凌云++王晶++王越菲+彭自然

摘要：分子生物學(xué)試驗中的細(xì)胞裂解及DNA提取是試驗的第1步，但是由于細(xì)胞種類多樣、細(xì)胞壁成分復(fù)雜，DNA提取的效果容易受到提取方法的影響。針對以上問題，主要研究溶菌酶、蛋白酶K、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB）等4種化學(xué)方法對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌以及大腸桿菌3種代表性細(xì)菌細(xì)胞的裂解效果。結(jié)果表明：溶菌酶+SDS法對3種微生物的裂解效果都不錯，但可能造成蛋白質(zhì)污染且DNA碎片較多；溶菌酶+熱凍法對于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的裂解效果較好且蛋白質(zhì)污染較少；蛋白酶K+CTAB法僅對金黃色葡萄球菌的裂解提取效果較好；溶菌酶+蛋白酶K法的提取效果最差。在試驗中可以根據(jù)需要選擇不同的裂解方式，從而達(dá)到操作性、重現(xiàn)性及經(jīng)濟(jì)性的統(tǒng)一。

關(guān)鍵詞：微生物細(xì)胞裂解；DNA提?。蝗芫阜?；混合法；熱凍法

中圖分類號： S182；Q933文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0061-03

收稿日期：2015-10-22

[JP2]基金項目：水體污染控制與治理科技重大專項（編號：2014ZX07101-012-04）。

作者簡介：凌云（1978—），男，浙江湖州人，博士，副教授，主要研究方向為微生物生態(tài)學(xué)。Tel：（021）61900431；E-mail：yling@shou.edu.cn。

通信作者：彭自然，碩士，講師，主要研究方向為環(huán)境化學(xué)。Tel：（021）61900431；E-mail：zrpeng@shou.edu.cn。

由于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的不同，細(xì)菌可分為革蘭氏陽性菌（G+）、革蘭氏陰性菌（G-）[1]。革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁主要成分是肽聚糖，其上附有磷壁酸；革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁分為內(nèi)壁層、外壁層，內(nèi)壁層由肽聚糖組成，外壁層主要由脂多糖、蛋白質(zhì)組成。細(xì)胞破碎的方法有很多[2]，有機(jī)械法（如珠磨法、高壓勻漿法、超聲波法）和非機(jī)械法（如溶酶法、滲透壓沖擊、干燥法、化學(xué)滲透法）。由于提取細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)如DNA、RNA、活性物質(zhì)等多數(shù)需要將細(xì)胞破碎，而機(jī)械法容易導(dǎo)致DNA斷裂，因此相關(guān)報道更多地集中在使用有機(jī)溶劑、抗生素、表面活性劑、螯合劑、變性劑等化學(xué)試劑進(jìn)行細(xì)胞破碎[3-5]。本試驗以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌3種實驗室常用細(xì)菌為研究對象，采用溶菌酶、蛋白酶K、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB）等4種常見化學(xué)試劑的不同組合對其細(xì)胞進(jìn)行裂解，通過結(jié)合提取裂解后細(xì)胞破碎所釋放出DNA的效果，比較這些方法對不同類型細(xì)菌的裂解效果，嘗試尋找適合的方法，以期為細(xì)胞裂解及提取DNA的研究提供一定的參考。

1材料與方法

1.1試驗菌株

試驗所用菌株為筆者所在實驗室中原有冷藏保存的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Bacillus coli）。

[HTK]1.2試驗試劑[HT]

試驗中所用到的主要試劑有三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（簡稱Tris-HCl）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，簡稱EDTA）、CTAB、SDS、NaCl、NaAc、蛋白酶K、溶菌酶、無水乙醇、溶菌酶、酚、三氯甲烷、異戊醇、異丙醇等。

1.3試驗儀器

試驗中所用的主要儀器：DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱、DK-S22型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；RJ-TGL-16G臺式離心機(jī)，無錫市瑞江分析儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；BioPhotometer生物分光光度計，德國艾本德（Eppendorf）股份公司；Biostep凝膠成像分析系統(tǒng)，德國Biostep公司。

