付岳 高旭年 黃杰

體外診斷試劑質量評價與標準物質溯源

付岳1高旭年2黃杰3★

體外診斷試劑標準物質是實現量值溯源、保證檢測數據和結果準確一致的重要材料。自上世紀80年代以來，國內實驗室在體外診斷試劑標準物質的研制方面做了大量的工作。本文簡要介紹了目前國內研制的體外診斷標準物質及其研制中所采用的主要形式：以參考方法、參考系統和標準物質為基礎的計量學溯源體系；以多中心合作標定、一致化或類似一致化的溯源體系，并針對兩種溯源體系的差別進行了闡述。

體外診斷試劑； 標準物質； 量值溯源

近年來，我國體外診斷試劑（in vitro diagnos?tics，IVD）市場規(guī)模增長迅速。針對紛雜的產品市場，為保證疾病的有效預防、診斷和治療監(jiān)測，相應IVD產品的質量評價和監(jiān)管也日趨重要。而體外診斷試劑檢驗結果的準確性、不同廠家同類產品檢驗結果的一致性是IVD產品質量的重要議題。IVD產品的質量評價一般還需要考慮與產品性能密切相關的準確度、特異性、重復性、檢測限等指標。

實現檢驗結果準確性和可比性的重要手段是保證檢驗檢測的標準化和一致化，標準化的基礎是建立參考系統，包括參考方法、標準物質和參考實驗室等；一致化的基礎是在充分評估技術的原理、影響因素，分析不同技術檢測同一靶標的差異，達成檢測結果可比的共識。標準化和一致化主要差別體現在量值溯源的方式。標準化的量值溯源方式是追求量值溯源至國際單位、參考方法、標準物質等，一致化的溯源方式則是溯源至經過認可的方法、參考物質。在完整的溯源、量值傳遞和校正過程中，體外診斷試劑標準物質是實現檢驗數據和結果準確一致的主要工具，也是保證量值有效傳遞的計量實物標準［1］。同樣，在檢測結果一致化過程中，經過認可的方法和/或參考物質也發(fā)揮了重要的傳導作用。通過標準物質建立IVD產品的標準化和一致化，可實現臨床檢驗結果的準確、可比和可溯源。

目前國際上研制標準物質的組織主要有英國國家生物制品檢定所（National Institute for Biologi?cal Standards and Control，NIBSC），美國國家標準和技術研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST），位于比利時的標準物質和計量研究所（Institute of Reference Materials and Me?trology，IRMM）等。這些組織研制了大量的涉及無機成分、有機小分子、蛋白、抗體、激素、核酸等作為溯源的國際通用標準物質［2］。我國標準物質的研制工作起步稍晚，自上世紀80年代也開始研制臨床檢驗標準物質，前期研制的標準物質以無機成分、微量元素為主，后期開始研制有機分子的標準物質，2005年前后開始研制核酸、蛋白等生物大分子的標準物質［3］。已有多家參考實驗室通過了中國實驗室合格評定委員會的認可，建立的參考方法涵蓋了酶學、小分子化合物、血脂、代謝物、離子以及甾體類激素等［4］。并且為保證標準物質量值溯源體系的建設及標準物質的質量，相關實驗室正在積極申請標準物質生產者能力認可。目前基本相應的建立了包含生物化學檢測，免疫學檢測，核酸檢測，血液體液檢測等幾大類參考物質，這些參考物質為我國體外診斷試劑的量值溯源和檢測結果一致化做出了重要貢獻。但是針對標準物質的研制和溯源體系在不同的機構有部分理解的不一致和差別，主要體現在標準物質的實際用途和組成形式上。有些機構認為標準物質的主要用途是為測量程序或校準品賦值，也有機構認為標準物質的作用還應該包含對產品的質量評價，不同的用途造成了標準物質組成形式的差別，也對標準物質的溯源體系造成了不一樣的理解。本文擬就目前我國體外診斷試劑標準物質及其研制中所采用的主要形式進行簡要介紹，并針對兩種溯源體系的差別進行了闡述。

