彭麒朕 耿建國 鄒大威 高彥彬 龔慕辛 吳曉明 尚雅文

·論著·

糖腎寧對高糖培養(yǎng)的小鼠系膜細胞TGF-β1和P38MAPK表達的影響

彭麒朕 耿建國 鄒大威 高彥彬 龔慕辛 吳曉明 尚雅文

目的 觀察糖腎寧對高糖培養(yǎng)的小鼠系膜細胞轉化生長因子-1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen activated protein kinases，P38MAPK)表達的影響。方法 以體外高糖培養(yǎng)的小鼠系膜細胞為研究對象，實驗分為正常對照組、高糖培養(yǎng)組、高糖+纈沙坦組和高糖+糖腎寧高、中、低劑量組，使用大鼠含藥血清給藥分別處理24小時，用ELISA法檢測細胞上清液中纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)的含量水平；運用Western Blot方法檢測P-P38MAPK、環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)、TGF-β1的蛋白水平。結果 與正常對照組比較，高糖培養(yǎng)組系膜細胞上清液中FN蛋白表達明顯升高(P<0.05)；與高糖組比較，糖腎寧組能明顯抑制P38MAPK及其下游核轉錄因子CREB 的水平，下調TGF-β1和FN的表達(P<0.05)。結論 糖腎寧能夠抑制細胞外基質增生，可能與下調TGF-β1，抑制P38MAPK/CREB信號通路的激活，從而抑制FN等細胞外基質的合成有關。

糖腎寧； 糖尿病腎??； 轉化生長因子-β1； 纖維連接蛋白

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

小鼠腎小球系膜細胞(SV40 MES 13)，中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心提供。

1.2 實驗動物

8周齡SPF級雄性SD大鼠20只，體質量(250±20)g，均購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物合格證號：SCXK(京)2014-0004。

1.3 實驗藥物

糖腎寧(主要藥物配比：黃芪4份、金櫻子2份、川芎1份、大黃1份、葛根2份，由首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院中藥制劑室制備成浸膏粉)；纈沙坦膠囊(商品名：代文，規(guī)格：80 mg/粒，批號X1448，北京諾華制藥有限公司)。

1.4 主要試劑

Anti-p38 antibody [M138](abcam)，Anti-CREB antibody [E306](abcam)，Anti-p38(phospho T180+Y182) antibody [M139](abcam)，Anti-TGF beta 1 antibody(abcam)，(FN)ELISA Kit(Cusabio)，DMEM低糖(Gibco)，0.05%胰蛋白酶溶液/EDTA(Gibco)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京鼎國昌盛)，胎牛血清(Hyclone)。

根據(jù)前面調查，農村戶籍的訂單定向醫(yī)學生具有比城鎮(zhèn)戶籍的訂單定向醫(yī)學生更害怕失敗的特點，學校應該完善其課程體系，注意做好相關思想教育工作。

1.5 主要儀器

顯微攝像系統(tǒng)(Nikon Eclipse 80i，北京瑞馳恒業(yè)儀器科技有限公司),低溫生物離心機(SIGMA，3K15，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)，電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9245A型，上海一恒科學儀器有限公司)，電子天平(YP601N，上海精密科學儀器有限公司)，酶標儀(MR-96A，深圳邁瑞)，CO2細胞培養(yǎng)箱(HERAcell240i，賽默飛世爾)。

1.6 制備含藥血清

選取SD大鼠20只，隨機分為2組，含藥血清組(15只)和空白對照組(5只)，大鼠給藥量按人和動物體表面積折算：大鼠給藥量為人體等效劑量8倍，即61.2 g/(kg·d)進行灌胃，空白對照組用生理鹽水，每天灌胃1次(2.25 mL/250 g)，連續(xù)灌胃7天。末次灌胃1小時后腹主動脈取血，將采集的血液在室溫中靜置4小時，3000 rpm，離心15分鐘，收集血清，56°C水浴30分鐘進行滅活，然后過濾除菌，分裝。

1.7 實驗分組及藥物濃度篩選

取對數(shù)期生長低糖培養(yǎng)的4～8代SV40 MES 13小鼠腎小球系膜細胞，消化收集，接種于96孔板培養(yǎng)待細胞完全貼壁，棄上清，加入不含胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，同步化24小時后，吸掉培養(yǎng)上清，分組加入藥物血清。實驗分組：正常對照組(N組，用D-葡萄糖濃度為5.5 mmol/L的低糖型DMEM培養(yǎng)液)；高糖培養(yǎng)組(H組，用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液)；高糖+糖腎寧組(用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液分別加61.2 g/(kg·d)、30.6 g/(kg·d)、7.65 g/(kg·d)三個劑量10%糖腎寧含藥血清，分別命名T組、MT組、LT組)；高糖+纈沙坦組(V組，30 mmol/L 葡萄糖+10 μmol/L纈沙坦)干預24小時，每組設5復孔。置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24小時后待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測細胞上清液中FN，細胞按5×104/孔，接種于96孔板培養(yǎng)，分組同上，于24小時收集各組上清100 μL，按FN試劑盒說明書嚴格步驟操作。

