陳偉 劉海生 魏萌 王麗紅 師艷艷

熊果酸對(duì)荷骨肉瘤大鼠免疫功能的影響

陳偉 劉海生 魏萌 王麗紅 師艷艷

目的 研究熊果酸對(duì)荷骨肉瘤大鼠免疫功能的影響及其機(jī)制。方法 通過(guò)于Wistar大鼠股骨遠(yuǎn)端骨髓腔中注射接種骨肉瘤UMR106細(xì)胞的方法建立荷骨肉瘤大鼠模型并腹腔注射給予不同劑量的熊果酸100、50、25 mg/(kg·d)和順鉑2.5 mg/(kg·d)進(jìn)行干預(yù)治療，療程5天。觀察大鼠生存狀態(tài)和腫瘤生長(zhǎng)狀況；稱量瘤體質(zhì)量并計(jì)算抑瘤率，HE染色法觀察腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，MTT法測(cè)定脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率；ELISA法測(cè)定血清中白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)含量；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血液中T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+百分率并計(jì)算CD4+/CD8+比值。結(jié)果 經(jīng)熊果酸干預(yù)治療5天荷骨肉瘤大鼠飲食狀況好轉(zhuǎn)，瘤體縮小、瘤體質(zhì)量減輕且硬度較差，呈現(xiàn)腫瘤細(xì)胞皺縮、組織片狀壞死等變化；抑瘤率顯著升高，脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著升高，血清中IL-2、TNF-α含量顯著降低，血液中CD4+顯著升高、CD8+百分率顯著降低，CD4+/CD8+比值顯著升高，且均具有一定的劑量依賴性。結(jié)論 熊果酸具有提高荷骨肉瘤大鼠免疫功能的作用，其機(jī)制可能與熊果酸能夠有效提高脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，降低IL-2、TNF-α含量以及提高CD4+百分率、降低CD8+百分率而提高CD4+/CD8+比值有關(guān)。

熊果酸； 骨肉瘤； 免疫功能； 機(jī)制

骨肉瘤發(fā)病率居原發(fā)惡性骨腫瘤之首[1-2]，每年新發(fā)患者約5/100萬(wàn)[3]，多發(fā)于青少年且死亡率高，是臨床上亟待解決的一個(gè)難題。近年來(lái)，病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤疾病患者多處于免疫系統(tǒng)抑制、免疫活性細(xì)胞功能低下?tīng)顟B(tài)，從而使腫瘤細(xì)胞易于生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[4-5]，因此以改善患者免疫功能為切入點(diǎn)或許是研發(fā)高效、低毒新型抗腫瘤藥物的新思路。熊果酸(ursolic Acid，UA)是一種具有抗氧化、抗炎、抗纖維化等多種生物學(xué)活性的五環(huán)三萜類化合物[6-10]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)熊果酸對(duì)肺癌、肝癌、舌癌等生長(zhǎng)均具有一定的抑制作用[11-13]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)股骨遠(yuǎn)端骨髓腔注射接種骨肉瘤UMR106細(xì)胞的方法建立荷骨肉瘤大鼠模型，研究熊果酸對(duì)荷骨肉瘤大鼠免疫功能的影響并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞

清潔級(jí)Wistar大鼠(雄性，7周齡，體質(zhì)量220～240 g)購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(冀)2013-1-003；大鼠骨肉瘤UMR106細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海生化與細(xì)胞生物學(xué)研究。

