葛含靜

(陜西學(xué)前師范學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院， 陜西西安 710100)

■自然科學(xué)研究

一株纖維素高產(chǎn)菌株的選育及其鑒定

葛含靜

(陜西學(xué)前師范學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院， 陜西西安 710100)

細(xì)菌纖維素具有高結(jié)晶度、生物可降解性和合成可調(diào)控性等優(yōu)良特性，被公認(rèn)是一種性能最好的纖維素，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)、造紙、聲學(xué)等領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)室自制蕎麥醋自然放置一段時(shí)間，液面上長(zhǎng)出厚厚的凝膠狀膜，經(jīng)成分分析，確定其為纖維素，結(jié)晶度為78%，Iα型纖維素含量為60%。取該蕎麥醋的醪液，經(jīng)富集、分離、初篩和復(fù)篩等，最終從108個(gè)單菌落中篩選出1株性能穩(wěn)定的纖維素高產(chǎn)菌株J2，纖維素產(chǎn)量可達(dá)87.62 g/L(濕重)。通過(guò)形態(tài)學(xué)與基于16S rRNA序列的分子生物學(xué)鑒定，確定菌株J2為漢森氏葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter hansenii，GenBank登錄號(hào)為GU213109)。

細(xì)菌纖維素；菌株；鑒定

細(xì)菌纖維素是某些海洋生物(如被囊綱動(dòng)物)和細(xì)菌(醋酸桿菌、假單孢桿菌、 土壤桿菌、無(wú)色桿菌、八疊球菌等菌屬的細(xì)菌)代謝產(chǎn)物，由β-1,4-D-吡喃葡萄糖聚合而成，不摻雜任何其他形式的多糖，純度極高[1]。與普通植物纖維相比，BC機(jī)械強(qiáng)度高、吸水保水率高、生物適應(yīng)性良好，被認(rèn)為是性能最好的纖維素，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、造紙、石油開采等領(lǐng)域[2]。

目前，學(xué)術(shù)界對(duì)BC的合成研究主要是圍繞培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化、菌株的代謝工程改造、高產(chǎn)菌株的自然選育及誘變選育等方面展開。陳軍等[3]利用糖廠副產(chǎn)物——酸化糖蜜生產(chǎn)BC，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量顯著提高，且用紅茶菌的復(fù)合菌種能更高效地利用碳源。夏露等[4]利用甲醇廢水發(fā)酵生產(chǎn)BC，以木醋桿菌靜態(tài)發(fā)酵，BC產(chǎn)量較低。楊雪霞等[5]研究發(fā)現(xiàn)剪切力會(huì)影響纖維素產(chǎn)生菌的形態(tài)和生物量，不利于BC 合成。翁媛媛等[6]以惰性吸附載體固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)BC，避免剪切力的同時(shí)使固液界面的表面積增加了，BC產(chǎn)量為液態(tài)靜置發(fā)酵產(chǎn)量的 3 倍，但后處理難度增加了很多。Carolina等[7]對(duì)Ga.hanseniiATCC23769纖維素合成酶操縱子中部分基因進(jìn)行克隆，采用過(guò)表達(dá)這些基因以期提高BC產(chǎn)量。周勝虎等[8]從腐爛的水果中自然分離得到BC產(chǎn)生菌JX303335。余曉斌等[9]和杜雙奎等[10]分別通過(guò)紫外誘變和高靜水壓誘變方法實(shí)現(xiàn)了BC高產(chǎn)突變株的成功選育。盡管BC生物合成的研究在各個(gè)方面都取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，但從源頭上自然篩選出性能穩(wěn)定的BC高產(chǎn)菌株，優(yōu)化其發(fā)酵條件，表征所產(chǎn)BC性能指標(biāo)，仍具有重要的研究意義。