1.8 Western blot法檢測小鼠腎小球系膜細胞P-P38MAPK、TGF-β1、CREB的蛋白含量

SV40 MES 13小鼠腎小球系膜細胞以2.5×107/L的密度接種到60 mm培養(yǎng)皿中，待細胞生長至對數(shù)期時，換無血清培養(yǎng)24小時饑餓同步化后，吸掉培養(yǎng)上清，分組加入纈沙坦藥物、糖腎寧含藥血清，實驗分組：正常對照組(N組，用D-葡萄糖濃度為5.5 mmol/L的低糖型DMEM培養(yǎng)液)；高糖培養(yǎng)組(H組，用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液)；糖腎寧組(T組，用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液+61.2 g/(kg·d) 10%糖腎寧含藥血清)；纈沙坦組(V組，30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L纈沙坦)。干預24小時后終止培養(yǎng)，棄去瓶內培養(yǎng)基，用PBS液沖洗2次，吸干，加入細胞裂解液(RIPA和PMSF混合液)80 μL，放于冰上用細胞刮刮取3分鐘，吸出培養(yǎng)瓶內和刮子上的液體至1.5 mL的EP管中，測定各組蛋白含量，用10%的SDS-PAGE電泳分離分離蛋白質，每孔取40 μg總蛋白含量上樣，用電泳儀將蛋白質轉印至PVDF膜，TBS-T洗膜三次，每次5分鐘，5%的脫脂奶粉封閉1小時，用TGF-β1一抗、磷酸化P38MAPK一抗、CREB一抗，4℃孵育過夜，隔日TBS-T洗膜三次，每次5分鐘，之后加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1小時，TBS-T洗膜三次，每次5分鐘，洗膜后加化學發(fā)光劑暗室膠片曝光。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 糖腎寧對高糖誘導的小鼠腎小球系膜細胞上清液中FN表達的影響

與正常對照組比較，高糖組系膜細胞上清液中FN含量顯著增加(P<0.05)；與高糖組比較，糖腎寧高、中劑量組上清液中FN含量均顯著減少(P<0.05)，其中高劑量組FN減少最為顯著，低劑量組FN含量與高糖組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；高、中、低劑量組FN的含量進行兩兩比較，均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，表明糖腎寧對高糖誘導的小鼠腎小球系膜細胞上清液中FN表達的影響呈現(xiàn)劑量依賴性。故選擇T組進行實驗。詳見表1。

表1 各組小鼠腎小球系膜細胞上清液中FN的表達情況

注： 與N組相比，aP<0.05；與H組相比，bP<0.05；與T組相比，cP<0.05；與MT組相比，dP<0.05。

2.2 糖腎寧對高糖誘導的小鼠腎小球系膜細胞中TGF-β1、P-P38MAPK、CREB蛋白水平表達的影響

與N組相比較，H組TGF-β1蛋白水平表達均明顯均上調(P<0.05);與H組比較，T組、V組的TGF-β1蛋白表達均明顯下調(P<0.05)。與N組相比較，H組P-P38MAPK蛋白水平表達均明顯均上調(P<0.05);與H組比較，T組、V組P-P38MAPK蛋白表達均明顯下調(P<0.05)。與N組相比較，H組CREB蛋白水平表達均明顯均上調(P<0.05);與H組比較，T組、V組CREB蛋白表達均明顯下調(P<0.05)。詳見表2，圖1～3。

表2 各組細胞中TGF-β1、P-P38MAPK、CREB蛋白水平表達±s)

注： 與N組比較，aP<0.05；與H組比較，bP<0.05。

圖1 各組細胞中TGF-β1蛋白的表達條帶

圖2 各組細胞中P-P38MAPK蛋白的表達條帶

圖3 各組細胞中CREB蛋白的表達條帶

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病最嚴重和最常見的并發(fā)癥，也是臨床慢性腎衰竭最主要的原發(fā)病[5]。中國是糖尿病大國，根據(jù)國際最新臨床診斷標準，中國成年人群的糖尿病總體發(fā)病率約為11.6%，糖尿病前期的發(fā)病率是50.1%[6]；估計中國約有1.139億糖尿病患者，4.934億糖尿病前期患者，其中約有30%的1型糖尿病和20%的2型糖尿病發(fā)展為DN[7]。DN的主要病理改變?yōu)槟I小球基底膜增厚、腎小球系膜細胞增殖細胞外基質積聚擴張導致腎小球硬化、纖維化[8]。其中P38MAPK通路在DN的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，高糖環(huán)境可直接激活P38MAPK的信號轉導[9]，P38MAPK與TGF-β1互為作用，TGF-β1與P38MAPK通路的激活有關[10]，P38MAPK通路的激活可以調節(jié)TGF-β1的轉錄與合成，從而可以引起細胞外基質積聚加重腎小球硬化和腎間質纖維化，另一方面TGF-β1也是該通路的上游因子,可以通過增強P38MAPK的活性而發(fā)揮其生物活性[11]；P38MAPK一旦被激活，可以活化CREB等轉錄因子[12]，從而調節(jié)目的基因的表達，導致細胞外基質FN產生增多，最終導致DN。