1.4試驗方法

將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌接種于放有培養(yǎng)基并已滅菌的培養(yǎng)皿中，于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，并按相應(yīng)方法裂解細(xì)菌細(xì)胞并提取DNA。所用培養(yǎng)基為上海疾控華康科技開發(fā)公司生產(chǎn)的營養(yǎng)瓊脂，其主要成分為蛋白胨、牛肉膏粉、氯化鈉、瓊脂粉，pH值為7.3±0.2。

1.4.1方法1（溶菌酶+蛋白酶K法）參照劉曉俠等的方法[6]并稍作改動：將菌體用500 μL TE（10 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0；1 mmol/L EDTA，pH值8.0）重懸于2 mL離心管中，加入10 μL 20 mg/mL溶菌酶，37 ℃水浴20 min；加入2.5 μL 20 mg/mL蛋白酶K混勻，37 ℃水浴1 h。

1.4.2方法2（溶菌酶+SDS法）參照陳敏的方法[7]并稍作改動：將菌體用100 μL TE、50 μL 20 mg/mL溶菌酶重懸于2 mL離心管中，于37 ℃水浴1 h；加入10 μL 10% SDS，混勻后于室溫放置5 min；加入66 μL NaCl（5 mmol/L），混勻后于12 000 r/min離心10 min。

1.4.3方法3（溶菌酶+熱凍法）參照宋培勇的方法[8]并稍作改動：將菌體置于2 mL離心管中，加入150 μL裂解液Ⅰ（0.15 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA，pH值8.0）、150 μL 20 mg/mL 溶菌酶，混勻后于37 ℃水浴2 h；加入200 μL裂解[JP2]液Ⅱ（0.1 mol/L NaCl，0.5 mol/L Tris-HCl，10% SDS，pH值80），反復(fù)凍融（冰浴5 min與沸水浴5 min交替進(jìn)行各3次），于8 000 r/min離心15 min，取上清液于1支新離心管中。

1.4.4方法4（蛋白酶K+CTAB法）參照劉敏等的方法[9]并稍作改動：將菌體用500 μL TE重懸于2 mL離心管中，加入50 μL 10% SDS、20 μL 20 mg/mL蛋白酶K，混勻后于 37 ℃ 水浴1 h；加入200 μL 5 mol/L NaCl，充分混勻；加入100 μL CTAB-NaCl溶液（0.7 mol/L NaCl，10% CTAB），混勻后于65 ℃水浴1 h。

1.5裂解效果的檢驗

通過對裂解后提取到的DNA濃度、純度以及瓊脂糖凝膠電泳檢測來評估各種方法裂解細(xì)菌細(xì)胞的效果。

1.5.1DNA的濃度與純度檢測取10 μL DNA，稀釋20倍，測定其D260 nm、D280 nm，通過D260 nm/D280 nm值來檢測所提取DNA的純度。根據(jù)以下公式來檢測所提取的DNA濃度：

[JZ]DNA濃度（μg/mL）=50×D260nm×稀釋倍數(shù)。

D260 nm=1，相當(dāng)于約50 μg/mL雙鏈DNA。通常情況下純DNA樣品D260 nm/D280 nm值約為1.8；若D260 nm/D280 nm值>1.9，可能有RNA污染；若D260 nm/D280 nm值<1.8，可能有蛋白質(zhì)污染[10]。

1.5.2瓊脂糖凝膠電泳檢測將提取得到的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳時間約為45 min，電泳完畢后用紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像分析和拍照。

2結(jié)果與分析

2.1DNA純度與濃度

由表1可見，方法1對于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的D260 nm、D280 nm相近且效果相對較好，D260 nm/D280 nm值高于1.8，但低于1.9，表明DNA濃度較高且?guī)缀醪淮嬖赗NA污染；但是枯草芽孢桿菌的D260 nm、D280 nm都相對較低，說明釋放出的DNA與蛋白質(zhì)相對較少，D260 nm/D280 nm值高于1.9，說明其中有RNA污染。

方法2對試驗細(xì)菌細(xì)胞的裂解非常充分，相對于其他方法，所獲得的DNA產(chǎn)量最高，DNA濃度也最大，但同時蛋白質(zhì)產(chǎn)率也最高。推測原因為該方法中加入大量溶菌酶并使用SDS，但未使用蛋白酶；該方法對于大腸桿菌的提取效果不如其他2種菌，其D260 nm/D280 nm值只有1.55，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于一般純度DNA的D260 nm/D280 nm值，雖然有大量DNA，但也因存在過多蛋白質(zhì)而造成污染。

