陳瑤 吳英松

HIV?1耐藥基因檢測的研究進(jìn)展

陳瑤 吳英松★

HIV?1耐藥是影響艾滋病抗病毒治療效果的主要因素。隨著抗病毒療法的普及和接受治療者的增多，HIV?1耐藥的問題日益凸顯，使艾滋病治療面臨巨大的挑戰(zhàn)。因此，了解各抗病毒藥物治療引起的HIV?1耐藥突變位點并及時采用有效方法進(jìn)行耐藥基因檢測對臨床治療具有重要指導(dǎo)意義。HIV?1耐藥位點基因型檢測方法因其快速準(zhǔn)確的特點，目前是HIV?1耐藥檢測最常用也是最有前景的方法。本文對HIV?1耐藥位點和耐藥基因檢測的研究進(jìn)展做簡單綜述。

HIV?1；耐藥位點；基因型；耐藥檢測

艾滋?。╝cquired immune deficiency syndrome，AIDS）是由人免疫缺陷病毒（human immunodefi?ciency virus，HIV）引起的傳染病，目前世界范圍內(nèi)主要流行HIV?1。HIV耐藥是由于病毒基因發(fā)生突變，使得藥物作用靶點的生化特點或者結(jié)構(gòu)特征發(fā)生改變，導(dǎo)致病毒對抗病毒藥物敏感性降低，或者失去敏感性［1?3］。隨著高效聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒（highly active antiretroviral therapy，HAART）藥物的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致HIV?1病毒發(fā)生突變。耐藥突變株在藥物選擇壓力下逐漸成為優(yōu)勢病毒株，導(dǎo)致耐藥菌株感染的病例不斷出現(xiàn)。因此，作為幫助臨床醫(yī)生選擇聯(lián)合用藥方案的重要工具，耐藥檢測就顯得十分重要。目前HIV?1耐藥檢測方法主要有表型檢測和基因型檢測。其中，基因型檢測因其快速準(zhǔn)確的特點，成為調(diào)整治療方案的首選［3］。

1 耐藥基因的分類

隨著抗病毒治療的發(fā)展及新型靶點抗病毒藥物的臨床應(yīng)用，已確定了200多個各種類型HIV?1耐藥相關(guān)的基因突變，它們對于耐藥及病毒的生物學(xué)特性產(chǎn)生不同程度的影響［4?5］。其中有不少受到嚴(yán)重的關(guān)切，并且已經(jīng)應(yīng)用到臨床的耐藥位點篩查，下表（表1）列出了臨床檢測常用的HIV?1的耐藥基因突變及其針對的藥物［6?13］。臨床醫(yī)生可通過不同方法檢測相應(yīng)的位點，推測基因突變對臨床耐藥的影響，從而更好地指導(dǎo)臨床藥物的選擇和調(diào)換。

表1 HIV?1耐藥基因檢測靶點Table 1 Targets of HIV?1 drug?resistant gene detection

2 耐藥基因的檢測對象和檢測時機(jī)

對HIV?1耐藥及其臨床意義的認(rèn)識隨著抗HIV藥物的研發(fā)和應(yīng)用逐步積累和深入。隨著耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，不管是新發(fā)的患者選擇用藥，還是治療中的患者監(jiān)控用藥效果，都需要進(jìn)行耐藥性檢測。

初始抗病毒治療的患者應(yīng)進(jìn)行耐藥檢測，以指導(dǎo)并制定抗病毒治療方案。已經(jīng)證實耐藥HIV?1毒株能夠傳播，因此現(xiàn)如今的觀點是，從未治療過的患者也可能攜帶耐藥毒株，這將導(dǎo)致對初始治療方案的無應(yīng)答或應(yīng)答差。對這類患者進(jìn)行耐藥檢測有助于選擇能夠取得最大病毒抑制效果的治療方案［14］。在治療過程中，對于接受抗病毒治療的患者在改變抗病毒治療方案時，病毒學(xué)應(yīng)答失敗（HIV?1 RNA＞1 000 copies/mL）或病毒抑制不理想時，耐藥監(jiān)測是判斷是否發(fā)生耐藥以及耐藥類型，從而指導(dǎo)藥物選擇和調(diào)換進(jìn)行后續(xù)治療的必須手段［15?16］。

目前耐藥性檢測有兩種方法，一種是表型耐藥分析，需要對病毒進(jìn)行體外培養(yǎng)，時間較長，操作繁復(fù)，價格昂貴。因此基因檢測的快速準(zhǔn)確的特點讓其越來越成為臨床指導(dǎo)藥物選擇的重要手段。尤其是在對抗病毒聯(lián)合治療效果不好，病毒學(xué)應(yīng)答失敗的患者的藥物調(diào)整的過程中，快速準(zhǔn)確的基因治療有利于快速指導(dǎo)藥物選擇和調(diào)換［15?16］。

