師新川/華威特（江蘇）生物制藥有限公司

影響豬瘟疫苗質(zhì)量的幾個(gè)關(guān)鍵因素分析

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豬瘟是由豬瘟病毒引起豬的以高熱和出血為特征的，高度接觸性、致死性傳染病，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)。我國自1956年開始使用豬瘟兔化弱毒疫苗以來，豬瘟疫情逐步得到了控制。雖然我國馴化的豬瘟兔化弱毒疫苗毒株（C株）是目前世界上最優(yōu)秀的豬瘟疫苗毒株且在我國廣泛使用多年，但豬瘟在我國仍時(shí)有發(fā)生。其可能原因之一是豬瘟疫苗質(zhì)量跟不上當(dāng)前防疫的完全需求。筆者根據(jù)自己從事動物疫苗研發(fā)、生產(chǎn)和技術(shù)服務(wù)的工作體會，結(jié)合相關(guān)研究文獻(xiàn)，談?wù)動绊懾i瘟疫苗質(zhì)量的幾個(gè)關(guān)鍵因素。

一、病毒培養(yǎng)的方式

根據(jù)豬瘟制苗用病毒培養(yǎng)的方式，大體把豬瘟疫苗分為豬瘟脾淋組織苗、豬瘟原代細(xì)胞苗和豬瘟傳代細(xì)胞苗，其各自特點(diǎn)分別為。

（一）豬瘟脾淋組織苗

豬瘟脾淋組織苗系用豬瘟兔化弱毒株接種健康乳兔或成年家兔，收獲感染定型熱兔子的脾臟及淋巴結(jié)，在其組織勻漿中加入適宜穩(wěn)定劑，冷凍真空干燥而成。組織苗每頭份病毒抗原含量不低于150個(gè)兔體感染量（RID），其中所含的多種淋巴因子能迅速增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫，但其異源性又可能造成豬的過敏反應(yīng)。此外，在生產(chǎn)制備脾淋組織苗時(shí)難以杜絕由動物臟器帶入的外源微生物污染，增大了使用時(shí)應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生的頻率。國內(nèi)曾有報(bào)道，30日齡以內(nèi)仔豬首免時(shí)接種脾淋苗，發(fā)生過大量過敏現(xiàn)象。接種日齡越小，反應(yīng)愈強(qiáng)烈，嚴(yán)重的引起仔豬死亡。過敏反應(yīng)還可能引起妊娠母豬發(fā)熱，流產(chǎn)等反應(yīng)。故乳豬的超前免疫及妊娠母豬的免疫應(yīng)慎用此類制品。

（二）豬瘟原代細(xì)胞苗

豬瘟原代細(xì)胞苗是把豬瘟兔化弱毒接種于犢牛睪丸原代細(xì)胞培養(yǎng)，在其培養(yǎng)物加入適宜穩(wěn)定劑后冷凍真空干燥制成。豬瘟原代細(xì)胞苗相對于脾淋組織苗抗原含量較高，免疫原性良好，每頭份病毒含量不低于750RID。豬瘟原代細(xì)胞苗在抗原培養(yǎng)過程中，其培養(yǎng)液、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間及其他環(huán)境條件可控，是有利生產(chǎn)穩(wěn)定疫苗毒的一面。不利于質(zhì)量控制的是，它使用的原代牛睪丸細(xì)胞容易把牛源病原體帶入豬瘟抗原中，例如導(dǎo)致牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）污染。BVDV可感染豬而引起疑似豬瘟病癥，并嚴(yán)重干擾豬瘟疫苗的免疫效果。此外，制苗所用的牛睪丸原代細(xì)胞一般采自3月齡左右犢公牛，動物個(gè)體差異大進(jìn)而導(dǎo)致疫苗的批間差異大，對疫苗生產(chǎn)和效力發(fā)揮帶來潛在的困難。此類疫苗中一般存在一定量的血清和少量的細(xì)胞碎片，不能完全避免使用時(shí)的應(yīng)激反應(yīng)。

