王梓+李勇+王蓉+丁萬(wàn)隆

[摘要]WRKY轉(zhuǎn)錄因子是高等植物中最重要的轉(zhuǎn)錄因子基因家族之一，其在植物形態(tài)建成、生長(zhǎng)發(fā)育以及應(yīng)對(duì)生物（病菌、害蟲(chóng)等）、非生物（干旱、鹽、冷、熱等）脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。該研究根據(jù)人參化感自毒物質(zhì)苯甲酸誘導(dǎo)的人參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)全長(zhǎng)擴(kuò)增引物，利用RTPCR方法獲得1條編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子的基因，暫命名為WRKY7，并對(duì)其進(jìn)行TA克隆、測(cè)序和序列分析。該基因cDNA全長(zhǎng)1 216 bp，其開(kāi)放閱讀框（open reading frame， ORF）為1 014 bp，編碼337個(gè)氨基酸。序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，該蛋白屬于WRKY家族第Ⅲ類(lèi)成員，與西洋參種的WRKY6轉(zhuǎn)錄因子親緣關(guān)系最近，同源性為87%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，苯甲酸脅迫后WRKY7的表達(dá)量顯著升高，推測(cè)該基因可能參與了人參響應(yīng)苯甲酸脅迫的過(guò)程，為進(jìn)一步研究人參自毒脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]人參； WRKY轉(zhuǎn)錄因子； 化感自毒作用； 克??； 序列分析

[Abstract]WRKY transcription factor is one of the most important transcription factor families widely existing in higher plants， which playing critical role in plant morphogenesis， development， biotic （including phytopathogens， pests etc.） and abiotic （drought， salt， chilling， high temperature， etc.） stress. In the present work， primers used to amplify fulllength gene encoding WRKY transcription factor were designed based on the transcriptome data of P. ginseng that induced by benzoic acid， one of the most important autotoxins identified from root exudates and rhizosphere soil of P. ginseng. Then， a WRKY gene， temporarily named as WRKY7， was confirmed by RTRCR. Furthermore， sequencing and sequence analysis of WRKY7 was conducted. Results indicated that， the full length cDNA of WRKY7 was 1 216 bp， the open reading frame （ORF） of which was 1 014 bp， encodes 337 amino acids. Homologous analysis and phylogenetic tree showed that， WRKY7 belonged to the Ⅲ category of WRKY families， which showing 87% similarity to WRKY6 in P. quinquefolius. Realtime PCR results showed that the expression of WRKY7 in P. ginseng induced by benzoic acid was upregulated markedly than the control， so we speculated that WRKY7 was involved in the response to benzoic acid stress， which will be helpful for further research on the molecular mechanism of ginseng plant response to benzoic acid stress.

[Key words]Panax ginseng； WRKY transcription factors； autotoxicity； cloning； bioinformatic analysis

轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)含有DNA結(jié)合域的蛋白質(zhì)，能識(shí)別基因上游特異的核苷酸序列，形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體從而激活或抑制靶基因的表達(dá)，WRKY是植物十大轉(zhuǎn)錄因子家族之一。這類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子最早發(fā)現(xiàn)于甘薯[1]，后相繼從20余種植物中分離出WRKY轉(zhuǎn)錄因子[2]。WRKY蛋白的共同特點(diǎn)是含有60個(gè)氨基酸組成的WRKY結(jié)構(gòu)域，在N端有一段高度保守的WRKYGQK多肽序列，其是WRKY結(jié)構(gòu)域的核心，如果上述氨基酸發(fā)生變異，將直接影響WRKY轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性[3]。根據(jù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)，可將WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為3類(lèi)[4]：第Ⅰ類(lèi)含有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2型；第Ⅱ類(lèi)含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2型；第Ⅲ類(lèi)含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC型。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子與植物生長(zhǎng)發(fā)育、衰老及環(huán)境脅迫響應(yīng)密切相關(guān)。當(dāng)植物遭受生物脅迫時(shí)，WRKY蛋白通過(guò)多通路、多層次調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物對(duì)脅迫信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[5]。例如：AtWRKY33超表達(dá)可提高擬南芥對(duì)灰霉病和黑斑病的抗病性[6]。干旱、高溫、物理?yè)p傷等非生物脅迫同樣可以激發(fā)WRKY基因高表達(dá)，以幫助植物抵御外界不良環(huán)境[7]。例如：擬南芥AtWRKY18，AtWRKY33，AtWRKY40，AtWRKY46表達(dá)量增加能提高植株耐熱性[8]；大豆GmWRKY21過(guò)量表達(dá)可增強(qiáng)擬南芥的抗寒能力[9]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境信號(hào)傳遞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，1個(gè)WRKY基因往往能響應(yīng)多種脅迫信號(hào)，而多個(gè)WRKY基因之間則形成復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