3 HIV?1耐藥基因檢測的常用方法

3.1 等位基因特異擴(kuò)增PCR（Allele?specific PCR，AS?PCR）方法

AS?PCR是一種基于單核苷酸多態(tài)（single nu?cleotide polymorphism，SNP）的PCR標(biāo)記方法。上世紀(jì)90年代首次報道使用AS?PCR方法檢測HIV?1耐藥突變，后經(jīng)技術(shù)改良，該方法已越來越成熟，具有高靈敏度和準(zhǔn)確度，重復(fù)性好，較為省時省力，快速且經(jīng)濟(jì)實惠，也可檢測變異率低于1%的病毒準(zhǔn)種等特點。Hunt等［17］采用AS?PCR和深度測序法同時檢測了105例使用奈韋拉平預(yù)防失敗的HIV?1感染患兒，兩種方法均可檢測到低水平的變異株，本研究發(fā)現(xiàn)兩種方法檢測突變位點Y181C和K103N的相關(guān)系數(shù)分別為0.94和0.89。但該方法存在一些不足，即需知道變異位點在核酸的具體位置；若引物或探針結(jié)合位點處出現(xiàn)多態(tài)性可顯著降低該方法的準(zhǔn)確性。另外，為了確保擴(kuò)增效率相同，AS?PCR要求引物退火位置相同。這局限了這種方法應(yīng)對不斷出現(xiàn)的新的耐藥位點，不利于臨床綜合判斷解釋耐藥檢測的結(jié)果。

3.2 限制性片段質(zhì)譜多態(tài)性技術(shù)（restriction frag?ment mass polymorphism，RFMP）

限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)的原理是檢測DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小，該技術(shù)將基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption/ionization time?of?flight mass spectrometry，MALDI?TOF MS）技術(shù)結(jié)合，根據(jù)被測物質(zhì)的相對分子質(zhì)量進(jìn)行定量檢測。該方法敏感，準(zhǔn)確，重復(fù)性好，能夠發(fā)現(xiàn)數(shù)量不足1%的變異株。Lee等采用該技術(shù)檢測100份血漿標(biāo)本，并與Sanger測序法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)RFMP方法要求的病毒載量水平更低，兩種方法在檢測逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶編碼區(qū)的K65R、T69Ins/D、L74V/I、V106A/M、Q151M、Y181C、M184V/I、T215Y/F、D30N、M46I、G48V、I50V、I54L/S、V82A、I84V、L90M等位點時的一致性均≥94%［18］。但該方法僅能檢測已知位點變異，且價格昂貴，很難在臨床推廣應(yīng)用。

3.3 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是將大量特定的基因片段或寡核苷酸片段作為探針有序和高密度地排列，固定在玻璃或膜等載體上，然后與待測有標(biāo)記的樣品核酸按堿基配對的原則雜交然后檢測結(jié)果。它借助熒光標(biāo)記進(jìn)行掃描觀察，通量高，可實現(xiàn)大量SNP的檢測。據(jù)報道，學(xué)者采用本方法共檢測了來自瑞士和坦桑尼亞人群的HIV?1基因組片段序列，共獲得2 550個SNP，與Sanger測序的一致性為92.7%［19］。本方法同樣主要針對已知變異位點，現(xiàn)隨著基因芯片高通量測序技術(shù)的發(fā)展，也可用于檢測未知變異位點。但本方法的成本高，受實驗條件所限，尚不能在實驗室普及開展。

3.4 Sanger測序法

隨著測序技術(shù)不斷深入各級實驗室，許多分子生物實驗室具備Sanger測序的條件，其價格合理，且可用于自建方法分析，該方法已經(jīng)作為HIV?1耐藥檢測的主要技術(shù)平臺和金標(biāo)準(zhǔn)，在臨床和科研中均已被采用。目前基于該技術(shù)原理已產(chǎn)生了兩種成熟的用于HIV?1耐藥檢測的商業(yè)化系統(tǒng)TRUGENETM和ViroSeqTM以及實驗室自建的In?house檢測方法。耐藥性的分析需要通過在線數(shù)據(jù)庫完成，即用戶將測序序列提交到數(shù)據(jù)庫便可直接得到耐藥突變分析結(jié)果。該方法便捷，但在堿基判讀時設(shè)定的閾值較高［20］，且靈敏度低，只有當(dāng)HIV?1變異株超過準(zhǔn)種池的20%時才可被檢測到［21］，即低頻率的突變易發(fā)生漏檢，從而低估耐藥突變情況，影響耐藥監(jiān)測的結(jié)果。