（三）豬瘟傳代細(xì)胞苗

與原代細(xì)胞苗不同，豬瘟傳代細(xì)胞苗，用傳代豬睪丸細(xì)胞或牛睪丸細(xì)胞制備疫苗抗原?？蛇M(jìn)一步避免外源微生物的污染，生產(chǎn)工藝非常穩(wěn)定，質(zhì)量易控，批間差異極小，病毒產(chǎn)量高，可達(dá)原代細(xì)胞苗的20倍以上。傳代細(xì)胞苗的抗原在培養(yǎng)后期，可大幅度降低血清使用量，進(jìn)一步減少因異源蛋白引起的過敏反應(yīng)。所以豬瘟傳代細(xì)胞疫苗安全性好，免疫效力高，在緊急免疫時(shí)更能展現(xiàn)其優(yōu)勢。

二、制備疫苗的原輔料對豬瘟疫苗質(zhì)量的影響

這里的原輔料主要是指對疫苗抗原產(chǎn)量、純度及穩(wěn)定性有影響的材料。能明顯影響豬瘟疫苗質(zhì)量的原輔材料基本上都與BVDV有關(guān)。BVDV與豬瘟病毒的生物學(xué)特性相近，可感染包括豬在內(nèi)的多種動物。材料中若含有BVDV的抗體，則會抑制疫苗抗原的生長，產(chǎn)品中的抗原含量就達(dá)不到要求，進(jìn)而達(dá)不到防疫效果。如果材料被BVDV污染，疫苗接種后有使豬感染BVDV的風(fēng)險(xiǎn)。豬瘟細(xì)胞苗在生產(chǎn)過程中要用牛血清、胰酶、牛睪丸等材料，需要對這些材料做BVDV抗原和抗體的嚴(yán)格檢驗(yàn)。

（一）原輔料對豬瘟疫苗質(zhì)量的影響

BVDV與豬瘟病毒有一定的共同抗原，所以BVDV抗體對豬瘟病毒有一定的中和作用，嚴(yán)重干擾豬瘟病毒侵入宿主細(xì)胞增殖和擴(kuò)繁的能力。筆者曾對市場上3個(gè)廠家9個(gè)批次的牛血清進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果只有1個(gè)批次的血清BVDV抗體為陰性，其余血清的中和抗體效價(jià)在1∶16～1∶128之間。分別用于細(xì)胞培養(yǎng)豬瘟兔化弱毒72 h免疫熒光檢測病毒含量最高為102．5FAID50/ ml，而使用BVDV抗體陰性牛血清所產(chǎn)病毒含量為107．6FAID50/ml，兩者相差10萬倍。顯而易見，在臨床感染BVDV豬所產(chǎn)生的中和抗體可以干擾豬瘟疫苗的效力。

在豬瘟細(xì)胞苗的生產(chǎn)過程中，由牛源原代睪丸細(xì)胞或牛血清引入的BVDV可導(dǎo)致臨床疾病。在荷蘭報(bào)道使用受BVDV污染的疫苗而引起仔豬牛病毒性腹瀉病毒的感染，感染仔豬出現(xiàn)與豬瘟類似的癥狀與病變。此外，法國一豬場由于注射了用次代羔羊腎細(xì)胞生產(chǎn)的偽狂犬病弱毒疫苗而引起母豬產(chǎn)仔數(shù)下降和產(chǎn)畸形仔豬，后來證實(shí)此疫苗有BVDV污染。目前我國豬瘟細(xì)胞苗的生產(chǎn)廠家眾多，原輔材料的純凈度難以控制，接種豬瘟疫苗時(shí)的生物安全風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。

（二）血清質(zhì)量管理

血清作為疫苗生產(chǎn)的重要原輔料，從服從終產(chǎn)品質(zhì)量的角度，獸用生物制品企業(yè)把無外源微生物污染和促細(xì)胞生長活性作為衡量血清質(zhì)量的兩個(gè)重要指標(biāo)。

