任冠恒 ，翁榕花 ，施 妍 ，黃 平 ，李正東 ，邵 煜 ，鄧愷飛 ，劉寧國(guó) ，陳憶九

（1.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063；2.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州 510515；3.莆田市公安局城廂分局，福建 莆田 351100）

·綜 述·

MALDI-TOF-IMS在生物醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用展望

任冠恒1，2，翁榕花3，施 妍1，黃 平1，李正東1，邵 煜1，鄧愷飛1，劉寧國(guó)1，陳憶九1

（1.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063；2.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州 510515；3.莆田市公安局城廂分局，福建 莆田 351100）

基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜成像（matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight imaging mass spectrometry，MALDI-TOF-IMS）技術(shù)通過(guò)對(duì)生物組織切片的掃描，分析切片中的未知組分，獲取組織的分子成像圖，已成為研究生物標(biāo)志物、脂類分布、藥物代謝等方面的有力手段。本文對(duì)該技術(shù)在蛋白質(zhì)鑒定、臨床應(yīng)用、藥物研發(fā)、脂類研究及腦損傷方面的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

法醫(yī)病理學(xué)；質(zhì)譜成像；綜述；基質(zhì)輔助激光解吸電離

基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜成像（matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight imaging mass spectrometry，MALDI-TOF-IMS）技術(shù)是一門新興的分子成像技術(shù)，主要用于人類和動(dòng)物組織切片中的蛋白質(zhì)研究，特別是在病理機(jī)理研究中的應(yīng)用，對(duì)法醫(yī)病理學(xué)的發(fā)展前景有極大的推動(dòng)作用。此外，MALDI-TOF-IMS還可用于藥物研發(fā)，當(dāng)藥物作用于病變組織，可跟蹤特定藥物及其代謝物在組織中的空間分布，揭示化合物如何在不同組織中發(fā)揮作用。MALDI-TOF-IMS在脂質(zhì)組學(xué)方面也有大量的研究，并取得了一定的進(jìn)展。本文對(duì)該技術(shù)在蛋白質(zhì)鑒定、臨床應(yīng)用、藥物研發(fā)、脂類研究以及腦損傷方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 蛋白質(zhì)的鑒定

鑒定組織中的差異蛋白和多肽有利于闡明基礎(chǔ)疾病的生物學(xué)過(guò)程。通過(guò)對(duì)MALDI-TOF-IMS分析獲得的原始質(zhì)譜圖進(jìn)行加工處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，得到組織中所有差異表達(dá)的質(zhì)譜峰列表（按m/z排列），這些差異峰所對(duì)應(yīng)的多肽和蛋白可能在疾病發(fā)展進(jìn)程中起到顯著的調(diào)節(jié)作用，因此，鑒定這些多肽和蛋白對(duì)于闡明法醫(yī)病理學(xué)機(jī)制有非常重要的意義。而蛋白質(zhì)的鑒定方法會(huì)因樣品的復(fù)雜性、蛋白質(zhì)豐度或分子量而不同。目前最常用的方法有兩種，即自底向上策略和自頂向下策略。在自底向上策略中，純化的蛋白質(zhì)或者復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物被酶切為肽段，隨后使用色譜分離肽段混合物，并對(duì)肽段混合物進(jìn)行質(zhì)譜分析[1]。在自頂向下策略中，完整的蛋白質(zhì)分子被作為一個(gè)整體進(jìn)行質(zhì)譜分析[2]。一般情況下，自頂向下策略多應(yīng)用于分析相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)，因?yàn)橄鄬?duì)分子質(zhì)量大于100 000的蛋白質(zhì)碰撞誘導(dǎo)碎裂通常是不充分的。自底向上策略多用于分析復(fù)雜的樣品混合物，常常需要對(duì)蛋白質(zhì)水解得到的肽段混合物進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)碎裂，然后進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析。蛋白質(zhì)鑒定數(shù)據(jù)處理方法可以分為三類，即數(shù)據(jù)庫(kù)搜索方法、從頭測(cè)序方法和肽序列標(biāo)簽方法。其中數(shù)據(jù)庫(kù)搜索是應(yīng)用最廣泛的方法，一般包括三步：圖譜處理、候選肽段生成和實(shí)驗(yàn)-理論圖譜比對(duì)。數(shù)據(jù)庫(kù)搜索可借助商業(yè)軟件SEQUEST和MASCOT[3]來(lái)完成。

