趙曉光++李厚忠++孟娜娜++王利強(qiáng)++楊永濤++杜美超++張羽飛

二甲磺酸乙烷對成年大鼠睪丸間質(zhì)不同時(shí)間點(diǎn)

[摘要] 目的 研究二甲磺酸乙烷（EDS）注射對雄性大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞類固醇關(guān)鍵合成酶表達(dá)的影響，并進(jìn)一步了解EDS對大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞類固醇關(guān)鍵合成酶可能的調(diào)節(jié)機(jī)制。 方法 將25只90 d雄性SD大鼠隨機(jī)分為兩組，對照組（0 d，n = 5）一次性腹腔內(nèi)注射生理鹽水，EDS組（n = 20）一次性腹腔內(nèi)注射EDS 70 mg/kg體重。EDS組注射后7、21、35、90 d后取血清和睪丸組織，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血清及睪丸中的睪酮水平，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡方法（Western blot）分別檢測睪酮合成相關(guān)基因類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）、膽固醇側(cè)鏈裂解酶（P450scc）、3β-羥基類固醇脫氫酶1型（3β-HSD1）、P45017α-羥化酶1（P450c17a1）、17β-羥基類固醇脫氫酶3型（17β-HSD3）mRNA和蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 與對照組比較，EDS處理7 d后，睪丸內(nèi)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞幾乎完全被破壞，導(dǎo)致睪酮水平急劇下降（P < 0.01），睪酮合成相關(guān)酶StAR、3βHSD、P450scc、P450c17、17β-HSD3的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著下降（P < 0.01），而處理21、35 d后，上述相關(guān)酶mRNA及蛋白表達(dá)水平均有所回升（P < 0.01或P < 0.05），處理90 d后，上述相關(guān)酶基因及蛋白的表達(dá)水平已經(jīng)基本上恢復(fù)到與對照組相近的水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 EDS能夠特異性地破壞雄性SD大鼠睪丸組織中的睪丸間質(zhì)細(xì)胞，EDS的此種效應(yīng)對研究睪丸間質(zhì)細(xì)胞缺失下睪丸功能的變化進(jìn)而研究精子發(fā)生的內(nèi)分泌調(diào)控均有較大意義。

[關(guān)鍵詞] 睪丸間質(zhì)細(xì)胞；二甲磺酸乙烷；睪酮；類固醇合成酶

[中圖分類號] R339.21 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（c）-0015-04

睪丸間質(zhì)細(xì)胞（Leydig cell）是哺乳動物睪丸間質(zhì)中的一種重要的內(nèi)分泌細(xì)胞，具有合成和分泌體內(nèi)超過90%睪酮的功能，對于雄性的生育能力及第二性征的維持至關(guān)重要，是男性體內(nèi)雄激素的最主要來源。Leydig的發(fā)育、數(shù)量及雄激素合成功能對男性的各個(gè)方面都具有決定性的影響[1]。二甲磺酸乙烷（ethane dimethane sulfonate，EDS）作為一種細(xì)胞毒性烷化劑，在20世紀(jì)80年代即已證實(shí)可以選擇性地殺死成年大鼠睪丸中的Leydig細(xì)胞，被認(rèn)為是研究Leydig細(xì)胞再生的候選藥物之一[2-3]。目前，國外采取EDS建立模型研究Leydig細(xì)胞再生及其相關(guān)研究的報(bào)道較多[4-7]，但國內(nèi)報(bào)道相對較少，因此，本研究通過觀察一次性腹腔注射EDS對成年大鼠Leydig細(xì)胞的作用，測定EDS對處理后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠睪丸Leydig細(xì)胞類固醇關(guān)鍵合成酶類固醇合成快速調(diào)節(jié)蛋白（StAR）、細(xì)胞色素P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶（P450scc）、3β-羥類固醇脫氫酶1（3β-HSD1）、P45017α-羥化酶1（P450c17a1）、17β-羥類固醇脫氫酶3（17β-HSD3）在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平表達(dá)的影響，為利用EDS建立體內(nèi)Leydig細(xì)胞再生模型的建立提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與主要試劑儀器

90 d SPF級健康雄性SD大鼠，體重250～280 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK京2012-0001。主要試劑：EDS（純度>97%，洛克菲勒大學(xué)Renshan Ge教授惠贈）；睪酮酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；RNA提取試劑盒（美國Omega公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司）；SYBR Green試劑盒（美國Promega公司）；PCR引物（上海生物工程有限公司）；抗體（美國Abcam公司）。主要儀器：熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；臺式低溫高速離心機(jī)（德國Sigma公司）；超微量核酸蛋白測定儀（美國Thermo Fisher公司）；全自動酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將25只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為兩組，對照組（0 d，n = 5）一次性腹腔內(nèi)注射生理鹽水，EDS組（n = 20）一次性腹腔內(nèi)注射EDS 70 mg/kg體重；EDS組注射后于第7、21、35、90天結(jié)束，于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)固定時(shí)間處死大鼠（每組5只），采集血清和睪丸組織，用ELISA測定血清中及睪丸中的睪酮水平，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡方法（Western blot）分別檢測睪丸組織內(nèi)睪酮合成相關(guān)基因StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17a1、17β-HSD3基因和蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本文數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，組間兩兩比較采用Dunnett檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EDS對大鼠血清及睪丸內(nèi)激素水平的影響