1 以參考方法或決定性方法和標準物質為主要溯源體系的標準物質

在計量學溯源途徑中，生物化學檢測標準物質一般都是應用已建立的參考方法進行定值，并附有給定置信水平的不確定度，多用于臨床檢驗項目中的量值傳遞、準確度質量控制等。該類標準物質主要為定義明確的小分子化合物和蛋白質分子，前者主要包括代謝產物/底物類、離子類、非肽激素類、維生素與微量營養(yǎng)素等，后者包括酶和其他蛋白。

1.1 小分子化合物類標準物質

有機小分子臨檢項目的參考方法一般基于儀器分析原理，主要有同位素稀釋質譜法（isotope dilution mass spectrometry，IDMS）、分光光度法及拉曼光譜法等。其中，同位素稀釋質譜法是國際物質的量咨詢委員會認定的基準測量方法，是目前國際公認的可準確測定小分子化合物的最可靠的分析原理之一。臨床化學領域中，同位素稀釋質譜法與色譜結合使用在建立代謝產物/底物類檢測的參考方法中應用較廣，國內現已建立針對肌酐、尿素、尿酸、葡萄糖、同型半胱氨酸、25?羥基維生素D、葉酸、游離甘油、甘油三酯、膽固醇的同位素稀釋質譜參考方法，并且相應的已研制完成多項國家一級、二級標準物質［5，6］?？紤]到互通性，這些標準物質一般采用公認無基質效應的新鮮冰凍人血清。例如血清總膽固醇、總甘油等標準物質的制備，首先要采集健康志愿者的血清，再將血清按照性別及膽固醇水平制備不同濃度的混合血清池，經過濾后分裝完成樣品制備；按照《標準物質/標準樣品定值的一般原則和統計方法》（GB/T 15000.3?2008/ISO Guide35：2006）和國家一級標準物質技術規(guī)范（JJG 1006?1994）的要求進行均勻性和穩(wěn)定性檢驗的設計和實驗；對于候選標準物質的定值則采用已建立的同位素稀釋液相色譜串聯質譜和高效液相色譜法等參考方法，測定結果均可溯源至國際單位；最后再評價該標準物質的互通性及適用性［7］。通過此類方法制備的還包括冰凍人血清尿酸、肌酐成分分析標準物質，冰凍人血清中葡萄糖和冰凍人血清中尿素標準物質等。非肽類激素和離子類標準物質的參考測量方法主要也是同位素稀釋質譜法，其制備原料的選擇和制備過程也與代謝物/底物類相似，目前國內已經研制的標準物質包括雌二醇、17α?羥孕酮、孕酮和人血清鉀、鎂、鈣等［8］。此外，在測定血清鈣等離子類項目時，通常需要用多接收電感耦合等離子體質譜法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP?MS）先測定濃縮同位素的豐度比值，并計算濃縮同位素的濃度，不過國內已有實驗室在英國政府化學家實驗室同位素稀釋法原理基礎上建立了反應池?兩步同位素稀釋質譜法測定血清總鈣的參考方法，大幅降低了實驗對儀器性能的要求［9］。

1.2 酶學、血液學標準物質

酶催化濃度測量是臨床檢驗的特殊情況，由于是活性測量，其測定結果依賴于測量過程。目前國際臨床化學和實驗室醫(yī)學聯盟（International Federation of Clinical Chemistry and laboratory med?icine，IFCC）共頒布8個技術文件，分別講述37℃下測定肌酸激酶（creatine kinase，CK）等7種酶的催化濃度的參考方法。目前我國已有多家實驗室建立了酶學參考方法并通過了酶學參考實驗室的認證。酶學標準物質也采用了人源血清標本，相應的人血清中乳酸脫氫酶活性濃度標準物質，冰凍人血清中丙氨酸氨基轉移酶等復合酶類催化活性濃度一級、二級標準物質也已制備完畢［10，11］。同時，國內多家實驗室也參加了由IFCC組織的參考實驗室室間比對，各種酶室間變異及小組均值與國外實驗室網絡相比沒有明顯差別［12］。