MALDI-TOF-IMS直接獲得不同分子量的物質(zhì)在組織切片上的分布信息，對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白，難以直接通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜法（MS/MS）分析鑒定。原位酶切技術(shù)是將酶液微滴點(diǎn)在組織切片上，在室溫下將蛋白質(zhì)在其原位酶切成若干肽段的一項(xiàng)新技術(shù)。該技術(shù)可通過(guò)對(duì)酶切后肽段的MS/MS分析，鑒定其所屬蛋白質(zhì)[4]。這種原位鑒定蛋白質(zhì)的方法與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分離鑒定方法相比更省時(shí)間，同時(shí)將蛋白質(zhì)直接成像分析結(jié)果與相同蛋白質(zhì)的多肽分布特征相比對(duì)，若兩者結(jié)果一致，則表明蛋白質(zhì)在酶切過(guò)程中位置未發(fā)生變化，原位酶切技術(shù)提高了蛋白質(zhì)的鑒定成功率。最后，可以通過(guò)免疫組織化學(xué)等方法，采用特異的抗體對(duì)鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物一直是廣大的法醫(yī)病理學(xué)者致力的方向，MALDI-TOFIMS技術(shù)的出現(xiàn)將為法醫(yī)病理學(xué)提供一條新的思路。

2 在臨床研究中的應(yīng)用

醫(yī)學(xué)影像技術(shù)已經(jīng)成為臨床診斷的必備手段，但是絕大部分不能在分子水平上提供組織成分的分布信息，而質(zhì)譜成像技術(shù)能在分子水平上發(fā)現(xiàn)病變組織的標(biāo)志物，因此在臨床診斷上具有較好的應(yīng)用前景。目前，MALDI-TOF-IMS已用于多種疾病的診斷，包括阿爾茨海默病[5]、人類非小細(xì)胞肺癌[6]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[7]、霍奇金淋巴瘤[8]和胃腸道的癌前病變[9]等。疾病發(fā)生過(guò)程涉及眾多細(xì)胞事件，而蛋白質(zhì)是眾多細(xì)胞事件的執(zhí)行者。任何疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程蛋白質(zhì)都會(huì)發(fā)生不同變化，如腫瘤在其發(fā)展過(guò)程中蛋白質(zhì)發(fā)生異常變化，并涉及蛋白質(zhì)表達(dá)量的增減、翻譯后加工的改變等，從而導(dǎo)致腫瘤表達(dá)的蛋白質(zhì)譜發(fā)生改變。最常用的是比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，找出具有顯著性差異的m/z位點(diǎn)，鑒定出與病情發(fā)展相關(guān)聯(lián)的特定蛋白質(zhì)分子。在某些研究中，實(shí)驗(yàn)的目的是鑒定與疾病發(fā)展相關(guān)的特殊分子，如膠質(zhì)瘤或非小細(xì)胞肺癌的蛋白質(zhì)分子特征能用于辨別腫瘤級(jí)別并與患者的存活率關(guān)聯(lián)[10]。MALDI-TOF-IMS在尋找生物標(biāo)志物方面的作用已廣泛應(yīng)用于臨床并取得不錯(cuò)的發(fā)展。YE等[11]展示了MALDI-TOF-IMS在臨床應(yīng)用中的多功能性，如生物標(biāo)志物用于各種疾病的診斷、疾病嚴(yán)重程度的預(yù)測(cè)以及體內(nèi)藥物的代謝反應(yīng)等。隨著MALDI-TOFIMS技術(shù)的不斷發(fā)展，人們將會(huì)對(duì)生物學(xué)疾病有更深刻的認(rèn)識(shí)，并且在臨床診斷中的應(yīng)用進(jìn)一步推進(jìn)。通過(guò)蛋白水平的監(jiān)測(cè)，不僅可以暴露疾病的類型，還能暴露疾病的嚴(yán)重程度，特別是發(fā)現(xiàn)癌前病變。MEDING等[12]利用MALDI質(zhì)譜成像技術(shù)成功將六種常見的癌癥探測(cè)出來(lái)，包括與巴雷特食管相關(guān)的食管癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌、胃癌和甲狀腺癌。研究者們利用MALDI-TOF-IMS建立各種已知癌癥類型的不同蛋白分子標(biāo)志物的數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)其蛋白質(zhì)組學(xué)的差異性，將癌癥細(xì)胞特定的圖譜提取出來(lái)并進(jìn)行分類，獲得了很高的可信性。

