亞硒酸鈉對谷氨酸所致神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制

王娟，買莉，王李瑤，常越，景麗

(1寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川750004；2銀川市婦幼保健院；3陜西省中醫(yī)院)

亞硒酸鈉對谷氨酸所致神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制

王娟1，買莉2，王李瑤3，常越1，景麗1

(1寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川750004；2銀川市婦幼保健院；3陜西省中醫(yī)院)

目的觀察亞硒酸鈉對谷氨酸(Glu)所致神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響，并探討其機(jī)制。方法將HT22神經(jīng)細(xì)胞分成3組，對照組加入細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，Glu組加入6 mmol/L Glu和細(xì)胞培養(yǎng)液共同培養(yǎng)，亞硒酸鈉組加入100 nmol/L亞硒酸鈉、6 mmol/L Glu和細(xì)胞培養(yǎng)液共同培養(yǎng)。MTT法檢測各組6、10、24 h的細(xì)胞增殖抑制率；倒置顯微鏡觀察細(xì)胞大體形態(tài)，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；采用氧自由基(ROS)特異性標(biāo)記探針DHE對各組細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，用熒光電子顯微鏡觀察DHE表達(dá)。結(jié)果Glu組培養(yǎng)6 h時(shí)的細(xì)胞增殖抑制率為8.71%±0.009%，10、24 h時(shí)細(xì)胞增殖抑制率較6 h時(shí)升高，24 h時(shí)最高；亞硒酸鈉組各時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率均較Glu組降低(P均<0.05)。倒置顯微鏡下可見Glu組細(xì)胞數(shù)量較對照組減少，細(xì)胞皺縮、形態(tài)不規(guī)則，亞硒酸鈉組細(xì)胞數(shù)量較Glu組數(shù)量增多；透射電鏡下可見Glu組細(xì)胞凋亡數(shù)目較對照組增加，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷加重，亞硒酸鈉組細(xì)胞凋亡數(shù)量較Glu組減少。熒光電子顯微鏡觀察顯示，Glu組較對照組DHE染色的平均光密度增加，亞硒酸鈉組DHE染色較Glu減輕(P均<0.01)。結(jié)論硒能夠減輕Glu對神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用，其機(jī)制可能與減少ROS產(chǎn)生有關(guān)。

硒；亞硒酸鈉；谷氨酸；神經(jīng)細(xì)胞損傷；氧自由基

谷氨酸(Glu)是重要的興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛分布于哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，在神經(jīng)元的分化、遷移、生長以及生存等過程中發(fā)揮重要作用[1，2]。但過多的Glu集聚會(huì)導(dǎo)致Glu受體過度激活，進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載等一系列興奮性毒性，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡、壞死[3，4]。硒是人體正常生命活動(dòng)必不可少的微量元素之一，主要以特異的氨基酸-硒代半胱氨酸(SeCys)形式整合到硒蛋白中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。氧自由基(ROS)在細(xì)胞內(nèi)過量積累可以引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，而氧化應(yīng)激被認(rèn)為是間歇性低氧所致各系統(tǒng)損傷的病理機(jī)制之一。研究證實(shí)，硒可以減少ROS的產(chǎn)生，保護(hù)細(xì)胞對抗Glu毒性、氧化應(yīng)激和炎癥細(xì)胞因子造成的損傷。為了進(jìn)一步明確硒對神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制，我們對Glu損傷的神經(jīng)細(xì)胞給予亞硒酸鈉進(jìn)行干預(yù)，觀察細(xì)胞增殖、細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的變化，并觀察ROS標(biāo)志物的產(chǎn)生，探討亞硒酸鈉對Glu所致神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠永生型海馬神經(jīng)元HT-22細(xì)胞株(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司)；MTT試劑盒(Trevigen, Inc)；ROS熒光探針-DHE(威格拉斯生物北京公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基(HyClone Cell Culture and Bioprocessing )；96孔無菌培養(yǎng)板(Corning公司)；DAPI(C-0033)(博奧森公司)；胎牛血清(HyClone Cell Culture and Bioprocessing)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 取HT-22細(xì)胞，加入胰蛋白酶消化，加入新鮮培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，按100 μL/孔接種于96孔板。將細(xì)胞分為3組，對照組加入無血清DMEM/F12培養(yǎng)基；Glu組加入6 mmol/L谷氨酸和無血清DMEM/F12培養(yǎng)基；亞硒酸鈉組加入6 mmol/L谷氨酸、100 nmol/L亞硒酸鈉和無血清DMEM/F12培養(yǎng)基共同孵育。

1.3 細(xì)胞增殖抑制率檢測 采用MTT法。3組細(xì)胞培養(yǎng)至6、10、24 h時(shí)，棄上清液，PBS漂洗，加入含5 g/L MTT的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入Formazan溶解液，振蕩混勻，待紫色結(jié)晶物充分溶解后，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測490 nm處各孔吸光度(OD)值。計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，計(jì)算平均值。

