楊 娟 ， 吳海濱 ， 黃 超 ， 譚 珊 ， 吳培福

(西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明650224)

昆明市區(qū)雞源大腸桿菌毒力基因的流行特征試驗(yàn)

楊 娟 ， 吳海濱 ， 黃 超 ， 譚 珊 ， 吳培福

(西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明650224)

大腸桿菌致病性及其攜帶毒力基因的種類存在相關(guān)性，為此，研究大腸桿菌毒力基因的流行特征對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐和食品安全具有指導(dǎo)意義。本研究從昆明市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)隨機(jī)采集雞肝，從中分離鑒定大腸桿菌，并對(duì)12種毒力基因的流行特征進(jìn)了研究。結(jié)果表明：從雞肝中共分離鑒定出140株大腸桿菌；feoB毒力基因攜帶率為100%；fimA和traT毒力基因攜帶率均為99.29%；papC毒力基因檢出率最低為21.43%。91.67%毒力基因檢出率在50%以上，33.33%毒力基因在90%以上，同時(shí)攜帶12種毒力基因的概率為3.57%。提示：昆明市各區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)雞肝中大腸桿菌毒力基因攜帶率高。

禽源大腸桿菌 ； 毒力基因 ； 流行特征

禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸埃希菌引起的一種傳染性疾病。禽大腸桿菌的致病性由APEC的多種毒力基因共同決定。當(dāng)細(xì)菌侵入機(jī)體并發(fā)病時(shí)，這些毒力因子相互協(xié)調(diào)、共同作用。到目前為止，已知的毒力因子有：溫度敏感血凝素、粘附素、鐵離子獲得系統(tǒng)(耶爾森菌強(qiáng)毒力島、氣桿菌素)、Iss蛋白、腸細(xì)胞脫落位點(diǎn)毒力島、毒素、ColV和ColBM質(zhì)粒等[1]。與毒力因子相關(guān)的毒力基因決定了大腸桿菌的致病性[2]。本試驗(yàn)對(duì)140株禽源性大腸桿菌分離菌進(jìn)行irp2、fimA、papC、iss、tsh、fyuA、feoB、iroN、iucC、iutA、cvaC、traT 12種毒力基因的PCR檢測(cè)，目的在于了解禽源大腸桿菌分離株中毒力基因的攜帶情況，進(jìn)一步探明毒力基因與菌株致病性的相關(guān)性，為禽源性大腸桿菌致病機(jī)理的研究及制定有效的防制措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 雞肝(2015年5月分別隨機(jī)采集于昆明市呈貢區(qū)、官渡區(qū)、盤龍區(qū)、西山區(qū)、五華區(qū)的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，每區(qū)3個(gè)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，每個(gè)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)至少采集8個(gè)雞肝，共310個(gè))；LB固體培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，均購(gòu)自昆明碩陽(yáng)科技有限公司。

1.2 大腸桿菌分離與鑒定 本試驗(yàn)對(duì)雞肝中其他種的細(xì)菌也進(jìn)行了分離，故先采用LB固體培養(yǎng)基分離細(xì)菌，而后利用麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基來(lái)初步篩選大腸桿菌，最后利用PCR技術(shù)和生化試驗(yàn)進(jìn)一步鑒定大腸桿菌。PCR鑒定(Uid和16S rRNA基因)所用引物參見(jiàn)文獻(xiàn)[3-4]。生化試驗(yàn)包括：糖發(fā)酵試驗(yàn)(葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖)、明膠液化試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、吲哚(靛基質(zhì))試驗(yàn)、甲基紅(M.R.)試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)。

1.3 毒力基因的擴(kuò)增 通過(guò)全菌裂解法提取大腸桿菌基因組DNA，并對(duì)12種毒力基因的流行情況進(jìn)行了檢測(cè)。12種毒力基因包括：feoB、traT、fimA、fyuA、irp2、roN、iucC、tsh、iutA、iss、cvaC和papC。擴(kuò)增引物及參數(shù)參考文獻(xiàn)[7]，由鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌分離鑒定 總共分離到504株細(xì)菌，最終鑒定出140株大腸桿菌，檢出率為27.78%。分離的大腸桿菌在麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為表面光滑、邊緣整齊、圓形隆起的紅色菌落；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上為黑色帶金屬光澤的菌落；革蘭染色均為陰性，生化鑒定特征符合大腸桿菌的特性(見(jiàn)表1)。大腸桿菌兩種基因的PCR鑒定均為陽(yáng)性，條帶大小與預(yù)計(jì)大小一致。

表1 140株大腸桿菌生化鑒定結(jié)果

⊕：產(chǎn)酸產(chǎn)氣；+：陽(yáng)性；-：陰性

2.2 昆明市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)大腸桿菌毒力基因分布 本研究對(duì)140株大腸桿菌12個(gè)毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。編碼介導(dǎo)鐵攝取的feoB的檢出率最高，為100%；編碼與血清抵抗相關(guān)的外膜蛋白的traT基因和與I型菌毛相關(guān)的fimA基因檢出率次之，為99.29%；編碼P菌毛的papC基因檢出率最低為21.43%。91.67%的毒力基因檢出率在50%以上。