3 在藥物研發(fā)中的應(yīng)用

藥物研發(fā)的關(guān)鍵在于識(shí)別正確的藥理學(xué)靶點(diǎn)，藥物能否到達(dá)作用部位有助于研究者們更好地評(píng)定化學(xué)物作為醫(yī)藥產(chǎn)品的潛在價(jià)值和產(chǎn)生的毒理效應(yīng)[13]。MALDI-TOF-IMS技術(shù)使直接測(cè)定組織切片上的藥物分布成為可能，這也許能闡明新藥開發(fā)過(guò)程中藥物處置或生物轉(zhuǎn)化的途徑。很多化合物的相對(duì)分子質(zhì)量小于1000，屬于小分子化合物一類，具有生理和藥理上的相關(guān)性[14]。藥物研發(fā)的常用方法是將藥物用放射性同位素標(biāo)記，運(yùn)用放射自顯影技術(shù)研究受體的分布和數(shù)量。放射自顯影技術(shù)是將放射性同位素標(biāo)記的藥物給予動(dòng)物口服，然后將動(dòng)物處死，將組織進(jìn)行切片并放于暗盒內(nèi)曝光，觀察放射性藥物在細(xì)胞內(nèi)外分布的情況。相較于放射自顯影技術(shù)，MALDI-TOF-IMS不需要使用放射性同位素標(biāo)記藥物，這在藥物開發(fā)初期有明顯的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)閷⒋罅啃枰缓Y選的藥物進(jìn)行放射性標(biāo)記是非常耗時(shí)的工作。此外，MALDI-TOFIMS能夠區(qū)分藥物與其代謝物，而放射自顯影技術(shù)則不能有效區(qū)分放射線是來(lái)自藥物還是其代謝物。放射自顯影技術(shù)另一個(gè)缺點(diǎn)是不能同時(shí)獲得組織內(nèi)藥物的時(shí)間、空間分布信息，在進(jìn)行劑量估算時(shí)，只能獲得某一時(shí)點(diǎn)的劑量率。MALDI-TOF-IMS在空間分辨率達(dá)100μm下能同時(shí)測(cè)定多種藥物在組織切片上的分布情況[15]。盡管MALDI-TOF-IMS一般只用于生物聚合物的分析，但將這種技術(shù)用于小分子（相對(duì)分子質(zhì)量＜1 500）的定性和定量分析具有良好的潛能[16]。MALDI-TOF-IMS用于小分子的研究多見于藥物活性化合物及其代謝物的分析，如有報(bào)道[17]研究藥物奧氮平及其代謝物在整個(gè)大鼠切片中的分布，該研究結(jié)果與放射自顯影和LC-MS/MS定量結(jié)果具有很好的相關(guān)性，展示了MALDI-TOF-IMS用于代謝物研究的可行性。