1.4 細(xì)胞形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)觀察 取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于新培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長24 h后，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1×105/mL，200 μL/孔接種于新培養(yǎng)皿中生長24 h，按1.2分組方法加藥干預(yù)，培養(yǎng)24 h后，加入胰酶消化，收集細(xì)胞，離心棄上清，加入戊二醛溶液4 ℃固定10 min，離心棄上清，重復(fù)離心、固定細(xì)胞操作。棄上清，加入二甲砷酸鈉緩沖液4 ℃放置30 min，加入1%鋨酸4 ℃固定2 h，二甲砷酸鈉緩沖液沖洗。階梯脫水，環(huán)氧丙烷滲透，包埋液浸泡，42 ℃溫箱過夜。用超薄切片機(jī)切成80 nm厚的超薄切片，經(jīng)檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾染色后，用電子顯微鏡觀察切片中細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。

1.5 ROS標(biāo)志物檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1×105/mL，按200 μL/孔接種于12孔板內(nèi)的無菌細(xì)胞爬片上，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。按1.2分組方法加藥干預(yù)，培養(yǎng)24 h后，加入PBS稀釋的50 μmol/L DHE 200 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育45 min。PBS漂洗，4%多聚甲醛固定。用抗淬滅封片劑封片，立刻在熒光顯微鏡下觀察、拍照。以胞質(zhì)出現(xiàn)紅色顆粒為DHE表達(dá)陽性，檢測陽性表達(dá)的平均光密度值，使用Imge-pro plus6.0軟件分析采集圖片的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 三組細(xì)胞增殖抑制率比較 Glu組6、10、24 h時(shí)的細(xì)胞增殖抑制率分別為8.71%±0.009%、28.87%±0.043%、35.64%±0.036%，10、24 h時(shí)的細(xì)胞增殖抑制率均高于6 h，24 h時(shí)最高(P均<0.01)。亞硒酸鈉組6、10、24 h時(shí)的細(xì)胞增殖抑制率分別為4.41%±0.069%、13.14%±0.106%、20.07%±0.161%，各時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率均明顯低于Glu組(P均<0.05)。

2.2 三組細(xì)胞形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)比較 倒置顯微鏡下可見，對照組細(xì)胞形態(tài)良好，呈多角形或長梭形；Glu組與對照組相比，細(xì)胞數(shù)量減少，大小不一，胞質(zhì)減少并可見凋亡細(xì)胞；亞硒酸鈉組較對照組細(xì)胞數(shù)量減少，但較Glu組細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)。電子顯微鏡下顯示，對照組細(xì)胞形態(tài)正常，具有完整的胞膜、胞核，豐富的細(xì)胞器，清晰的線粒體嵴，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)正常、顆粒分布均勻；Glu組較對照組凋亡細(xì)胞增多，胞核不完整甚至崩解碎裂，細(xì)胞器明顯減少；線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯水腫，部分崩解；亞硒酸鈉組較Glu組細(xì)胞微結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕。

2.3 三組ROS標(biāo)志物比較 三組DHE光密度值分別為0.004±0.000 2、0.070±0.003 9、0.045±0.002 1，對照組DHE幾乎不顯色，Glu組探針著色較對照組增加(P<0.01)，亞硒酸鈉組較Glu組DHE染色減輕(P<0.01)。

3 討論

Glu主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，多位于大腦皮層和海馬等部位，參與約50%的神經(jīng)系統(tǒng)突觸傳遞過程，參與幾乎包括學(xué)習(xí)、記憶、運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知和發(fā)育等腦內(nèi)的所有活動(dòng)。它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的作用被認(rèn)為是把雙刃劍，Glu過度集聚時(shí)會(huì)引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載等一系列興奮性毒性反應(yīng)，這一過程中會(huì)形成大量ROS，過量ROS引起線粒體膜去極化和相關(guān)蛋白酶活化，介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的過度激活引起細(xì)胞死亡，這一過程被稱為Glu興奮性毒性作用[5，6]。本研究顯示，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入Glu后，與對照組相比，Glu組細(xì)胞數(shù)量減少，胞核不完整甚至崩解碎裂，細(xì)胞器明顯減少，ROS產(chǎn)生增加。證實(shí)Glu對神經(jīng)細(xì)胞具有損傷作用，這種損傷作用可能與ROS的產(chǎn)生增加有關(guān)。