3.5 深度測序

隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，深度測序通量高，已在發(fā)達(dá)國家廣泛應(yīng)用于HIV?1耐藥檢測。該方法可精確檢測到只發(fā)生在1%的HIV?1毒株中的耐藥性突變［22］，極大程度提高了檢測的靈敏度，因低頻突變對高效聯(lián)合抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療（highly active antiroviral therapy，HAART）治療的影響存在爭議，比利時學(xué)者采用深度測序方法檢測了70例接受NNRTI治療患者的突變位點，發(fā)現(xiàn)該方法并不能確證逆轉(zhuǎn)錄區(qū)出現(xiàn)低頻突變與治療失敗的關(guān)聯(lián)性［23］。有比較發(fā)現(xiàn)相同樣本采用深度測序可檢測到的HIV?1基因型耐藥位點數(shù)目是Sanger測序法的1.5～3倍［22］。但深度測序的檢測質(zhì)量受文庫構(gòu)建偏倚的影響，如引物結(jié)合位點耐藥突變或多樣性的出現(xiàn)或PCR擴(kuò)增效應(yīng)等。近年來深度測序技術(shù)已出現(xiàn)多種平臺，其成本也已逐漸降低，不過對于低收入國家來說仍難以負(fù)擔(dān)。此外，該技術(shù)前期手工操作步驟多，上機(jī)收集的數(shù)據(jù)量大，目前仍缺乏簡單便捷的生物信息學(xué)分析流程。因此，深度測序尚不能在各實驗室廣泛開展應(yīng)用于HIV?1耐藥檢測分析。

4 展望

患者服藥依從性、藥物間的相互作用等均可影響HIV?1耐藥的產(chǎn)生。隨著抗病毒藥物的廣泛應(yīng)用，耐藥問題凸顯，出現(xiàn)的耐藥突變位點極為多樣，且突變位點間的相互作用也可引起耐藥的發(fā)生，從而導(dǎo)致治療失敗。中低收入國家由于可使用的抗病毒治療藥物種類有限，主要存在NRTI、NNRTI耐藥現(xiàn)象，約有10%～30%在接受NRTI或NNRTI治療過程中出現(xiàn)病毒抑制失敗，大多因出現(xiàn)了耐藥病毒株［1?2］。雖然PI、INSTI等藥物在臨床應(yīng)用尚少，耐藥率明顯低于歐美發(fā)達(dá)國家，但隨著條件許可，可使用的抗病毒藥物逐漸增加。因此，有必要加強(qiáng)了解突變位點與各類耐藥的相關(guān)性，以助于臨床提供準(zhǔn)確的治療方案。此外，HIV?1耐藥檢測已被發(fā)達(dá)國家納入監(jiān)測指標(biāo)，它既可為初始抗病毒治療也可為已出現(xiàn)病毒學(xué)抑制失敗的后續(xù)治療選擇或更換藥物提供指導(dǎo)［3?4］。多數(shù)情況下推薦使用基因型檢測，因其相對操作簡便、省時、花費少，在野生毒株與耐藥毒株混合存在的情況下具有較高的靈敏性。在常見的基因型檢測方法中，質(zhì)譜和基因芯片的方法因為成本較高較少應(yīng)用于臨床。隨著成本降低及條件優(yōu)化，未來傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法有望被深度測序所取代［21?22］。

總而言之，與其他病毒性疾病的臨床檢驗方法相比，HIV?1基因型耐藥檢測的程序復(fù)雜，影響因素多，受HIV?1固有的高度變異和準(zhǔn)種的影響，結(jié)果的解釋比較困難。檢測出耐藥基因是一方面，后續(xù)復(fù)雜和繁瑣的生物信息學(xué)處理以獲得與結(jié)果的解釋也存在極大的復(fù)雜性和難度。存在解釋的結(jié)果與臨床狀況不能一致的現(xiàn)象［19?20］。近年來隨著深度測序技術(shù)的不斷發(fā)展關(guān)于基因型變異的數(shù)據(jù)大量積累，前瞻性檢驗設(shè)計和回顧性臨床研究的不斷發(fā)展，將有助于改進(jìn)分析方法，更好的理解突變、耐藥和臨床治療應(yīng)答3方面的關(guān)系，為耐藥基因檢測更好地應(yīng)用于臨床提供更有力的支持。

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Advances in the drug resistance genotype detection of HIV?1

CHEN Yao,WU Yingsong★
(School of Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong, China,510515)

Anti?retroviral therapy(ART)can help reduce viral loads and infection?associated morbid?ity.It can also prolong survival,prevent transmission,and improve clinical outcomes.However,with the spread of ART and increasing numbers of patients receiving treatment,more and more HIV?1 drug resistant strains have appeared,which brings about a great challenge to the therapy of acquired immune deficiency syndrome (AIDS).Therefore,to be familiar with and to detect HIV?1 resistance mutations caused by various anti?virus drugs in a timely manner will be of great significance for clinical treatment.In this review,we will summarize the advances in the detection of HIV?1 resistance mutations and genotypes.

HIV?1;Drug resistance mutation;Genotype;Drug?resistance detection

重大傳染病創(chuàng)新檢測試劑的研制和應(yīng)用研究（廣州市協(xié)同創(chuàng)新重大專項，201400000004?1）作者單位：南方醫(yī)科大學(xué)檢驗與生物技術(shù)學(xué)院，廣東，廣州510515

★通訊作者：吳英松，E?mail：wg@smu.edu.cn