Acetaminophen-induced Acute Hepatic Injury in Rats

LIU Hua，XUE Juan，TANG Zhen-qiu，WU Gao song，WANG Zhi-bin，WANG Qiu-hong，KUANG Hai-xue*
(Key Laboratory of Chinese Materia Medica(Ministry of Education)，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)

Objective:To investigate the protective effect of Phellodendri Amurensis Cortex on acetaminopheninduced acute hepatic injury in rats.Methods:Liver injury models were induced by subcutaneous injection of acetaminophen.Twenty-four hours later，the activities of serum alanine aminotransferase(ALT)，aspartate aminotransferase(AST)and alkaline phosphatase(ALP)were determined，and the liver tissues were collected for histopathological assessment by HE staining under light microscope.The contents of glutathione(GSH) and malondialdehyde(MDA)in liver homogenate were also measured.Results:Compared with the normal control group，the model group could markedly increase serum ALT，AST and ALP activities，and the degeneration and necrosis could be observed in liver tissues.Compared with the model group，Phellodendri Amurensis Cortex could markedly decrease serum ALT，AST and ALP activities，reduce the MDA level in liver homogenate，and increase the content of GSH in the liver homogenate.The hepatic histopathological changes in liver were also significantly ameliorated.Conclusion:The Phellodendri Amurensis Cortex can prevent the liverfrom acetaminophen-induced acute hepatic injury.

Phellodendri Amurensis Cortex;Acetaminophen;Acute hepatic injury

R285.6

A

1002-2406(2017)02-0001-04

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973)項目(No.2013CB531801);國家自然科學基金面上項目(No.81473351)

劉華(1990-)，男，碩士研究生，主要從事中藥藥效物質基礎研究工作。

匡海學*(1955-)，男，教授，博士研究生導師，主要從事中藥性味理論和中藥藥效物質基礎研究工作。

2016-07-19

修回日期:2016-08-01