昆明市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)各區(qū)大腸桿菌feoB毒力基因全部檢出。cvaC、irp2基因西山區(qū)檢出率低于其他區(qū)，而iroN和iutA基因西山區(qū)的檢出率高于其他區(qū)，iss毒力基因在五華區(qū)和西山區(qū)的檢出率相差不大，均低于其他區(qū)。papC、tsh基因分別在五華區(qū)、盤龍區(qū)檢出率最低。各區(qū)的feoB、fimA、fyuA、iroN、irp2、iucC、iutA、traT基因檢出均在50%以上。每個(gè)區(qū)的papC毒力基因檢出率在50%以下。

表2 大腸桿菌相關(guān)毒力基因的分布

注：A：呈貢區(qū)；B：官渡區(qū)；C：盤龍區(qū)；D：五華區(qū)；E：西山區(qū)

2.3 毒力基因數(shù)量分布情況 見(jiàn)表3。

表3 毒力基因數(shù)量分布情況

本試驗(yàn)中每株大腸桿菌同時(shí)攜帶不少于5個(gè)毒力基因，大于20株同時(shí)攜帶8～11個(gè)毒力基因。5株(3.57%)同時(shí)攜帶12個(gè)毒力基因(見(jiàn)表3)。

同時(shí)攜帶HPI強(qiáng)毒力島的標(biāo)志基因fyuA和irp2兩個(gè)基因的檢出率為81.43%。31.43%的菌株同時(shí)攜帶不少于4個(gè)毒力基因(iss、irp2、papC、tsh、cvaC)。134株至少含有2個(gè)以下iutA、iss、tsh、iroN、irp2、cvaC 6種毒力基因。

3 討論

大腸桿菌病屬人獸共患病，發(fā)病機(jī)制不僅與血清型有關(guān)還與所攜帶的毒力基因有關(guān)[3]。根據(jù)以往研究對(duì)APEC、EPEC、EHEC、ETEC、UPEC及非致病性大腸桿菌的毒力基因比較分析，證明APEC至少含有以下4個(gè)毒力基因：astA、iss、irp2、papC、iucD、tsh、vat、cva/cvi，而禽非致病性大腸桿菌的含量少于3個(gè)毒力基因[5]。由此可見(jiàn)，對(duì)禽致病性大腸桿菌毒力基因的種類和攜帶率進(jìn)行檢測(cè)具有重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

董向磊[6]對(duì)APEC的feoB、traT、iroN、iucC毒力基因的檢出率分別為：97.6%、87.43%、76.64%、74.85%。王利勤[7]對(duì)APEC的tsh、iutA、iss、papC毒力基因檢出率分別為：61.8%、70.3%、55.6%、20%。李葉芳等對(duì)APEC的irp2和fyuA檢出率都為100%[8]。本試驗(yàn)檢測(cè)了禽源性大腸桿菌毒力基因的攜帶率，得出了feoB(100%)、traT(99.29%)、iroN(75.29%)、tsh(65%)、papC(21.43%)、iss(58.57%)、iucC(73.57%)、iutA((62.14%)、irp2(87.14%)、fyuA(92.86%)，與上述研究基本一致。

金文杰等研究發(fā)現(xiàn)，禽源致病性大腸桿菌中fyuA+irp2基因的檢測(cè)率為44.9%[9]。Ons等研究發(fā)現(xiàn)，雞源致病性大腸桿菌fyuA毒力基因檢出率為53.1%[10]。王利勤研究發(fā)現(xiàn)，雞源致病性大腸桿菌分離株的irp2、fyuA基因的檢出率分別為66.6%、77.8%，fyuA+irp2基因的檢出率為60.9%[7]。本試驗(yàn)對(duì)fyuA、irp2毒力基因的檢出率分別為92.86%、87.14%，fyuA+irp2基因的檢出率為81.43%。均比上述試驗(yàn)結(jié)果偏高。這說(shuō)明昆明市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)禽源性大腸桿菌中HPI的攜帶率高，與菌株的致病性密切相關(guān)。

本試驗(yàn)對(duì)昆明市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)各區(qū)大腸桿菌毒力基因進(jìn)行了檢測(cè)，除feoB、fimA、traT基因外，其他基因在每個(gè)區(qū)存在很大差異，這間接反映了昆明市各農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)雞來(lái)源可能不同，同時(shí)反映出昆明市周邊地區(qū)雞場(chǎng)致病性大腸桿菌的攜帶率亦可能不同。

綜上所述，昆明市各農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)雞肝大腸桿菌的毒力基因之間存在差異，并且大腸桿菌的致病性與毒力基因攜帶的種類和攜帶率有關(guān)，大腸桿菌攜帶毒力基因的種類越多、攜帶率越高致病性越強(qiáng)。本試驗(yàn)對(duì)禽源性大腸桿菌的流行病學(xué)調(diào)查和毒力基因的攜帶率提供了一定的理論依據(jù)。

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2016-01-20

云南省優(yōu)勢(shì)特色重點(diǎn)學(xué)科生物學(xué)建設(shè)項(xiàng)目(50097505)；云南省高校林下生物資源保護(hù)及利用科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(51400605)

楊娟(1992-)，女，碩士生，研究方向?yàn)閯?dòng)物疫源疫病，E-mail：m18788189620@163.com

吳培福，E-mail：jed-wu2008@126.com

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0529-6005(2017)02-0086-02