4 在脂質(zhì)組學(xué)方面的應(yīng)用

脂質(zhì)組學(xué)是研究一個(gè)生物體內(nèi)所有脂類分子的特性，以及其在蛋白質(zhì)表達(dá)和基因表達(dá)調(diào)節(jié)過(guò)程中的作用，是生物標(biāo)志物研究的前沿方向之一[18]。氣相層析-質(zhì)譜技術(shù)用于脂類的分析已經(jīng)有數(shù)十年歷史。氣相層析分析脂類分子的首要條件是這些脂類分子必須氣化，由于很多脂類分子是非揮發(fā)性的，所以化學(xué)修飾使脂類分子氣化是此方法必不可少的一步。MALDI技術(shù)的發(fā)展使得脂類的質(zhì)譜分析發(fā)生了巨大的改變，脂類的揮發(fā)性問(wèn)題不再如以前那么突出，脂類可以直接采用MALDI電離后進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行MS和MS/MS分析，這使得脂類的鑒定能夠快速、高通量和精確地進(jìn)行并極大地推動(dòng)脂質(zhì)組學(xué)的研究。MALDI-TOFIMS分析法主要有兩種，一種是溶劑提取法[19]，另一種是組織切片直接分析法[20]。溶劑提取法是采用簡(jiǎn)單易操作的全脂類提取方法，然后用MALDI-TOF-IMS直接進(jìn)行分析。組織切片直接分析法是用MALDITOF-IMS直接分析組織樣品中脂類的分布，通過(guò)對(duì)健康和疾病組織的質(zhì)譜圖對(duì)比分析，可以直接對(duì)其中的差異脂類進(jìn)行定性鑒定。MALDI-TOF-IMS用于脂類分子的成像研究，不僅可以獲得完整和精確的結(jié)構(gòu)圖，而且能在組織切片處理和破壞程度減到最低的情況下跟蹤組織切片中脂質(zhì)分子的分布。利用MALDITOF-IMS技術(shù)，研究人員已對(duì)小鼠大腦中的卵磷脂[21]、神經(jīng)節(jié)糖苷[22]、硫酸酯[23]和腦苷脂類[24]等脂類分子的分布進(jìn)行了研究。也有研究者[25]利用離子遷移率的方法結(jié)合MALDI-TOF-MS用于脂質(zhì)分子的分離。在該技術(shù)中，首先以離子遷移率的方法分離離子，然后通過(guò)MALDI-TOF-IMS技術(shù)進(jìn)行分析，被解吸出來(lái)的脂質(zhì)離子沿著特定的軌道飛行，實(shí)現(xiàn)與具有相同相對(duì)質(zhì)量的寡核苷酸、多肽、蛋白質(zhì)和藥物及其代謝物的分離，這有利于將來(lái)自脂質(zhì)的離子與其他小分子物質(zhì)進(jìn)行區(qū)分。