硒作為一種微量元素對人體細(xì)胞發(fā)揮正常功能必不可少。目前常用的補(bǔ)硒劑主要有無機(jī)硒和有機(jī)硒兩類，亞硒酸鈉屬于無機(jī)硒。硒可直接影響神經(jīng)細(xì)胞的生長發(fā)育，進(jìn)而可能對智能發(fā)育產(chǎn)生影響[7，8]。實(shí)驗(yàn)研究[9]發(fā)現(xiàn)，硒可以影響大鼠大腦皮層、海馬神經(jīng)細(xì)胞的體外生長發(fā)育，使神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)增加，即使在無血清的條件下對神經(jīng)細(xì)胞存活依然具有促進(jìn)作用。ROS主要在線粒體中產(chǎn)生，在線粒體呼吸過程中，少量電子可以從線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅰ和Ⅲ中漏出，漏出的電子與O2結(jié)合生成ROS。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的ROS處于正常水平時(shí)，并不會(huì)對細(xì)胞造成過度損傷，但在環(huán)境變化、藥物刺激、細(xì)菌感染等狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平會(huì)顯著升高。有研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)退行性疾病中能夠檢測到ROS生成增加及氧化應(yīng)激增強(qiáng)[10，11]，這最終可導(dǎo)致細(xì)胞不同程度損傷甚至發(fā)生細(xì)胞凋亡[12]。多種凋亡刺激因子都可使ROS 水平增高,使用ROS拮抗劑干預(yù)后可以在一定程度上拮抗凋亡，大量證據(jù)還支持 ROS 與凋亡誘導(dǎo)早期線粒體變化有關(guān)系[13]。線粒體內(nèi)膜參與氧化呼吸這一重要生物學(xué)過程中的電子傳遞，ROS是這一過程中產(chǎn)生的關(guān)鍵信號(hào)分子，它作為胞內(nèi)重要的第二信使，能夠激活包括細(xì)胞增殖、凋亡等多種關(guān)鍵性的信號(hào)通路。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)觀察了線粒體和ROS的產(chǎn)生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉組較谷氨酸組線粒體數(shù)量明顯增多，ROS的產(chǎn)生明顯減少，說明亞硒酸鈉能夠緩解神經(jīng)細(xì)胞的損傷。

我們的前期研究[14]表明，硒蛋白能夠緩解Glu對神經(jīng)細(xì)胞的損傷，但對于外源性加入亞硒酸鈉是否能緩解Glu對神經(jīng)細(xì)胞的損傷還不清楚。本研究結(jié)果顯示，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入亞硒酸鈉后，培養(yǎng)6、10、24 h時(shí)的細(xì)胞增殖抑制率均低于Glu組，細(xì)胞數(shù)量較Glu組增多，細(xì)胞大體形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)較Glu組好轉(zhuǎn)，ROS產(chǎn)生減少。說明硒可能通過減少ROS的產(chǎn)生來緩解Glu對神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用。

綜上所述，Glu可以引起神經(jīng)細(xì)胞損傷，硒能夠緩解Glu對神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用，其機(jī)制可能與減少ROS產(chǎn)生有關(guān)。

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Effectofsodiumseleniteonglutamicacid-inducedneuronalinjury

WANG Juan1, MAI Li, WANG Liyao, CHANG Yue, JING Li

(1 Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China)

ObjectiveTo investigate the effect of sodium selenite on glutamic acid (Glu)-induced neuronal injury and its mechanism.MethodsThe HT22 cells were divided into three groups. The control group was cultured in cell culture fluid. The Glu group was co-cultured with Glu (6 mmol/L) and cell culture fluid. The sodium selenite group was co-cultured with Glu (6 mmol/L), cell culture fluid, and 100 nmol/L sodium selenite. MTT method was used to detect the cell inhibition rates in each group at 6, 10, and 24 h after cultivation. Inverted microscope was used to observe the changes of cell morphology. Transmission electron microscope (TEM) was used to observe the changes of cell micro-structure. The cells were labeled with oxygen free radical ROS-specific labeling probe DHE. The expression of DHE was observed with fluorescent electron microscope.ResultsThe cell inhibition rate of the Glu group was 8.71%±0.009% at 6 h, the inhibition rate increased at 10 and 24 h, and at 24 h it reached the peak. But the cell inhibition rate dropped significantly after that common incubation with sodium selenite (P<0.05). The results of the inverted microscope showed the number of cells in the Glu group was lower than that of the control group, and with cell shrinkage and irregular shapes. The number of cells in the sodium selenite group was increased than that of the the Glu group. The results of TEM showed the number of apoptosis in the Glu group was higher than that of the control group, and with severer mitochondria and endoplasmic reticulum damage. The number of apoptosis in the sodium selenite group was lower than that of the Glu group. Fluorescent electronic microscope showed the average optical density of DHE dyeing in the Glu group was higher than that of the control group, and the average optical density of DHE dyeing in the sodium selenite group was lower than that of the Glu group.ConclusionSelenium (Sodium selenite) can alleviate the damage of nerve cells from Glu by reducing the ROS production.

selenium; sodium selenite; glutamic acid; nerve cell damage; oxygen radical

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.42.004

R361.3

A

1002-266X(2017)42-0013-03

國家自然科學(xué)基金地區(qū)項(xiàng)目(81560501)；寧夏高等學(xué)校科學(xué)研究項(xiàng)目(NGY2015068)。

王娟(1987-)，女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)樾难懿±?。E-mail： 1169570514@qq.com

景麗(1975-)，女，教授，主要研究方向?yàn)樾难懿±怼-mail： 1203220205@qq.com

2017-03-11)