在方法3中，有2種細(xì)菌D260 nm/D280 nm值高于1.9，表明存在RNA污染；相對于其他2種菌，大腸桿菌的D260 nm/D280 nm值為1.87，所得到的DNA純度相對較好；3種菌中枯草芽孢桿菌的D260 nm、D280 nm均低于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，表明釋放出的DNA、蛋白質(zhì)都相對較少。

在方法4中，金黃色葡萄球菌的D260 nm、D280 nm均比其他2種菌高，所釋放出的DNA、蛋白質(zhì)都較多，因而雖然DNA濃度相對較高，但D260 nm/D280 nm值只有1.58，遠(yuǎn)低于1.8，存在較多蛋白質(zhì)污染。與之前3種方法相比，用方法4來裂解金黃色葡萄球菌細(xì)胞并提取DNA的效率較低，而用該方法提取的枯草芽孢桿菌，D260 nm/D280 nm值高于1.9，表明存在RNA污染。

如果以方法歸類，從提取的DNA量來看，對于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌這3種細(xì)菌而言，方法2（溶菌酶+SDS）提取得到的3種細(xì)菌的DNA的量都明顯大于方法1、方法3、方法4所提取的3種細(xì)菌的DNA量（P<0.05）；同時，方法2（溶菌酶+SDS鹽）最終提取的DNA質(zhì)量濃度也明顯高于方法1、方法3、方法4所提取的3種細(xì)菌的DNA濃度（P<0.05）。

2.2細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)差異對提取結(jié)果的影響

由表2可見，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌同為革蘭氏陽性菌（G+），根據(jù)查閱的資料[1]，革蘭氏陽性菌對于溶菌酶比較敏感，革蘭氏陰性菌則相對不敏感，因此溶菌酶對革蘭氏陽性菌裂解效果應(yīng)較好。但從實際結(jié)果比較來看，枯草芽孢桿菌效果明顯較差。有的細(xì)菌在其生活史的一定階段，于所影響的細(xì)胞內(nèi)形成1個圓形、橢圓形或柱形的結(jié)構(gòu)，稱為芽孢[1]，因此推測此時正值枯草芽孢桿菌存在芽孢的階段，而芽孢對外界不良環(huán)境具有很強(qiáng)的抵抗能力，因此大大影響了裂解效果，釋放出的DNA量也就相對較少。而屬于革蘭氏陰性菌的大腸桿菌裂解效果與金黃色葡萄球菌相近，應(yīng)是溶菌酶的濃度比較高的原因造成的，實際所用濃度為相關(guān)報道[6]中的2倍。

大量高濃度的溶菌酶使得方法2的裂解效果大大優(yōu)于原文獻(xiàn)中提到的裂解效果[9]，再加上SDS分離蛋白質(zhì)的作用，使該方法成為所有方法中裂解效果最好的，但是將通常與SDS搭配使用的蛋白酶K換成了溶菌酶，大量分離出來的蛋白質(zhì)得不到充分降解，使得蛋白質(zhì)的含量也是4種方法中最高的。同時，革蘭氏陽性菌對于溶菌酶較革蘭氏陰性菌敏感的特點在該方法中得到體現(xiàn)。

在方法3中，凍融作用極冷極熱的急速溫度變化對細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的破壞作用也是比較強(qiáng)的，這點從金黃色葡萄球菌和大腸桿菌裂解所釋放出的DNA量能看出，但是對枯草芽孢桿菌不甚理想，推測為其中芽孢的作用。芽孢尤其能耐高溫，同時也能抵抗低溫，在-190 ℃的液氮中保存6個月仍能存活[1]，在進(jìn)行該方法的試驗時一些細(xì)菌胞內(nèi)已形成的芽孢抵御了溫度對于細(xì)胞的殺傷以及部分化學(xué)試劑的破壞。