人參是五加科多年生藥用植物，連作障礙嚴(yán)重影響人參產(chǎn)量和品質(zhì)。已有研究表明，苯甲酸對(duì)人參具有明顯的自毒活性[10]。本課題組前期開(kāi)展了苯甲酸脅迫下的人參轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與苯甲酸脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因、過(guò)氧化物酶基因、活性氧及人參皂苷合成相關(guān)基因。本文在已有研究基礎(chǔ)上，利用RTPCR技術(shù)克隆獲得1條WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因，暫命名為WRKY7。進(jìn)而比較了該基因與其他WRKY家族基因的序列結(jié)構(gòu)差異，通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析了其與已知WRKY蛋白的關(guān)系。最終，通過(guò)Realtime PCR方法檢測(cè)了WRKY7在苯甲酸脅迫條件下的表達(dá)情況。本文為深入研究轉(zhuǎn)錄因子WRKY7的生物學(xué)功能奠定了理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

11植物

取三年生人參幼苗，參考李勇等[11]的配方，用營(yíng)養(yǎng)液和石英砂培養(yǎng)人參幼苗直至幼苗完全展開(kāi)。人參苗脅迫處理參考Wu等[12]。分別于處理后第0，1，3，5，7，9天采集對(duì)照組和處理組人參根部樣品，每次取4株人參幼苗的毛根，混合保存于液氮中。

12試劑

苯甲酸（分析純，北京化學(xué)試劑有限公司）；RNA Trizol提取試劑盒（Invitrogen公司）；Dnase Ⅰ（RNaseFree）酶、RTase MMLV（RNase H）逆轉(zhuǎn)錄酶、Premix Taq酶、2×SYBR Premix Ex Taq酶、pMD18T載體均來(lái)自TaKaRa公司；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞（TIANGEN公司）；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；瓊脂糖（Biowest公司）；本實(shí)驗(yàn)所用引物均由Sunbio公司合成。

13儀器

3K30臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Sigma）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Nanodrop2000）；基因擴(kuò)增儀（BIORAD）；熒光定量PCR儀（BIORAD）；凝膠成像儀（BIORAD）；DYY6C電泳儀（北京市六一儀器廠）；臺(tái)式微量冷凍離心機(jī)（Beckman）；移液器（Drangonlab）；高壓滅菌鍋（華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（泰斯特儀器有限公司）；超凈工作臺(tái)（亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司）。

14RNA提取和cDNA合成

取人參根部樣品在液氮中研磨，用Trizol法提取人參根部總RNA，用Dnase I（RNaseFree）對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行處理，去除RNA中的DNA，并對(duì)其進(jìn)行濃度測(cè)定。取上述提取的RNA模板1 μg，加入Random primer 1 μL，再加DEPC水至6 μL，將上述體系混勻后70 ℃孵育10 min，迅速冰浴2 min，加入5×RTase MMLV buffer 2 μL，dNTP（10 mmol·L-1）05 μL，RNase inhibitor 05 μL，RTase MMLV（RNase H）逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，25 ℃反應(yīng)5 min，42 ℃反應(yīng)60 min，70 ℃保溫15 min，即可得到cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