EDS處理7 d后，大鼠血清中及睪丸內(nèi)睪酮水平濃度急劇下降，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），21 d后，濃度均有所回升，到35 d，已經(jīng)分別恢復(fù)到對照組水平的71%和75%，到90 d，濃度均已經(jīng)基本上恢復(fù)與對照組相當(dāng)?shù)乃剑ǚ謩e為109%和97%）。見圖1。

2.2 EDS暴露后對睪丸內(nèi)相關(guān)基因相對表達(dá)水平的影響

隨著EDS處理時(shí)間的延長，各基因的表達(dá)趨勢基本一致。EDS處理7 d，StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17a1和17β-HSD3 mRNA水平較對照組急劇降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。而后隨著EDS處理時(shí)間的延長，濃度呈上升趨勢，處理21 d后，StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17a1及17β-HSD3的表達(dá)分別回升24%、15%、61%、38%和60%（P < 0.01或P < 0.05），處理35 d后分別回升了43%、28%、80%、60%和77%（P < 0.01）（3β-HSD1、17β-HSD3表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），到處理90 d后，上述指標(biāo)表達(dá)水平與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖2。

2.3 EDS暴露后對睪丸內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

EDS處理7 d，StAR、P450scc、3β-HSD1和17β-HSD3蛋白的表達(dá)水平較對照組急劇降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。而后隨著EDS處理時(shí)間的延長，各蛋白的表達(dá)量呈上升趨勢，到90 d，與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。處理21 d后，StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17a1及17β-HSD3的表達(dá)分別回升47%、80%、43%、55%和52%（P < 0.01）（P450scc表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），處理35 d后分別回升了72%、56%、80%、60%和76%（P < 0.01或P < 0.05）（P450scc表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），到處理90 d后，分別回升了79%、75%、80%、71%和80%，與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

3 討論

Leydig細(xì)胞在其分化發(fā)育中有4個(gè)顯著不同的階段：睪丸間質(zhì)干細(xì)胞（SLC）、睪丸間質(zhì)祖細(xì)胞（PLC）、未成熟睪丸間質(zhì)細(xì)胞（ILC）和成熟睪丸間質(zhì)細(xì)胞（ALC）[8，15-16]。Leydig細(xì)胞合成和分泌的睪酮是一系列酶促反應(yīng)，其主要依賴于StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17a1和17β-HSD3等關(guān)鍵酶的調(diào)控[9-10]。其中StAR主要參與類固醇合成的早期調(diào)節(jié)，被認(rèn)為是睪酮合成起始限速步驟，P450scc被認(rèn)為是睪酮合成的限速步驟，它主要是將轉(zhuǎn)入線粒體內(nèi)的膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮，并在3β-HSD1作用下形成孕酮，后者再經(jīng)p450c17a1進(jìn)一步催化生成雄烯二酮，后者在17β-HSD的作用下，最終生成睪酮[11-13]。因此，Leydig細(xì)胞合成睪酮過程中的關(guān)鍵酶表達(dá)降低的直接結(jié)果必然是引起單個(gè)細(xì)胞合成睪酮的表達(dá)能力明顯降低，從而影響睪酮的合成和分泌[14-16]。EDS是具有Leydig細(xì)胞特異性“敲除”的化合物。

EDS可以暫時(shí)殺死成熟的Leydig細(xì)胞，其后伴隨是Leydig細(xì)胞再生的過程，這種再生過程與人類青春期Leydig細(xì)胞的分化過程相類似。馬學(xué)等[17]給予新生雄性SD大鼠腹腔注射EDS后，建立了“敲除”胚胎睪丸間質(zhì)細(xì)胞（FLC）模型，并確定了EDS有效和安全的劑量，為深入研究FLC和ALC之間的關(guān)系做了很好的前期研究基礎(chǔ)。張磊等[18]研究表明大鼠和小鼠EDS處理的生精小管體外培養(yǎng)模型能夠很好地模擬SLC在體內(nèi)的發(fā)育分化過程，彌補(bǔ)了細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)在研究SLC發(fā)育分化中的不足，建立了一個(gè)非常有價(jià)值的研究模型，尤其是在篩選和評估不同外源物質(zhì)對SLC分化發(fā)育的影響研究有重要的作用。筆者也在前期的研究中利用EDS建立了“敲除”Leydig細(xì)胞模型的實(shí)驗(yàn)，研究了再生后的Leydig細(xì)胞的基因表達(dá)情況[19-20]，為后續(xù)研究Leydig細(xì)胞發(fā)育生物學(xué)奠定了基礎(chǔ)。