除了BVDV外，支原體也是血清常見的污染原，受其污染的疫苗制品極易誘發(fā)豬的應(yīng)激反應(yīng)。支原體污染具有很強(qiáng)的隱蔽性，用肉眼難以觀察，所以需要有嚴(yán)格的支原體檢測手段。按照現(xiàn)有獸藥檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，必須在無血清的支原體培養(yǎng)基檢驗(yàn)支原體，單次檢驗(yàn)周期長達(dá)4周?？紤]到人員和環(huán)境等因素，為保證無支原體污染，優(yōu)秀的生物制品企業(yè)一般會增加額外的快速檢驗(yàn)手段，如PCR法。

血清作為細(xì)胞生長的主要營養(yǎng)物質(zhì)，對細(xì)胞的生長狀態(tài)和生長速度起到?jīng)Q定性的作用，而細(xì)胞狀態(tài)又直接決定了病毒生長的數(shù)量和質(zhì)量。如何確定血清的促生長活性，目前尚無嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，不同企業(yè)的內(nèi)控方法有所差異。一般根據(jù)加入特定量血清后，細(xì)胞的生長狀態(tài)、生產(chǎn)病毒的滴度、收獲期的長短綜合評價(jià)，需要有較多的經(jīng)驗(yàn)。

三、耐熱凍干保護(hù)技術(shù)

豬瘟兔化弱毒活疫苗對高溫敏感，所以運(yùn)輸、保存條件對豬瘟疫苗的質(zhì)量影響很大。活疫苗從出廠到使用，中間的運(yùn)輸和保存都需要在冷藏條件下進(jìn)行?！袄滏湣敝械娜魏我粋€(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，疫苗效價(jià)就會降低甚至失效。

我國現(xiàn)在商品化的豬瘟疫苗多采用比較簡單的保護(hù)劑，其主要成份為蔗糖、脫脂牛奶和明膠。這類制品對溫度仍比較敏感，需在-15℃保存。在保存和使用期間，如果遇到溫度較大變化或者多次變化，疫苗的質(zhì)量就會下降。因而在生產(chǎn)實(shí)踐中，許多技術(shù)人員發(fā)現(xiàn)，疫苗的批間免疫效力差異比較大，防疫效果難以控制。這一問題運(yùn)輸不便的地區(qū)以及小型養(yǎng)豬場，更為常見。隨著我國對動物疫苗品質(zhì)的要求越來越高，各疫苗研發(fā)和生產(chǎn)企業(yè)不斷進(jìn)行工藝探索，這一問題正在得到改善。我們的研究表明，理想的耐熱凍干保護(hù)劑能滿足豬瘟疫苗在2℃～8℃條件下，保存超過24個(gè)月。隨著這一技術(shù)的使用，疫苗變得很穩(wěn)定、批間差異很小，并使仔豬一次接種獲得免疫成為可能，大大提高了疫苗的免疫成功率和免疫保護(hù)率。耐熱凍干保護(hù)水平目前是評判豬瘟疫苗品質(zhì)高低的關(guān)鍵指標(biāo)之一。

四、豬瘟疫苗的效力評判標(biāo)準(zhǔn)

“疫苗出了錯，都是標(biāo)準(zhǔn)惹的禍”一句簡單的話語，道出了標(biāo)準(zhǔn)對于疫苗的重要性。豬瘟病毒由于自身在生產(chǎn)和檢驗(yàn)細(xì)胞上不出現(xiàn)細(xì)胞病變，所以在病毒含量測定時(shí)，不能通過觀察細(xì)胞病變來讀取結(jié)果。目前豬瘟病毒的效力檢驗(yàn)有三種方法，分別是豬免疫攻毒、兔體感染定型熱、免疫熒光定量（FAID50），這三種方法分別都有各自的評判標(biāo)準(zhǔn)及優(yōu)缺點(diǎn)。