15WRKY7基因的擴(kuò)增和克隆

根據(jù)RNAseq拼接數(shù)據(jù)返回的序列，利用Primer 3（http：//primer3utee/）設(shè)計(jì)引物（表1），擴(kuò)增基因的完整編碼區(qū)。以人參cDNA為模板，按照如下體系擴(kuò)增人參WRKY7基因：cDNA模板1 μL，Premix Taq酶125 μL，10 μmol·L1上下游引物各1 μL，ddH2O 95 μL，終體積為25 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，Axygen凝膠回收試劑盒用于目的片段的回收。將回收產(chǎn)物5 μL，Ligation solution Ⅰ 5 μL，pMD18T載體05 μL混勻置于4 ℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，然后在含有氨芐的LB平板上培養(yǎng)，挑取單克隆，經(jīng)菌落PCR檢測(cè)后選擇陽(yáng)性克隆送Sunbio公司測(cè)序。

16WRKY7基因的生物信息學(xué)分析

用NCBI網(wǎng)站ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）尋找WRKY7基因的編碼框。

17實(shí)時(shí)熒光定量PCR

為了檢測(cè)人參WRKY7基因的表達(dá)情況，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)該基因經(jīng)苯甲酸脅迫誘導(dǎo)后在人參根部的表達(dá)量。根據(jù)WRKY7基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，將人參40S核糖體蛋白基因作為內(nèi)參基因設(shè)計(jì)引物（表1）。以苯甲酸處理不同時(shí)間后所提取的人參RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系20 μL，包括：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，10 μmol·L-1上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL 。每個(gè)體系至少重復(fù)3次。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，59 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)；最后60 ℃延伸5 s，4 ℃保溫。

2結(jié)果與分析

21人參WRKY7基因的克隆

通過(guò)將處理組植物RNA送到公司建庫(kù)和生物信息學(xué)分析，從人參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)1條2 053 bp的轉(zhuǎn)錄本，功能注釋為WRKY轉(zhuǎn)錄因子，推測(cè)其與苯甲酸脅迫響應(yīng)相關(guān)。分析發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)錄本含有1個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）。根據(jù)ORF序列設(shè)計(jì)基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物WRKY7F和WRKY7R，以苯甲酸脅迫不同時(shí)間的反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到1條長(zhǎng)1 216 bp條帶（圖1）。測(cè)序結(jié)果經(jīng)ORF Finder分析，確定其開(kāi)放閱讀框?yàn)? 014 bp，編碼337個(gè)氨基酸。為區(qū)別已知人參WRKY基因，將擴(kuò)增出的基因暫命名為WRKY7（GenBank登錄號(hào) KX255632）。

22人參WRKY7基因編碼蛋白質(zhì)特性分析

221人參WRKY7編碼氨基酸序列分析通過(guò)NCBI開(kāi)放閱讀框分析表明其ORF為1 014 bp，蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)其編碼337個(gè)氨基酸。其中第129～132位分別為色氨酸（W），精氨酸（R），賴氨酸（K），酪氨酸（Y），符合WRKY基因家族標(biāo)志性結(jié)構(gòu)，其下游有典型的“C2HC”型鋅指結(jié)構(gòu)，說(shuō)明該蛋白屬于WRKY家族第Ⅲ類(lèi)。

222WRKY7編碼蛋白理化性質(zhì)分析利用ExPASy Proteomics Server提供的在線軟件Protparam預(yù)測(cè)WRKY7編碼蛋白的理化性質(zhì)。WRKY7編碼蛋白由337個(gè)氨基酸編碼，分子式為C1669H2619N463O539S14，總原子數(shù)為5 304。相對(duì)分子質(zhì)量38243 7 kDa，理論等電點(diǎn)pI為563，帶正電殘基（Arg+Lys）為39，帶負(fù)電殘基（Asp+Glu）為46。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為4798，表明WRKY7編碼蛋白不穩(wěn)定。脂肪系數(shù)為6564，總平均親水性系數(shù)為-0741。