本研究利用EDS處理大鼠后，分別在第0、7、21、35、90天檢測血清中和睪丸內(nèi)睪酮水平，并用qRT-PCR和Western blot檢測了相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)類固醇合成關(guān)鍵酶StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17和17β-HSD3基因和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，這些酶的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平在EDS處理7 d時(shí)迅速下降，隨著處理時(shí)間的延長都呈回升趨勢，表達(dá)趨勢呈一致。表明，大鼠腹腔注射EDS 7 d后睪丸ALC被殺滅，但SLC仍然存在，逐漸增殖分化，Leydig細(xì)胞又會再生。結(jié)果與既往理論也不謀而合，即Leydig細(xì)胞的發(fā)育經(jīng)歷4個(gè)階段：干細(xì)胞（第0天）、祖細(xì)胞（第7天）、未成熟細(xì)胞（第21天）和成熟細(xì)胞（第90天）。

以上結(jié)果提示，EDS可以作為建立去除Leydig細(xì)胞模型的候選藥物，并且該模型也可以作為進(jìn)一步深入研究Leydig細(xì)胞發(fā)育生物學(xué)研究的動物模型，同時(shí)該模型對研究Leydig細(xì)胞缺失，進(jìn)而導(dǎo)致睪丸功能的變化以及精子發(fā)生的內(nèi)分泌調(diào)控均有較大意義。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Bittman EL. Timing in the Testis [J]. J Biol Rhythms，2016， 31（1）：12-36.

[2] Morris ID，Phillips DM，Bardin CW. Ethylene dimethanesulfonate destroys Leydig cells in the rat testis [J]. Endocrinology，1986，118（2）：709-719.

[3] Ariyaratne HB，Mills N，Mason JI，et al. Effects of thyroid hormone on Leydig cell regeneration in the adult rat following ethane dimethane sulphonate treatment [J]. Biol Reprod，2000，63（4）：1115-1123.

[4] Lobo MV，Arenas MI，Huerta L，et al. Liver growth factor induces testicular regeneration in EDS-treated rats and increases protein levels of class B scavenger receptors [J]. Am J Physiol Endocrinol Metab，2015，308（2）：E111- E121.

[5] Chen B，Chen D，Jiang Z，Li J，et al. Effects of estradiol and methoxychlor on Leydig cell regeneration in the adult rat testis [J]. Int J Mol Sci，2014，15（5）：7812-7826.

[6] O'Shaughnessy PJ，Morris ID，Baker PJ. Leydig cell re-generation and expression of cell signaling molecules in the germ cell-free testis [J]. Reproduction，2008，135（6）：851-858.

[7] Yang ZW，Kong LS，Guo Y，et al. Histological changes of the testis and epididymis in adult rats as a result of Leydig cell destruction after ethane dimethane sulfonate treatment：a morphometric study [J]. Asian J Androl，2006，8（3）：289-299.

[8] Ge RS，Dong Q，Sottas CM，et al. In search of rat stem Leydig cells：identification，isolation，and lineage specific development [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（8）：2719-2724.

[9] Dong L，Wang H，Su Z，et al. Steroidogenic acute regulatory protein is a useful marker for Leydig cells and sex？cord stromal tumors [J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol，2011，19（3）：226-232.

[10] Mack SO，Garrett WM，Guthrie HD. Absence of correlation between in situ expression of cytochrome P450 17alpha hydroxylase/lyase and 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/（Delta-4）isomerase messenger ribonucleic acids and steroidogenesis during pubertal development in the rat testis [J]. J Steroid Biochem Mol Biol，2000，73（1/2）：19-28.

[11] Payne AH，Hales DB. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones [J]. Endocr Rev，2004，25（6）：947-970.

[12] Luu-The V. Assessment of steroidogenesis and steroidogenic enzyme functions [J]. J Steroid Biochem Mol Biol，2013，137：176-182.

[13] Tremblay JJ. Molecular regulation of steroidogenesis in endocrine Leydig cells [J]. Steroids，2015，103：3-10.

[14] Peak TC，Haney NM，Wang W，et al. Stem cell therapy for the treatment of Leydig cell dysfunction in primary hypogonadism [J]. World J Stem Cells，2016，8（10）：306-315.

[15] Smith LB，O'Shaughnessy PJ，Rebourcet D. Cell-specific ablation in the testis：what have we learned？ [J]. Andrology，2015，3（6）：1035-1049.

[16] Tremblay JJ. Molecular regulation of steroidogenesis in endocrine Leydig cells [J]. Steroids，2015，103：3-10.

[17] 馬學(xué)，黃魯剛，董強(qiáng).二甲磺酸乙烷對大鼠睪丸胚胎型Leydig細(xì)胞的作用[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2013，45（5）：770-773.

[18] 張磊，張齊好，蘇志堅(jiān)，等.二甲磺基乙烷處理生精小管體外培養(yǎng)模型的建立[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，35（3）：327-332.

[19] Zhang YF，Yuan KM，Liang Y，et al. Alterations of gene profiles in Leydig-cell-regenerating adult rat testis after ethane dimethanesulfonate treatment [J]. Asian J Androl，2015，17（2）：253-260.

[20] Guo J，Zhou H，Su Z，et al. Comparison of cell types in the rat Leydig cell lineage after ethane dimethanesulfonate treatment [J]. Reproduction，2013，145（4）：371-380.

（收稿日期：2016-10-11 本文編輯：張瑜杰）