（一）免疫攻毒法

免疫攻毒法是豬瘟效力檢驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)，既對豬瘟抗體陰性健康仔豬，免疫豬瘟疫苗10～14日后連同對照一塊使用高致病性豬瘟（石門系血毒）進(jìn)行攻擊保護(hù)實(shí)驗(yàn)。攻毒后免疫組保護(hù)，對照組發(fā)病，則判定該批次疫苗合格。其優(yōu)點(diǎn)是有效、直接，但生物安全風(fēng)險(xiǎn)大、強(qiáng)毒獲取困難、需要負(fù)壓動物房、成本高，因而并未被廣泛采用。

（二）兔體定型熱檢測法

兔體定型熱檢測法，顧名思義既是將豬瘟疫苗注射到兔子體內(nèi)，通過兔體的體溫反應(yīng)來判定疫苗是否合格。其優(yōu)點(diǎn)是不動用強(qiáng)毒無生物安全風(fēng)險(xiǎn)，兔子屬小動物便于實(shí)驗(yàn)操作，成本低。

但兔子的品種、產(chǎn)地、體重、健康狀況等對結(jié)果的影響較大，因不可控因素太多，常出現(xiàn)結(jié)果無法判定的情況。它不能直接反映疫苗的病毒含量，當(dāng)然也不能對豬瘟疫苗病毒含量進(jìn)行準(zhǔn)確、穩(wěn)定的評判。

（三）免疫熒光定量法

免疫熒光定量法通過單特異的豬瘟病毒單克隆抗體，將無細(xì)胞病變的豬瘟病毒進(jìn)行熒光染色，然后在熒光顯微鏡下直接判定。疫苗病毒感染細(xì)胞漿內(nèi)將顯示特異的熒光信號，這是在細(xì)胞水平對病毒進(jìn)行定量，是國際標(biāo)準(zhǔn)豬瘟病毒含量測定方法。因該方法完全在實(shí)驗(yàn)室條件下操作，不受地域、環(huán)境等條件的制約，所以穩(wěn)定性好，同時(shí)該方法還具有直接、準(zhǔn)確的檢測豬瘟疫苗病毒含量的優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為最精準(zhǔn)的豬瘟病毒定量方法。過去由于缺少可用于標(biāo)準(zhǔn)化檢驗(yàn)的豬瘟單克隆抗體，這一質(zhì)量分析法在我國沒有應(yīng)用。經(jīng)過數(shù)年的研究，華威特生物制藥有限公司的研究人員解決了這一技術(shù)中的難題，豬瘟免疫熒光定量方法在農(nóng)業(yè)部2270號公告中確認(rèn)為豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。這一技術(shù)的使用，將讓豬瘟疫苗的制備更精確化、標(biāo)準(zhǔn)化、可控化，減少產(chǎn)品批間差，降低因疫苗批次的不穩(wěn)定而帶來的免疫風(fēng)險(xiǎn)。

五、小結(jié)

豬瘟疫苗病毒抗原的培養(yǎng)方式、原輔料品質(zhì)、耐熱凍干保護(hù)技術(shù)是影響豬瘟疫苗質(zhì)量的重要因素。傳代細(xì)胞培養(yǎng)疫苗，抗原純凈，抗原含量充分，可最大限度減少外源病毒污染，不論是安全性還是免疫效力，均能滿足當(dāng)前豬瘟防疫的需要。免疫熒光定量及高效耐熱保護(hù)技術(shù)的應(yīng)用，將使豬瘟疫苗的品質(zhì)得到全面提升，有重大的社會和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

高質(zhì)量的豬瘟疫苗只是豬瘟有效防控的前提條件，合理的免疫程序及對豬場豬瘟狀況的準(zhǔn)確判斷，同樣是豬瘟有效防控的重要條件。豬瘟防控是系統(tǒng)防疫的一部分，藍(lán)耳病、圓環(huán)、偽狂犬等疾病，同樣是導(dǎo)致豬瘟免疫失敗的重要因素，我們必須遵循各自的根本原則，根據(jù)不同豬場的實(shí)際情況，制定周密合理的免疫方案及相應(yīng)的周期性檢測計(jì)劃，讓豬瘟防疫給豬場帶來更好的效益。