本研究成功篩選出了1株BC產(chǎn)量高且傳代穩(wěn)定的菌株J2，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，同時(shí)，對(duì)菌株J2所產(chǎn)BC的超微結(jié)構(gòu)和超分子結(jié)構(gòu)也做了鑒定，為后續(xù)通過(guò)誘變或基因工程方法選育優(yōu)良的BC產(chǎn)生菌株奠定了基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)室自制蕎麥醋。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

細(xì)菌基因組提取試劑盒、2000 bp DNA marker和Ex Taq酶，均購(gòu)自日本TakaRa公司。DNA膠純化及回收試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Amersham Biosciences公司。細(xì)菌16S rRNA通用擴(kuò)增引物F9/R1510及測(cè)序引物F9，R1510和F520，上海生工合成。其它試劑均為分析級(jí)或生物級(jí)。

1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母膏5 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 10 g/L，無(wú)水乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%，制霉素0.05 g/L，pH值自然。

基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母膏5 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 15g/L，無(wú)水乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%，pH值自然。分離培養(yǎng)基和斜面保藏培養(yǎng)基同基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基，加瓊脂 1.7%。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母膏5 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 10 g/L，無(wú)水乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%，pH值自然。

所有培養(yǎng)基均在121 ℃ 高壓滅菌15 min后備用。

2 方法

2.1 菌種篩選

按照微生物自然篩選的方法，進(jìn)行富集、分離、初篩和復(fù)篩，篩選出纖維素產(chǎn)量最高且穩(wěn)定的菌株[11]。

BC產(chǎn)量的測(cè)定：將活化的種子液按10%接種量(體積分?jǐn)?shù))接入1 L發(fā)酵培養(yǎng)基，8層滅菌紗布封口，30 ℃靜置培養(yǎng)5 d，測(cè)定處理后的BC產(chǎn)量。BC處理方法：用蒸餾水過(guò)夜沖洗BC膜，然后浸泡于0.5 M NaOH溶液中煮至乳白色半透明狀[12]。處理后的BC膜在濾紙上瀝干，稱重(即BC濕重)；將瀝干的BC膜在烘箱中于105 ℃烘至恒重，稱重(即BC干重)。纖維素產(chǎn)量用g纖維素/L培養(yǎng)液表示。

2.2 凝膠狀膜成分分析[11]

定性分析：在培養(yǎng)皿中放入一張新的載玻片，倒入蒸餾水，能覆蓋載玻片即可。挑取培養(yǎng)2 d的凝膠狀膜，自然平展于載玻片上，取出載玻片并晾干，向膜上滴66.5%的硫酸，然后用碘液染色，在顯微鏡下觀察顯色情況。

酶解試驗(yàn)：取凝膠狀膜，于105 ℃烘干至恒重，準(zhǔn)確稱取0.5000 g，剪碎，加入纖維素酶溶液中，55 ℃長(zhǎng)時(shí)間保溫，若溶液變清亮且烘干后膜的重量減輕90%以上，則可確定凝膠狀膜主要成分為纖維素。

2.3 BC結(jié)構(gòu)鑒定

超微結(jié)構(gòu)表征：用掃描電子顯微鏡(Scanning electronic microscope，SEM)觀察。BC干膜用雙膠碳導(dǎo)電帶安裝在一截銅段上，用鉑涂層設(shè)備為BC膜涂鉑，室溫進(jìn)行掃描電鏡拍照。

超分子結(jié)構(gòu)表征：用固態(tài)13C-核磁共振光譜(Nuclear magnetic resonance，NMR)測(cè)定過(guò)夜水洗并烘干的纖維素的結(jié)晶度和晶體類型。測(cè)試頻率75.46 MHz，脈沖寬度38 KHz，接觸時(shí)間1 ms，轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速5～6 KHz，轉(zhuǎn)角54.7°，循環(huán)時(shí)間3 s。每個(gè)光譜2400次掃描。

2.4 菌種鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：取對(duì)數(shù)期菌體，結(jié)晶紫染色后用光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)；同時(shí)，取對(duì)數(shù)期菌體劃線接種于種子培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落形態(tài)。

