李麗++李云

摘要：利用酶解法從貴州省甘薯地方品種興義薯和二倍體近緣野生種三淺裂野牽牛（I.trifida）的無菌試管苗幼嫩葉柄中分離得到大量原生質(zhì)體。用聚乙二醇（PEG）融合法融合這2個品種的原生質(zhì)體，將融合原生質(zhì)體培養(yǎng)在含有0.05 mg/L 2，4-D和 0.5 mg/L KT的改良MS培養(yǎng)基中。結果表明，3～5 d后融合原生質(zhì)體發(fā)生第1次細胞分裂；培養(yǎng)12周后，形成直徑達1～2 mm的小愈傷組織。將這些小愈傷組織轉移到含有0.05 mg/L 2，4-D和0.5 mg/L KT的MS培養(yǎng)基上，使愈傷組織增殖。

關鍵詞：甘薯；三淺裂野牽牛（I.trifida）；原生質(zhì)體；PEG融合法

中圖分類號： S531.01文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0094-02

收稿日期：2015-11-04

基金項目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金（編號：CARS-11-C-24）；貴州省農(nóng)業(yè)科學院研究生科研創(chuàng)新基金（編號：黔農(nóng)科合[創(chuàng)新基金]2012008）。

作者簡介：李麗（1982—），女，貴州銅仁人，碩士，副研究員，從事甘薯生物技術育種研究。E-mail：ilovelily317@163.com。

通信作者：李云，碩士，研究員，從事甘薯育種研究。E-mail：814480795@qq.com。

貴州省甘薯地方品種較少，且產(chǎn)量低、易感病，制約著貴州甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，為了豐富貴州省甘薯資源，改良甘薯品質(zhì)特性，須將地方品種與具有優(yōu)異基因的野生種進行雜交，從而創(chuàng)造特異的甘薯新材料。而甘薯常規(guī)育種一般采用有性雜交和自然芽變的方法進行系統(tǒng)選擇，這些方法具有一定的局限性。近年發(fā)展起來的原生質(zhì)體融合技術，對甘薯品種改良和育種具有重要意義。通過原生質(zhì)體融合，不同種類的原生質(zhì)體不經(jīng)過有性階段，在一定條件下融合創(chuàng)造雜種，能克服甘薯雜交不親和性，創(chuàng)造甘薯種間雜種。國內(nèi)外原生質(zhì)體融合技術在甘薯上的應用已取得很大進展，不僅獲得了甘薯融合原生質(zhì)，而且培育出雜種植株。Sihachakr等首次獲得了甘薯原生質(zhì)的再生植株體系，改良了甘薯品質(zhì)[1]。Belarmino等用電融合法融合甘薯和三淺裂野牽牛（Ipmoea trifida）（四倍體）的原生質(zhì)體，獲得1株再生植株[2]。Liu等用聚乙二醇（PEG）融合法獲得甘薯和I.triloba及I.lacunosa的融合原生質(zhì)體，獲得少量再生植株[3-7]。Zhang等獲得了甘薯品種栗子香和I. lacunosa的種間體細胞雜種植株[8]。Guo等獲得了甘薯品種徐薯18和I. cairica的46株種間體細胞雜種植株[9]。Yang等獲得徐薯18與I. triloba的體細胞雜種植株，并從中篩選出具有膨大塊根的抗旱雜種植株[10]。王晶珊等利用PEG融合方法，獲得甘薯（I. batatas）B不親和群內(nèi)品種Koganesengan和Bitambi的45株原生質(zhì)體再生植株[11]。但是，目前貴州省尚未有此方面的報道。因此，本研究以甘薯二倍體近緣野生種三淺裂野牽牛（I.trifida）與貴州省地方品種興義薯為材料，對其原生質(zhì)體融合進行研究，對于豐富貴州省甘薯種質(zhì)資源、改善甘薯品質(zhì)都具有一定的意義。

1材料與方法

1.1植物材料

供試材料為貴州省甘薯地方品種興義薯和二倍體近緣野生種三淺裂野牽牛（I.trifida）。用其無菌試管苗的幼嫩葉柄分離原生質(zhì)體。

1.2葉柄原生質(zhì)體分離和融合

根據(jù)Liu等的培養(yǎng)方法[3-7]，利用酶解法從貴州省甘薯地方品種興義薯和I.trifida的葉柄分離得到大量原生質(zhì)體。在融合處理之前，用W5液[125.0 mmol/L CaCl2·2H2O、154.0 mmol/L NaCl、5.0 mmol/L KCl、5.0 mmol/L葡萄糖、5.0 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸（MES），pH值為5.6]于 2 000 r/min、4 min離心洗滌1次后，收集原生質(zhì)體，懸浮于W5液中，使其密度約為 106個/mL。以體積比2 ∶[KG-*3]1混合興義薯和野生種I.trifida的原生質(zhì)體懸浮液，將原生質(zhì)體混合液滴于培養(yǎng)皿底部，在其上滴加PEG融合液[30.0% PEG 6000、0.1 mol/L Ca（NO2）2·4 H2O、0.5 mol/L甘露醇，pH值為9.0]，處理10 min。融合處理后，將融合原生質(zhì)體用W5液洗1次，再用培養(yǎng)基洗2次后進行培養(yǎng)。