1.2 藥物與試劑

熊果酸(陜西慧科植物開(kāi)發(fā)有限公司，純度≥98%)；順鉑(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：30 mg，6 mL)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(美國(guó)HyClone公司)；MTT、DMSO(美國(guó)Sigma公司)；白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；HE試劑盒(北京博奧森生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 模型的制備與分組 取實(shí)驗(yàn)用骨肉瘤UMR106細(xì)胞，經(jīng)解凍復(fù)蘇后，植入DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/mL，無(wú)菌條件下注射接種(0.2 mL)于實(shí)驗(yàn)用Wistar大鼠股骨遠(yuǎn)端骨髓腔中以制備荷骨肉瘤大鼠模型，2周后接種部位出現(xiàn)包塊、直徑≥5 mm即可認(rèn)定造模成功[14-15]。取100只模型大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、熊果酸高、中、低[100、50、25 mg/(kg·d)]和順鉑2.5 mg/(kg·d)組，各20只；并另取20只同齡清潔級(jí)雄性Wistar大鼠設(shè)為正常對(duì)照組。藥物的配制：準(zhǔn)確稱量熊果酸并用含5 mg/mL羧甲基纖維素鈉的PBS溶液(pH 7.4)溶解并依此稀釋分別配制成含熊果酸50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL的混懸液[16]；并用含5 mg/mL羧甲基纖維素鈉的PBS溶液(pH 7.4)溶解配制成含順鉑1.25 mg/mL的混懸液。熊果酸各治療組和順鉑組均腹腔注射給藥(2 mL/kg)進(jìn)行治療，模型組和正常對(duì)照組同步給予等體積(2 mL/kg)含5 mg/mL羧甲基纖維素鈉的PBS溶液，1次/天，療程5天。

1.3.2 測(cè)定瘤體質(zhì)量、計(jì)算抑瘤率、觀察腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變 麻醉后取腫瘤組織并稱量，抑瘤率計(jì)算公式：抑瘤率(%)=(模型組瘤體質(zhì)量-治療組瘤體質(zhì)量)/模型組瘤體質(zhì)量×100%；取稱量后腫瘤組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片后，行常規(guī)脫蠟水化處理，參照HE試劑盒方法步驟行常規(guī)HE染色和復(fù)染，然后通過(guò)顯微鏡觀察腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。

1.3.3 測(cè)定脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率 參照李曉冰等[17]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率：取脾臟組織行研磨勻漿后制備單細(xì)胞懸液，加入10 mL NH4Cl(10%)經(jīng)37℃水浴10分鐘，轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板后每孔滴加100 μL PHA液(植物血球凝集素，實(shí)驗(yàn)孔)，設(shè)對(duì)照孔并滴加100 μL培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí)后滴加20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，培養(yǎng)4小時(shí)后去上清，加入DMSO 200 μL，反應(yīng)10分鐘后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處吸光度(OD)值，以刺激指數(shù)(SI)反映脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(SI)：SI=PHA刺激孔OD/對(duì)照孔OD。

1.3.4 測(cè)定血清中IL-2、TNF-α水平 經(jīng)腹主動(dòng)脈取血并離心(1500 rpm，10分鐘)取血清，參照試劑盒說(shuō)明通過(guò)酶標(biāo)儀采用比色法測(cè)定血清中IL-2、TNF-α水平。

1.3.5 測(cè)定血液中CD4+、CD8+百分率并計(jì)算CD4+/CD8+比值 經(jīng)腹主動(dòng)脈取血并離心(10000 rpm，5分鐘)后棄上清，參照關(guān)碩等[18]報(bào)道的方法，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)CD4+、CD8+百分率并計(jì)算CD4+/CD8+比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用軟件SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料組間均數(shù)比較采用one-way ANOVA分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熊果酸對(duì)荷骨肉瘤大鼠腫瘤組織病變的影響

腫瘤組織切片經(jīng)HE染色后通過(guò)顯微鏡觀察，結(jié)果如圖1所示：模型組荷骨肉瘤大鼠腫瘤組織細(xì)胞胞質(zhì)飽滿、胞核呈兩個(gè)或多個(gè)、核仁深染，未見(jiàn)異常；熊果酸各劑量組和順鉑組腫瘤組織細(xì)胞呈現(xiàn)皺縮、數(shù)量減少、核染色質(zhì)邊集以及片狀壞死區(qū)等病理性改變，熊果酸誘導(dǎo)腫瘤組織病變的作用呈一定劑量依賴性。