5 在腦損傷研究中的應(yīng)用

目前，MALDI-TOF-IMS用于腦損傷中的研究相對(duì)較少。HANKIN等[26]利用MALDI-TOF-IMS技術(shù)觀察腦缺血-再灌注損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷拇笫蠛ｑR區(qū)域，特別是CA1區(qū)域中磷脂分子的分布。與對(duì)照組比較，腦缺血-再灌注損傷大鼠的海馬區(qū)域可見質(zhì)荷比（m/z）為548.5的離子豐度大幅度增加，通過(guò)碰撞誘導(dǎo)裂解技術(shù)鑒定該離子與神經(jīng)酰胺有關(guān)，而神經(jīng)酰胺是一種與細(xì)胞凋亡相關(guān)的脂質(zhì)。該研究還利用MALDI-TOFIMS觀察了外傷性腦損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷拇笫?，發(fā)現(xiàn)損傷區(qū)域神經(jīng)酰胺的表達(dá)增多，同時(shí)磷酸膽堿鉀加合物信號(hào)顯著丟失，并出現(xiàn)相應(yīng)的鈉加合物離子信號(hào)的增強(qiáng)，這種改變是腦水腫導(dǎo)致的結(jié)果，原因是損傷造成Na/K-ATP酶的失活，使細(xì)胞外液流入細(xì)胞。該研究展示了MALDI-TOF-IMS在檢測(cè)脂質(zhì)在組織中生化改變方面的應(yīng)用前景，以及為組織損傷相關(guān)生化機(jī)制的闡明提供數(shù)據(jù)支持。此外，SHANTA等[27]通過(guò)MALDI質(zhì)譜成像技術(shù)檢測(cè)大鼠腦缺血損傷模型腦組織中的磷脂質(zhì)，比較對(duì)照組和損傷組腦組織中磷脂質(zhì)的分布，利用MALDI質(zhì)譜成像技術(shù)及MS/MS進(jìn)行分析，鑒定腦組織中磷脂質(zhì)的變化情況，與正常腦組織相比，腦缺血損傷的腦組織中有11種表達(dá)上調(diào)的磷脂質(zhì)，包括溶血卵磷脂、卵磷脂、鞘磷脂鈉加合物和卵磷脂鈉加合物。與此同時(shí)，有7種卵磷脂表達(dá)下調(diào)，包括卵磷脂鉀加合物、鞘磷脂鉀加合物和溶血卵磷脂鉀加合物。該研究通過(guò)MALDI-TOF-IMS技術(shù)對(duì)磷脂質(zhì)的鑒定，發(fā)現(xiàn)腦缺血損傷腦組織中的磷脂生物標(biāo)志物有利于研究腦缺血損傷的機(jī)制。顱腦損傷是法醫(yī)病理學(xué)實(shí)踐重要的內(nèi)容之一，能夠利用MALDI-TOF-IMS對(duì)顱腦損傷生物標(biāo)志物進(jìn)行篩選和鑒定，為法醫(yī)病理學(xué)的發(fā)展提供很大的幫助。

6 展 望

MALDI-TOF-IMS技術(shù)用于生物組織切片是一種新興的分子成像技術(shù)，通過(guò)對(duì)組織切片的掃描，能夠同時(shí)檢測(cè)組織切片中多種未知的分子成分，結(jié)合分析軟件可篩選出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異分子峰，并可對(duì)這些分子峰進(jìn)行定性分析，提供這些分子在組織中的空間分布信息。MALDI-TOF-IMS技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。而目前該技術(shù)在法醫(yī)病理學(xué)中的應(yīng)用還比較少，但其在法醫(yī)病理學(xué)中的發(fā)展前景是非常誘人的。因其在蛋白質(zhì)、多肽以及脂質(zhì)等分子的定性和空間分布方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，將在法醫(yī)病理學(xué)研究中發(fā)揮很大的功能。

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2016-04-06）

（本文編輯：張建華）

Research Progress of MALDI-TOF-IMS in Biomedicine and Its Application Prospect in Forensic Sciences

REN Guan-heng1,2,WENG Rong-hua3,SHI Yan1,HUANG Ping1,LI Zheng-dong1,SHAO Yu1,DENG Kaifei1,LIU Ning-guo1,CHEN Yi-jiu1
（1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Shanghai Forensic Service Platform,Academy of Forensic Science,Shanghai 200063,China;2.Department of Forensic Science,School of Basic Medicine Science,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;3.Chengxiang Branch of Putian Public Security Bureau,Putian 351100,China）

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight imaging mass spectrometry （MALDITOF-IMS）can analysis unknown compounds in sections and obtain molecule imaging by scanning biological tissue sections,which has become a powerful tool for the research of biomarker,lipid distribution and drug metabolism,etc.This article reviews the application of this technique in protein identification,clinical application,drug discovery,lipid research and brain injury.

forensic pathology;imaging mass spectrometry;review;matrix-assisted laser desorption;ionization

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.05.016

1004-5619（2017）05-0522-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81571851）；中央級(jí)科研院所科研專項(xiàng)（GY2015G-2、GY2013Z-3）；上海市科委社會(huì)發(fā)展專項(xiàng)（14231202500）

任冠恒（1990—），女，碩士研究生，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：rgh_0101@163.com

劉寧國(guó)，男，研究員，主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：liuningguo@foxmail.com

通信作者：陳憶九，男，研究員，博士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：chenyj@ssfid.cn