223WRKY7編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析及功能結(jié)構(gòu)域分析利用SPOMA對(duì)WRKY7編碼蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。WRKY7編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋（alpha helix）占2255%、延伸鏈（extended strand）占2255%、β折疊（beta turn）占712%、無(wú)規(guī)卷曲（random coil）占4777%。InterProScan分析發(fā)現(xiàn)，WRKY7編碼蛋白含有1個(gè)保守的WRKY結(jié)構(gòu)域（WRKY domain，IPR003657），位于第114～186位氨基酸殘基（圖2）。

224WRKY7編碼蛋白三維建模用SWISSMODEL三維建模工具作圖，以擬南芥WRKY transcription factor 1為模板（PDB id：2ayd），對(duì)人參WRKY7編碼蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)建模，預(yù)測(cè)其空間結(jié)構(gòu)（圖3）。

225WRKY7編碼蛋白信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位、跨膜預(yù)測(cè)分析利用SignalP40 Server預(yù)測(cè)WRKY7編碼蛋白不具有信號(hào)肽。利用在線工具WOLF PSORT預(yù)測(cè)該蛋白的亞細(xì)胞定位情況，結(jié)果顯示其細(xì)胞核的定位系數(shù)為13（nucl：13），表明該蛋白最可能定位于細(xì)胞核。TMHMM Server V20預(yù)測(cè)結(jié)果表明，WRKY7編碼蛋白無(wú)跨膜區(qū)。

226WRKY7基因序列相似性分析同源性分析結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)該基因序列與人參Pginseng WRKY6（KT2775471）有87%的相似度；與西洋參P quinquefolius WRKY6（JF9271621），WRKY9（JF9271651）也有87%的相似度；與杭菊Chrysanthemum morifolium WRKY3（KC2922151），WRKY9（KC6153631）有75%的相似度；與大豆Glycine max WRKY60（NM_0012517481）有75%的相似度。WRKY7編碼的氨基酸序列在NCBI中分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白與人參P ginseng相似性最高（82%，ALS204001），其次為西洋參P quinquefolius（81%，AEQ290191），龍眼Dimocarpus longan（51%，AEO314762），胡楊Populus euphratica（51%，XP_0110378711），葡萄Vitis aestivalis（51%，AAR924771）等。

227氨基酸多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析從NCBI比對(duì)結(jié)果中選出9條與WRKY7編碼蛋白同源性較高的氨基酸序列，經(jīng)多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，其與人參、西洋參WRKY基因有著廣泛的相似度，其N(xiāo)端含有WRKY家族標(biāo)志性片段WRKYGQK，C端鋅指結(jié)構(gòu)為CX7CX23HX1C（圖4）。說(shuō)明其屬于WRKY家族第Ⅲ類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。上述基因的WRKY結(jié)構(gòu)域高度保守，其他區(qū)域的可變性較高。

紅色為相對(duì)保守的氨基酸殘基；藍(lán)色為保守度低的氨基酸殘基；灰色為殘基數(shù)量無(wú)法完全匹配的序列；少于50%的序列無(wú)法匹配的部分用大寫(xiě)字母表示，多于50%的序列無(wú)法匹配的部分用小寫(xiě)字母表示。

為進(jìn)一步了解人參WRKY7與其他WRKY家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載了其他19個(gè)物種23條WRKY家族成員的蛋白序列，Mega 70繪制的NeighborJoining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，人參WRKY7與西洋參PqWRKY6、PqWRKY9親緣關(guān)系最近（圖5）。這暗示著它們可能具有相似的生物學(xué)功能。