方法4適用于大多數(shù)微生物細(xì)胞的裂解和DNA提取[6]，但相對于其他2種菌，對溶菌酶敏感且又不含有芽孢的金黃色葡萄球菌顯然裂解效果更好。在抽提時，金黃色葡萄球菌的上清液更易被吸取，而其他2種菌的上清液則相對濃稠，難以吸取。正因為如此，金黃色葡萄球菌在試驗過程中容易將蛋白質(zhì)一并吸取上來，造成蛋白質(zhì)的污染；而其他2種菌卻是因為上清液吸取的不充分導(dǎo)致DNA提取量的減少，影響對裂解效果的評估。

2.3瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析

將細(xì)胞裂解后提取得到的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果如圖1所示，可見1～24泳道各組呈現(xiàn)不同的亮度，表明4種方法對于4種細(xì)菌都可提取出DNA，但DNA的濃度、含量及片段分布不盡相同，其中3、4，5、6，7、8，9、10，11、12，15、16，17、18，21、22，23、24泳道帶相對于其他泳道更亮，說明相對于其他幾個樣，它們中所含的DNA片段量是較高的，特別是7～12泳道所屬的方法2，該方法作用的3種細(xì)菌都釋放出較大量的DNA片段，與5、6，17、18泳道相對比也略顯得有些暗淡，說明該方法所提取DNA片段斷裂最少，對于23與24泳道而言亦是如此。而5、6，15、16，17、18，21、22泳道較同樣提取方法中的泳道條帶更亮且更規(guī)則，表明樣品DNA濃度較大且片段較完整。綜合比較條帶亮度及其片段分布情況，5、6，15、16，17、18，21、22泳道，即方法1的大腸桿菌、方法3的枯草芽孢桿菌、方法3的大腸桿菌以及方法4的枯草芽孢桿菌提取效果較好，此外方法2就總體效果而言也較好。

[FK（W17][TP凌云1.tif]

3討論與結(jié)論

評價一種DNA提取方法優(yōu)劣的主要依據(jù)是DNA是否量多、純度好、片段足夠完整以及能否準(zhǔn)確反映樣品中微生物種群的多樣性[10]。僅從DNA濃度與純度看，本研究方法1對于金黃色葡萄球菌與大腸桿菌裂解效果較好；方法2對于3種細(xì)菌效果都不錯，但對于大腸桿菌提取的DNA含量較其他2種菌有些偏低；方法3對于金黃色葡萄球菌與大腸桿菌相對來說效果較明顯；在方法4中，金黃色葡萄球菌的裂解提取效果最佳。但如果結(jié)合電泳圖并考慮提取的DNA量多而且片段也相對較大，適合進(jìn)一步進(jìn)行其他研究的話，則本試驗中最適合金黃色葡萄球菌的裂解提取DNA的方法為方法2，最適合枯草芽孢桿菌裂解提取DNA的方法為方法3，最適合大腸桿菌裂解提取DNA的方法為方法3。此外，方法2（溶菌酶+SDS）在本試驗中裂解獲得DNA的量是最多的，在有關(guān)文獻(xiàn)中也證實該方法既簡便效果又較理想[11]，但從本試驗來看，DNA高釋放率的同時也存在大量蛋白質(zhì)造成污染，以及少量的RNA，因此該方法若進(jìn)一步改進(jìn)，可加入蛋白酶K及少量RNA水解酶，減少污染、提高提取的DNA濃度，則該方法將進(jìn)一步成為4種方法中最優(yōu)最有效率的方法。而且，過夜等步驟使得試驗時間加長，這樣DNA容易出現(xiàn)降解和斷裂的現(xiàn)象[12]，因此，應(yīng)盡量尋求試驗所需時間更短的方法，最大限度地減少提取的DNA片段的再次斷裂、降解。另外，根據(jù)所查閱的部分文獻(xiàn)[13-14]，也可考慮增加PCR擴(kuò)增這一步驟，通過對PCR產(chǎn)物的檢驗，不但能使試驗結(jié)果的顯著性進(jìn)一步提[CM（25]高，也可檢驗各種方法所提取的DNA是否適于進(jìn)行PCR[CM）]

擴(kuò)增。

[HS2][HT8.5H]參考文獻(xiàn)：[HT8.SS]

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