2.3 熊果酸對(duì)荷骨肉瘤大鼠瘤體重量及抑瘤率的影響

熊果酸能夠有效減輕荷骨肉瘤大鼠瘤重并提高抑瘤率，并呈一定劑量依賴性；熊果酸高劑量組瘤體質(zhì)量和抑瘤率與順鉑組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果如表1所示。

2.4 熊果酸對(duì)荷骨肉瘤大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響

結(jié)果如表2所示：與正常對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)，模型組荷骨肉瘤大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著升高；熊果酸治療5天能夠有效降低荷骨肉瘤大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，并呈一定劑量依賴性；熊果酸高劑量組脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著低于順鉑組。

表1 熊果酸對(duì)荷骨肉瘤大鼠瘤體質(zhì)量及抑瘤率的影響±s)

注： 與模型組比較,aP<0.05，bP<0.01。

表2 熊果酸對(duì)荷骨肉瘤大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響±s)

注： 與正常對(duì)照組比較,aP<0.05,與模型組比較,bP<0.05，與順鉑組比較,cP<0.05。

注：A模型組；B順鉑組；C熊果酸高劑量組；D熊果酸中劑量組；E熊果酸低劑量組

圖1 熊果酸對(duì)荷骨肉瘤大鼠腫瘤組織病變的影響(HE×400)

2.5 熊果酸對(duì)荷骨肉瘤大鼠血清中IL-2、TNF-α含量的影響

結(jié)果如表3所示：與正常對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)，模型組荷骨肉瘤大鼠血清中IL-2、TNF-α含量均顯著升高；經(jīng)熊果酸或順鉑治療5天能夠有效降低荷骨肉瘤大鼠血清中IL-2、TNF-α含量，且呈一定劑量依賴性；熊果酸高劑量組IL-2含量較順鉑組顯著降低，而TNF-α含量?jī)山M間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表3 熊果酸對(duì)荷骨肉瘤大鼠血清中炎癥因子水平的影響±s)

注： 與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05,與順鉑組比較，cP<0.05。

2.6 熊果酸對(duì)荷骨肉瘤大鼠血液中CD4+、CD8+百分率及CD4+/CD8+比值的影響

結(jié)果如圖2和表4所示：與正常對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)，模型組荷骨肉瘤大鼠血液中CD4+百分率顯著降低、CD8+百分率顯著升高，而CD4+/CD8+比值顯著降低；經(jīng)熊果酸或順鉑治療5天能夠有效提高荷骨肉瘤大鼠血液中CD4+百分率，降低血液中CD8+百分率，提高血液中CD4+/CD8+比值；熊果酸高劑量組CD4+、CD8+百分率、CD4+/CD8+比值與順鉑組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

目前臨床上對(duì)于骨肉瘤的治療主要采取手術(shù)輔以放化療的方案，但80%的患者因確診時(shí)體內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶而致使手術(shù)治療效果不佳[19]，5年生存率僅30%左右。因此，以提高荷骨肉瘤患者免疫功能、抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移為切入點(diǎn)研究高效、低毒的新型抗腫瘤藥物是臨床上亟待解決的問(wèn)題。

注：A正常對(duì)照組；B模型組；C順鉑組；D熊果酸高劑量組； E熊果酸中劑量組；F熊果酸低劑量組

圖2 熊果酸對(duì)荷骨肉瘤大鼠血液中CD4+、CD8+百分率

脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化百分率是反映機(jī)體細(xì)胞免疫的基本指標(biāo)[20]，也是研究藥物對(duì)T淋巴細(xì)胞影響的常用方法。IL-2是體內(nèi)非常重要的免疫調(diào)節(jié)因子，其在惡性腫瘤的免疫應(yīng)答中起著非常關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[21]，Wang Z等[22]研究發(fā)現(xiàn)IL-2具有促腫瘤免疫耐受的生物學(xué)作用，該作用與IL-2的濃度及作用時(shí)間等因素密切相關(guān)。Anquetil F等[23]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)機(jī)體荷腫瘤時(shí)體內(nèi)TNF-α合成及分泌增加，過(guò)量的TNF-α不但能夠抑制IgG和lgM產(chǎn)生，也能導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞不能對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生正常的免疫反應(yīng)。T淋巴細(xì)胞CD4+分子和CD8+分子共同介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)[24-25]，CD4+/CD8+比值在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，其比值變化能夠準(zhǔn)確反映出機(jī)體免疫狀態(tài)。