在血液體液檢測領域，國內實驗室在國際血液學標準化委員會委員的指導下，也相應建立了血細胞分析的參考方法，并與國外參考實驗室長期進行高頻率的結果比對。國內首家通過ISO 17025?2005和ISO 15195?2003認可的血細胞分析參考測量實驗室也成功獲批。此外，為解決血細胞分析檢測結果的溯源問題，國內也以國際血液學標準化委員會（international council for standard?ization in haematology，ICSH）發(fā)布的參考方法為溯源標準研制出血細胞分析國家一級、二級標準物質，包括白細胞計數、紅細胞計數、血紅蛋白測定和血小板計數，氰化高鐵血紅蛋白國家一級、二級標準物質等［13?14］。這些標準物質的研制和應用，對于推動我國血細胞分析標準化工作的發(fā)展具有重要意義。

由此可知，對于膽固醇、肌酐、葡萄糖、激素等被測量定義明確的小分子化合物，參考方法和標準物質的建立具有成熟的基礎。但對于大多數蛋白分子建立參考方法仍然任重道遠。建立的標準物質在IVD產品質量評價中可以用于準確度、線性、檢測限等項目的樣本（或樣本之一），對于特異性等指標的評價則需要采用其他的樣本進行。

2 采用多中心合作標定、一致化或類似一致化溯源體系的標準物質

多中心合作標定是通過多中心采用規(guī)定的方法或不同原理的方法進行特性值的賦值，通過統計學方式對多中心的賦值進行處理后給出靶值的方式，一致化簡單的來說就是通過認可的方法，該方法并不是參考方法，依靠或不依靠參考物質對候選參考物質的特性量值進行賦值。在目前的臨床檢驗項目中，存在參考方法的僅為少數，因此大多數檢驗項目、國內的大多數免疫和核酸標準物質都采用了一致化或類似一致化的溯源體系進行溯源。

2.1 免疫學標準物質

在蛋白質大分子的檢測中主要使用免疫學檢測技術，包含化學發(fā)光免疫檢測方法、時間分辨免疫熒光法、酶聯免疫吸附法、免疫比濁法等。由于沒有絕對權威的參考方法，目前世界衛(wèi)生組織以及國內的實驗室采用多中心合作研究的方式進行標準物質的定值。激素及腎上腺皮質激素等甾體激素的常規(guī)檢驗方法一般有免疫熒光分析和時間分辨熒光免疫分析等，國際檢驗醫(yī)學溯源聯合委員會也列舉了部分非肽類激素的參考測量方法，但大部分激素現階段無法通過參考方法的形式進行標準化。例如人絨毛膜促性腺激素（human cho?rionic gonadotropin，HCG）標準物質，因為在妊娠和滋養(yǎng)葉細胞疾病的婦女血清中，發(fā)現有多種具有免疫活性的HCG分子形式，他們包括完整HCG、脫β?羧基末端的HCG、β?HCG核心片段、缺刻HCG（Nicked HCG）、HCG糖變異體、游離β?HCG和游離α?HCG，對于參考方法溯源體系來說HCG分子則是定義不明確的分子。所以HCG標準物質就是采用多中心合作標定或者說類似一致化的溯源體系進行溯源。在建立HCG國家標準品過程中，首先精確量取來源于妊娠婦女尿液的高純HCG原料、人血白蛋白和海藻糖，加入至磷酸緩沖液（0.05 mol/L，pH=7.4）內，無菌過濾后分裝，再凍干制備成HCG國家標準品候選品。以HCG第五次國際標準品（07/364）為對照品，采用9個廠家10種HCG檢測試劑盒（包括化學發(fā)光微粒子免疫法、化學發(fā)光法、電化學發(fā)光法、磁微粒分離酶聯免疫法、酶聯免疫法、時間分辨免疫熒光分析法等）進行協作標定，同時對候選品的瓶間精密度、穩(wěn)定性進行分析。制備的候選品與國際標準品同質，滿足用于HCG免疫分析及相應試劑盒的性能評價［15］。此外，類似于HCG，中國食品藥品檢定研究院還研制了胰島素、三碘甲腺原氨酸、四碘甲腺原氨酸（即甲狀腺素）、人胰島素C?肽、促甲狀腺激素、反三碘甲狀腺原氨酸、促黃體生成素、促卵泡生成素、泌乳素、生長激素、人胎盤泌乳素等。