中醫(yī)認為DN多屬于“消渴”“水腫”“尿濁”“關格”等范疇，根據(jù)不同的病因病機采取相對應的辨證施治，DN多由糖尿病發(fā)展而來，因而高彥彬教授將糖尿病腎病命名為“消渴病腎病”[13]，認為DN的基本病機為本虛標實。發(fā)病初，肝腎氣陰兩虛，腎絡瘀滯，發(fā)病中陰損及陽，脾腎虛衰，腎絡瘀阻，發(fā)病晚期，腎絡瘀結，因此將絡病理論應用于DN的中醫(yī)藥防治當中，并創(chuàng)立中藥復方糖腎寧制劑，方中黃芪益氣扶正；金櫻子固精縮尿；大黃逐瘀清熱降濁；川芎活血化瘀通絡[14]。前期臨床研究證實糖腎寧對于前期及臨床期腎病治療總有效率為90.0%，在減少蛋白尿、改善腎功能方面具有重要作用[15]。糖腎寧臨床隨機雙盲對照前瞻性研究證實該藥可明顯降低DN患者尿白蛋白、保護腎功能，且實驗中未出現(xiàn)任何不良反應及毒副作用，總有效率為88.9%，明顯優(yōu)于洛汀新對照組[16]。

本實驗結果顯示高糖環(huán)境能明顯促進小鼠腎小球系膜細胞中TGF-β1和P-P38MAPK蛋白表達增加、P38MAPK信號下游轉錄因子CREB活性增強、細胞上清液中FN的表達水平顯著增加；糖腎寧能顯著降低系膜細胞中TGF-β1和P-P38MAPK蛋白表達的水平，以及減弱P38MAPK信號下游轉錄因子CREB活性，細胞上清液中FN的表達水平顯著降低，尤以高劑量組顯著。推測糖腎寧抑制細胞外基質增生的作用機制可能與下調TGF-β1的表達水平，抑制P38MAPK信號通路的激活，從而抑制FN等細胞外基質的合成有關，其詳細機制有待進一步深入研究。

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(本文編輯： 王馨瑤)

Effects ofTangshenningon TGF-β1 and P38MAPK signal pathway in mouse mesangial cells with high glucose condition

PengQizhen，GengJianguo，ZouDawei，etal.

SchoolofTraditionalChineseMedicine,CapitalMedicalUniversity,BeijingKeyLaboratoryofTCMCollateralDiseaseTheoryResearch,Beijing100069,China

Correspondingauthor:GengJianguo，E-mail:gengdoctor@163.com

Objective To observe the influence ofTangshenningon the expression of TGF- beta 1 and P38MAPK in murine mesangial cells cultured with high glucose. Methods Murine mesangial cells was used as the research subjects and divided into six groups: normal control group, high glucose group, high glucose administered with valsartan group, high glucose administered with high dosage ofTangshenning, high glucose administered with medium dosage ofTangshenningand high glucose administered with low dosage ofTangshenninggroup. All research subjects were administered with respective medicine according to their groups for 24 hours, then high glucose stimulated cell changes were observed, the protein level of the culture supernatant was measured by ELISA. The protein level of P38MAPK, CREB and TGF-β1 were detected by western blot. Results Compared with the normal control group, the proliferation rate of murine mesangial cells cultured in high glucose group is significantly higher (P<0.05), the expression of FN protein in the supernatant is significantly increased (P<0.05). Compared with the high glucose group, the proliferation of murine mesangial cells from all the threeTangshenninggroups were significantly depressed(P<0.05), the level of P38MAPK and its downstream transcription factor CREB were significantly decreased (P<0.05) and the expressions of TGF-β1 and FN were significantly down regulated(P<0.05). There were no significant differences in the indexes of between valsartan group and the threeTangshenninggroups. ConclusionTangshenningcould down regulate the expression of TGF-β1 and FN protein by inhibiting the P38MAPK signaling pathway, thereby inhibiting FN protein and protecting renal function.

Tangshenning； Diabetic nephropathy； Transforming growth factor-β1； Fibronectin

國家自然科學基金青年科學基金(81302951)；國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)(2012CB518602)

100069 北京，首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院中醫(yī)臨床基礎學系[彭麒朕(碩士研究生)、耿建國、鄒大威、高彥彬、龔慕辛、吳曉明(博士研究生)、尚雅文(碩士研究生)]

彭麒朕(1989- )，2014級在讀碩士研究生。研究方向：中醫(yī)藥防治糖尿病。E-mail：pqzhdwj@163.com

耿建國(1956- )，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師。研究方向：中醫(yī)藥防治糖尿病。E-mail：gengdoctor@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.03.003

2016-08-07)