表4 熊果酸對(duì)荷骨肉瘤大鼠血液中CD4+、CD8+百分率及CD4+/CD8+比值的影響

注： 與正常對(duì)照組比較,aP<0.05,與模型組比較,bP<0.05。

熊果酸是一種具有多種生物學(xué)活性的五環(huán)三萜類化合物[1-5]，近年來(lái)熊果酸抗腫瘤活性逐漸得到醫(yī)藥研究工作者的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立荷骨肉瘤大鼠模型并給予熊果酸進(jìn)行干預(yù)治療，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)熊果酸治療能夠改善荷骨肉瘤大鼠一般生存狀態(tài)，呈劑量依賴性地誘導(dǎo)細(xì)胞壞死、降低瘤體質(zhì)量、提高抑瘤率；與模型組比較，發(fā)現(xiàn)經(jīng)熊果酸治療能夠有效提高荷骨肉瘤大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，降低血清中炎癥細(xì)胞因子IL-2和TNF-α水平，提高血液中CD4+百分率、降低CD8+百分率，提高CD4+/CD8+比值，其中熊果酸100 mg/(kg·d)組脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著高于順鉑組(P<0.05)、IL-2含量水平顯著低于順鉑組(P<0.05)，提示熊果酸能夠改善荷骨肉瘤大鼠免疫功能，而表現(xiàn)出對(duì)移植瘤組織生長(zhǎng)的抑制作用。

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(本文編輯： 董歷華)

Effects of ursolic acid on immune function of osteosarcoma rats

CHENWei，LIUHaisheng，WEIMeng，etal.

HandanCentralHospital，Handan056001，China

Correspondingauthor：CHENWei，E-mail：hdsyyzhrf@163.com

Objective To investigate the effects and mechanism of ursolic acid(UA) on immune function of osteosarcoma cancer rats. Methods The osteosarcoma cancer rat models were conducted by injecting osteosarcoma cancer cell line UMR106 and were treated with UA 100，50，25 mg/(kg·d) and Cisplatin 2.5 mg/(kg·d) by intraperitoneal injection for 5 d. The rats’ general states and tumor growth conditions were observed，the histopathological changes of tumor tissue were observed by HE staining; he tumor weight was detected and inhibition rate was calculated, the spleen lymphocyte transformation rate was detected by MTT, the content of IL-2 and TNF-α in serum were detected, the percentage of CD4+, CD8+in blood were detected and the ratio of CD4+/CD8+was calculated. Results The diet situation of the rats in UA treated groups were improved, tumor were reduced and hardness were less，tumor cell showed shrinkage, tissue necrosis, etc; the tumor inhibition rate were increased; the spleen lymphocyte transformation rate were significantly increased; the content of IL-2 and TNF-α in serum were significantly decreased; the CD4+percentage in blood were significantly increased, the CD8+percentage was significantly decreased, the ratio of CD4+/CD8+in UA treated groups were significantly increased. The effect of the above mentioned effects of UA has a certain dose dependence. Conclusion UA can effectively improve the immune function of osteosarcoma cancer rat; which perhaps related to its effects of increasing the spleen lymphocyte transformation rate, reducing the content of IL-2 and TNF-α, increasing CD4+percentages，decreasing CD8+percentages and raising the ratio of CD4+/CD8+.

Ursolic Acid； Osteosarcoma cancer； Immune function； Mechanism

056001 邯鄲市中心醫(yī)院骨三科(陳偉、魏萌、王麗紅、師艷艷)；邯鄲市人民醫(yī)院外一科(劉海生)

陳偉(1976- )，碩士，主治醫(yī)師。研究方向：骨科疾病。E-mail：hdsyyzhrf@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.03.006

2016-10-22)