對于腫瘤標志物類以及感染性疾病抗原抗體的標準物質，現階段國內也主要采用純品或血清樣本聯合定值，并且大多溯源到NIBSC研制的國際標準物質。例如甲胎蛋白等就是使用高純原料通過酶聯免疫法、化學發(fā)光法等不同方法進行聯合定值，溯源到國際標準品，其目的主要為試劑盒注冊檢驗及市場流通監(jiān)管，也有助于生產企業(yè)對其產品進行量值溯源［16］。乙型肝炎表面抗原、梅毒螺旋體抗體等是采用血清標準物質與國際標準品比對進行定值［17］。根據實際應用，標準物質也可以有不同組成，傳染病體外診斷試劑標準物質一般由陽性參考品、陰性參考品、最低檢出量參考品、精密性參考品及定量參考品等組成［18］。國內目前已經研制的風疹病毒IgM抗體，丙型肝炎抗體，巨細胞病毒IgG、IgM抗體等多種標準品和參考盤等，大多是通過試劑盒篩選出陽性和陰性血清，再根據預設的性能指標制備參考盤，用于全面控制診斷試劑的質量，主要控制試劑的特異性、靈敏度、精密度及定量試劑的準確性等［19?20］。

需要注意的是，由于在三碘甲腺原氨酸、四碘甲腺原氨酸（即甲狀腺素）、人胰島素C?肽、反三碘甲狀腺原氨酸等激素方面也發(fā)展了參考方法，對于此類同時存在兩種溯源體系的情況，不同溯源體系的標準物質之間的相關性以及對檢測試劑質量評價的影響也需要進行充分評估。

2.2 核酸標準物質

隨著生物技術的進步，核酸檢測在醫(yī)學診斷領域得到廣泛應用。但核酸檢測易受到不同檢測原理、樣本基質、檢測病毒基因變異、人群中基因多態(tài)性以及不同基因突變類型等多種因素的影響，導致不同實驗室的檢測結果，在準確性、量值、靈敏度和特異性方面也出現較大的差異。為使不同實驗室，不同方法間檢測的結果具有可比性，就必須使檢測標準化。但由于缺乏一級參考測量程序，所以大部分核酸類標準物質也都是經過多中心合作聯合定值，其制備過程已經程序化。在定值方法上，主要有紫外分光光度法、熒光染料法、實時熒光定量PCR法、磷元素同位素定量方法、脫氧單磷酸核苷定量的同位素稀釋質譜法、數字PCR方法等。其中數字PCR方法是比較新的一種DNA定量技術，此方法不需要線性標準品即可計算出待檢DNA分子的拷貝數，目前NIST等國際機構已有核酸標準物質采用數字PCR方法進行定值。但是現有的技術還很難從絕對意義上對核酸的量值進行確定。

一般WHO為病毒核酸擴增技術制定的國際參考物質來源于稀釋后凍干分裝的且含滅活野生型病毒的人混合陽性血漿，表述單位通常為IU（international unit）。這種標準物質量值為WHO經多中心研究確定其可以作為第一個國際標準物質或參考制劑后，通過主觀方式賦予的一個標準數值，后來的替代標準則以第一個標準值為標準繼續(xù)通過國際多中心合作來定值。規(guī)定IU可以使某種物質的生物活性在國際上使用同一種計量單位表示，而使不同于國際單位的單位體系具有互通性。