分子生物學(xué)鑒定：用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取BC產(chǎn)生菌株基因組DNA。以基因組為模板，F(xiàn)9/R1510為引物擴(kuò)增16S rRNA序列。產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，由上海生工測(cè)序。序列在國(guó)際核酸數(shù)據(jù)庫(kù)( NCBI) 中進(jìn)行Blast同源性比對(duì)，用MEGA4繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合表型特征確定其生物學(xué)地位。

3 結(jié)果與討論

3.1 BC產(chǎn)生菌株篩選

涂布分離得到108個(gè)單菌落(依次編號(hào)J1，J2，…，J108)。初篩發(fā)現(xiàn)，有9株菌能產(chǎn)凝膠狀膜，3株所產(chǎn)凝膠狀膜松軟、有空洞。對(duì)能產(chǎn)膜的9株菌連續(xù)5代傳代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)編號(hào)J2的菌株的每一代培養(yǎng)物性狀穩(wěn)定、凝膠狀膜產(chǎn)量最高(平均87.62 g/L)，且膜外觀結(jié)實(shí)、平滑、有彈性。

3.2 凝膠狀膜成分分析

被染色為深藍(lán)色的物質(zhì)在顯微鏡下呈無(wú)規(guī)則層狀分布，包裹著未染色的桿狀菌體細(xì)胞。初步判斷，凝膠狀膜主要成分為纖維素。酶解50 h后溶液變清亮，酶解前膜重0.5002 g，酶解后重0.0236 g，因此，纖維素含量為(0.5002-0.0236)/0.5002=95.28%?？梢源_定，凝膠狀膜的主要成分為纖維素。

3.3 BC結(jié)構(gòu)鑒定

超微結(jié)構(gòu)：如圖1，堿煮處理的BC中菌體殘留更少；水洗與堿煮后BC超微結(jié)構(gòu)沒有變化，說(shuō)明純化方法對(duì)纖維素的微觀結(jié)構(gòu)沒有影響，這與Brigid等[13]的研究結(jié)果一致。此外，BC的微纖維直徑不足0.1 μm，呈密集網(wǎng)狀，很多根微纖維組成纖維絲帶，進(jìn)而形成不計(jì)其數(shù)的不規(guī)則、相互疊加的孔穴，即三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)持水保水性能良好，也有利于吸附有機(jī)試劑，故BC可用作吸水材料和吸附材料，用于食品加工及藥物緩釋體系中[14]。

1.水洗處理BC；2.NaOH處理的BC圖1 菌株J2所產(chǎn)BC的SEM圖

超分子結(jié)構(gòu)：對(duì)比天然纖維素的NMR圖譜(圖2)，圖3中信號(hào)均為纖維素信號(hào)，說(shuō)明菌株J2所產(chǎn)BC純度高；結(jié)晶度達(dá)78%，Iα型纖維含量達(dá)60%。生物材料的結(jié)晶度與其拉伸性能、尺寸穩(wěn)定性及密度呈正相關(guān)[15]，故菌株J2所產(chǎn)BC拉伸性能及尺寸穩(wěn)定性良好、密度高。Iα型是纖維素的亞穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)，在一定條件下可轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的Iβ晶型，BC具有很強(qiáng)的生物適應(yīng)性且在環(huán)境中易于分解，很可能是由于其中Iα型纖維含量高[16]。因此，與高等植物相比(Iα型纖維含量為30%[17])，菌株J2所產(chǎn)BC生物適應(yīng)性良好。

圖2 天然纖維素的13C-NMR圖譜[18]

圖3 菌株J2所產(chǎn)BC的13C-NMR圖譜

3.4 菌種鑒定

3.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

J2菌體細(xì)胞呈桿狀，單個(gè)或成對(duì)，大小為(2.12～4.18)μm×(0.81～0.92)μm；菌落呈圓形，表面光滑，凸起，不透明，乳白色，大小為0.9～1.4 mm，見圖4，可初步判斷菌株J2為醋酸桿菌屬。