23苯甲酸脅迫下人參WRKY7基因的表達(dá)分析

為驗(yàn)證人參WRKY7在苯甲酸脅迫下的表達(dá)情況，對(duì)該基因進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)分析（圖6）。其中0 d樣品為混樣，對(duì)照組和處理組共用一個(gè)。結(jié)果顯示，苯甲酸脅迫誘導(dǎo)后WRKY7的表達(dá)水平明顯上調(diào)，在第5天和第9天時(shí)表達(dá)量最高。同時(shí)與對(duì)照相比，處理組的表達(dá)量在第3，5，9天時(shí)分別是對(duì)照組的

3討論

植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因以家族的形式存在，作為一種重要的誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)因子，參與多種植物抗逆反應(yīng)及生長(zhǎng)發(fā)育與生理生化代謝過(guò)程。目前，WRKY轉(zhuǎn)錄因子已被證明參與了植物響應(yīng)生物脅迫[13]、非生物脅迫[14]、生長(zhǎng)發(fā)育[15]、衰老[16]等生理過(guò)程。當(dāng)植物受到外源物質(zhì)脅迫時(shí)，植物細(xì)胞膜上某些受體會(huì)被識(shí)別，進(jìn)而激活促分裂原激活蛋白激酶信號(hào)通路，通過(guò)磷酸化或去磷酸化將胞外信號(hào)傳導(dǎo)入細(xì)胞核內(nèi)，抑制或激活WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[17]，進(jìn)而與下游目標(biāo)基因啟動(dòng)機(jī)子區(qū)的Wbox進(jìn)行特異性結(jié)合[18]，從而調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)。

本研究通過(guò)對(duì)苯甲酸脅迫人參轉(zhuǎn)錄組的生物信息學(xué)分析，從中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因WRKY7，其與人參WRKY6基因（KT2775471）相似度為87%，所編碼的氨基酸序列相似度為82%。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，WRKY7有一個(gè)高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，下端鋅指結(jié)構(gòu)為CX7CX23HX1C，屬于′C2HC′型，為WRKY家族的第Ⅲ類(lèi)。該基因與擬南芥AtWRKY53有較高的同源性，AtWRKY53被報(bào)道受到干旱[19]、機(jī)械損傷[20]等誘導(dǎo)，故而推測(cè)人參WRKY7基因可能也具有類(lèi)似功能。研究發(fā)現(xiàn)，苯甲酸脅迫后人參WRKY7基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)，暗示其在人參響應(yīng)自毒物質(zhì)脅迫過(guò)程中扮演重要角色。WRKY7有可能進(jìn)一步啟動(dòng)了下游抗逆基因的表達(dá)，從而提高了植物對(duì)苯甲酸脅迫的耐受性。

目前，針對(duì)人參化感自毒作用分子機(jī)制的研究尚處于起步階段，本課題組前期通過(guò)分析化感自毒物質(zhì)誘導(dǎo)下人參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的差異，發(fā)現(xiàn)了大量與人參生長(zhǎng)發(fā)育、抗病抗逆等密切相關(guān)的差異性表達(dá)基因，但對(duì)于這些轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的挖掘還不夠深入，對(duì)于關(guān)鍵基因響應(yīng)化感自毒物質(zhì)的通路尚不明確。WRKY作為參與植物非生物脅迫響應(yīng)的一類(lèi)重要轉(zhuǎn)錄因子，其在響應(yīng)自毒脅迫中的作用值得關(guān)注。本研究后續(xù)將構(gòu)建過(guò)量表達(dá)載體，并將WRKY7基因轉(zhuǎn)入擬南芥，通過(guò)重組體篩選及脅迫測(cè)驗(yàn)，進(jìn)一步研究該基因的生物學(xué)功能。同時(shí)會(huì)繼續(xù)對(duì)已獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析，探究不同轉(zhuǎn)錄因子基因在苯甲酸脅迫下的生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為深入闡釋人參響應(yīng)化感自毒物質(zhì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以及自毒脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

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[責(zé)任編輯呂冬梅]