近年來國內在核酸標準物質的研制方面也做了大量的工作，早期研制的乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸血清標準物質、丙型肝炎病毒核糖核酸血清標準物質被國家質檢總局批準為國家二級標準物質，其量值可溯源到第一代國際標準品［21］。人脲原體核酸檢測國家參考品，人乳頭瘤病毒全基因組基因分型國家參考品等的建立也對相應檢測項目進行了規(guī)范［22?23］。此外，國內已發(fā)布的核酸標準物質還包括乙型肝炎分型、丙型肝炎分型、人免疫缺陷病毒?1、人免疫缺陷病毒?1分型、人免疫缺陷病毒?2、沙眼衣原體、禽流感H7N9、結核分枝桿菌，EB病毒等。以上介紹的核酸標準物質大部分是用接近天然基體的生物材料制備而成。目前國內也有實驗室采用人工合成的方法，基于MS2噬菌體衣殼蛋白包裝外源RNA的病毒樣顆粒，研制無生物傳染危險性且穩(wěn)定的RNA病毒核酸質控品和標準物質［24］。

同時，隨著測序技術的大規(guī)模應用，為建立能對高通量測序技術平臺及相關試劑產品進行有效性能評估，中國食品藥品檢定研究院采用多中心合作標定的方式研制了測序儀性能評價用DNA參考品和高通量測序檢測外周血胎兒染色體非整倍體參考品。針對高通量測序檢測外周血胎兒染色體非整倍體檢測試劑盒的影響因素，如母親外周血中胎兒游離DNA的含量、胎兒三體的不同類型（如標準三體、嵌合體以及平衡易位突變等）對結果的影響、DNA序列差異對結果的影響特別是高GC含量序列對結果的影響、小片段DNA分子在分離純化中的片段篩選、文庫構建中的偏移、測序文庫的庫容和量、在軟件分析中采用的算法主要基于的統計學原理、在結果分析中原始數據是否符合統計學要求、參考數據庫的建立等，高通量測序檢測外周血胎兒染色體非整倍體參考品中針對性的設計了數據量控制參考品、陽性參考品、微缺失微重復參考品、嵌合體參考品、檢測限參考品、陰性參考品等參考品組成了參考盤，可以合理地進行產品質量評價。

3 展望

綜上所述，自上世紀80年代以來，從無機元素、有機小分子逐漸發(fā)展到核酸、蛋白質等生物大分子的標準物質，從純物質標準物質逐漸發(fā)展到基體標準物質，國內體外診斷試劑標準物質的研制工作有了長足的進步。隨著精準醫(yī)學大幕的拉開，相關的診斷技術將迎來快速發(fā)展的春天。為了保證臨床診斷的檢測質量，需要及時建立新的可靠的標準物質，這也就對我國體外診斷試劑量值溯源工作提出了更高的要求。相信在不久的將來，經認可的適用于臨床檢驗的標準物質將會越來越多，它們將對臨床檢驗的標準化、一致化檢測起到積極作用，為臨床正確診斷和合理用藥提供重要依據。

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Quality evaluation of in vitro diagnostic reagents and traceability of reference materials

FU Yue1，GAO Xunian2，HUANG Jie3★
(1.Beijing Institute of Medical Device Testing,Beijing,China,101111;2.Guangzhou Bangdesheng Biological Technology Co.,Ltd,Guangdong,Guangzhou,China,510665;3.National Institutes for Food and Drug Control,Beijing,China,100050)

Reference materials for in vitro diagnostic reagents are important in achieving the traceability of measurements and guaranteeing the quality of the test data as well as the result.Since the 1980s, domestic laboratories have done much work in the preparation of reference materials for in vitro diagnostic reagents.This article aims to introduce the reference materials of in vitro diagnostic reagents and its traceability systems:the metrological traceability system,which is based on reference procedures,reference materials,and reference systems;and the homogenization traceability system based on collaborative study to determine the assignment of value to reference materials.

In vitro diagnostic reagents;Reference materials;Traceability of measurements

1.北京市醫(yī)療器械檢驗所，北京101111 2.廣州邦德盛生物科技有限公司，廣東，廣州510665 3.中國食品藥品檢定研究院，北京100050

★通訊作者：黃杰，E?mail：jhuang5522@126.com