圖4 菌株J2菌體細(xì)胞形態(tài)(×1000)和菌落形態(tài)

3.4.2 分子生物學(xué)鑒定

對(duì)菌株J2進(jìn)行16S rRNA序列擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析，如圖5和圖6，菌株J2與菌株Ga.hanseniiNBRC14817、Ga.hanseniiNBRC14816和Ga.hanseniiNBRC14820同枝，相似度達(dá)100%。

M，DNA Marker DL2000圖5 菌株J2的16S rRNA基因

圖6 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的菌株J2的系統(tǒng)發(fā)育樹

微生物的分類鑒定從來(lái)沒有一個(gè)黃金指標(biāo)。表型特征雖可進(jìn)行表型分群，但分類學(xué)結(jié)果不夠精準(zhǔn)，故而只能用于描述微生物的表型性狀特征。遺傳學(xué)分類法，即根據(jù)核酸分析得到的遺傳相關(guān)性所做的分類，以決定生物表型特征的遺傳特征DNA和RNA作為比較的準(zhǔn)繩，是一種更客觀和高度可信的分類方法。因此，表型鑒定與遺傳學(xué)分類法結(jié)合，可以更為準(zhǔn)確地對(duì)未知微生物進(jìn)行分類鑒定。故結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定與基于16S rRNA序列擴(kuò)增的分子生物學(xué)鑒定，即可確定，菌株J2是漢森氏葡糖醋桿菌(Ga.hansenii)。

4 結(jié)論

本研究從實(shí)驗(yàn)室自制蕎麥醋中自然分離出一株性能良好的BC高產(chǎn)菌株J2，其BC結(jié)晶度為78%，Iα型纖維含量為60%，表明BC密度高，拉伸性、尺寸穩(wěn)定性和生物適應(yīng)性均良好。通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定與基于16S rRNA序列的分子生物學(xué)鑒定，確定菌株J2為漢森氏葡糖醋桿菌(Ga.hansenii)。

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[學(xué)術(shù)編輯 趙大洲]

[責(zé)任編輯 朱毅然]

Study on Inscreening and Identification of a High-yield Bacterial Cellulose-producing Strain

GEHan-jing

(CollegeofLifeScienceandFoodEngineering，ShaanxiXueqianNormalUniversity，Xi’an710100，China)

It was universally accepted that bacterial cellulose(BC) was the best cellulose of high crystallinity，well biodegradability，synthesis of controlled，etc. So it was widely used in the areas of food，medicine，paper making and acoustics etc. There was thick gelatinous membrane on the surface of the lab homemade buckwheat vinegar after natural placement for a period of time. The analysis results showed that the membrane was BC. And the crystallinity index was 78%，and the cellulose Iα contents was 60%. A high-yield BC-producing strain with about 87.62 g/L wet weight and stable characteristics named J2 was isolated from 108 strains screened in the vinegar by enrichment cultivation，separation，initial screening and re-screening. At last，strain J2 was identified asGluconacetobacterhansenii(GenBank accession GU213109)by morphological identification and molecular identification based on 16S rRNA sequence.

bacterial cellulose;strain;identification

2016-11-06;

2016-11-26

陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2016JQ3036)；陜西學(xué)前師范學(xué)院校級(jí)科研項(xiàng)目(2015YBKJ027)

葛含靜，女，陜西咸陽(yáng)人，陜西學(xué)前師范學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院講師，工學(xué)博士，主要研究方向：糧食工程與發(fā)酵技術(shù)創(chuàng)新、營(yíng)養(yǎng)學(xué)。

Q19

A

2095-770X(2017)03-0144-05

http://sxxqsfxy.ijournal.cn/ch/index.aspx

10.11995/j.issn.2095-770X.2017.03.032