1.3融合原生質(zhì)體培養(yǎng)和愈傷組織的形成

根據(jù)Liu等的培養(yǎng)方法[3-7]，將融合原生質(zhì)體培養(yǎng)在含有0.05 mg/L 2，4-D和0.5 mg/L KT的改良MS培養(yǎng)基中，用Parafilm將培養(yǎng)皿密封，將融合原生質(zhì)體放在27 ℃、黑暗條件下靜置培養(yǎng)。4周后，將培養(yǎng)基的甘露醇濃度降低到 0.3 mol/L，蔗糖濃度增至2.0%，其余成分不變。培養(yǎng)8周后，將形成的小愈傷組織轉入到含有0.05 mg/L 2，4-D、0.5 mg/L KT和3.0%蔗糖的MS培養(yǎng)基中，在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)。12周后形成直徑1.0～2.0 mm的小愈傷組織，并將其轉移到添加0.05 mg/L 2，4-D和0.5 mg/L KT的固體培養(yǎng)基上，在（27±1） ℃、黑暗條件下培養(yǎng)，使愈傷組織增殖。

2結果與分析

2.1原生質(zhì)體分離和融合

由圖1可知，利用酶解法從貴州省甘薯地方品種興義薯和近緣野生種（I.trifida）無菌苗的幼嫩葉柄中分離得到大量原生質(zhì)體，呈球形，大小不一，不易看到細胞核。在PEG融合液的作用下，2個親本的原生質(zhì)體迅速發(fā)生融合。在倒置顯微鏡下觀察可見，原生質(zhì)體既有二重融合、多重融合，也有未融合的單個原生質(zhì)體。

2.2融合原生質(zhì)體培養(yǎng)及愈傷組織形成

由圖2可知，將分離得到的原生質(zhì)體培養(yǎng)于改良的MS液體培養(yǎng)基中，3～5 d內(nèi)觀察到首次細胞分裂。由圖3可見，培養(yǎng)4周后，細胞分裂形成細胞團。將融合原生質(zhì)體懸浮于液體培養(yǎng)基中，于27 ℃黑暗培養(yǎng)12周后，由圖4可見，細胞團形成直徑為1.0～2.0 mm的白色松脆愈傷組織，將其轉移到添加0.05 mg/L 2，4-D和0.5 mg/L KT的固體培養(yǎng)基上，在27 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，可使愈傷組織增殖。

3討論與結論

本研究利用與Liu等[3-7]相似的培養(yǎng)體系，愈傷組織形成慢，雜種植株再生率低，這與前人報道[1，3-7]一致，其主要原因是葉柄作為分離原生質(zhì)體的材料不理想。劉慶昌等建立了甘薯胚性細胞懸浮培養(yǎng)系，能在短時間內(nèi)獲得大齡再分化能力高的胚性懸浮細胞[12]。張冰玉等利用甘薯品種栗子香的胚性懸浮細胞原生質(zhì)體獲得與I.triloba葉柄原生質(zhì)體的融合產(chǎn)物，獲得了大量種間體細胞雜種植株[13]。王晶珊等利用甘薯品種Bitambi的胚性愈傷組織原生質(zhì)體實現(xiàn)了高頻率的植株再生[11]。甘薯本身是再分化比較困難的植物[7，11]，整個培養(yǎng)過程太長，一般達半年以上，過長的培養(yǎng)周期也會降低細胞的分化能力。如果原生質(zhì)體數(shù)量過少或者活力較差，也會影響彼此間的融合。所以甘薯及其近緣野生種的原生質(zhì)體融合需要大量有活力的甘薯品種及近緣野生種的原生質(zhì)體，而且還需要適合融合原生質(zhì)體植株再生的培養(yǎng)體系。因此，在下一步試驗中，筆者將利用甘薯胚性懸浮細胞進行原生質(zhì)體分離、培養(yǎng)與融合，優(yōu)化原生質(zhì)體雜種植株再生體系，以便獲得大量愈傷組織，實現(xiàn)種間體細胞雜種植株的有效再生。

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