羅凱，艾克特，夏理海，李由申，張進雄

許巧情，郜衛(wèi)華

3種水產(chǎn)致病弧菌的生長速度對比研究

羅凱，艾克特，夏理海，李由申，張進雄

采用LB液體培養(yǎng)基，按照1∶500的比例對鰻弧菌(Vibrioanguillarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)和河流弧菌(V.fluvialis)進行擴大培養(yǎng)，并測定不同時間段細菌培養(yǎng)液光密度D600nm值和重量來間接反映其生長情況。結(jié)果顯示,鰻弧菌在5.75h時D600nm為1.046，溶藻弧菌在4.5h時D600nm為1.064，河流弧菌在3.75h時D600nm為1.071。這表明河流弧菌生長速度最快，溶藻弧菌次之，鰻弧菌生長速度最慢。

鰻弧菌(Vibrioanguillarum);溶藻弧菌(V.alginolyticus);河流弧菌(V.fluvialis);生長速度

弧菌能夠誘發(fā)多種養(yǎng)殖動物產(chǎn)生疾病,常引起疾病大面積爆發(fā)，不僅發(fā)病率較高,嚴重的甚至導(dǎo)致死亡。這在南美白對蝦的養(yǎng)殖中最為突出，給南美白對蝦的養(yǎng)殖帶來巨大的經(jīng)濟損失。鑒于此，有關(guān)弧菌的致病原理、鑒定方法和防治措施等報道較多[1～4]。據(jù)有關(guān)資料顯示，溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、鰻弧菌(V.anguillarum)、河流弧菌(V.fluvialis)、霍亂弧菌(V.cholerae)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、魚腸道弧菌(V.ichthyoenteri)、燦爛弧菌(V.splendidus)、副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)、殺鮭弧菌(V.salmonicida)、美人魚弧菌(V.damsela)、奧氏弧菌(V.ordalii)、費氏弧菌(V.fischeri)、鯊魚弧菌(V.carchariae)、海利斯頓氏弧菌(V.pelagius)及最小弧菌(V.mimicus)等多種弧菌可以引發(fā)相關(guān)魚類爆發(fā)疾病[5～11]，其中的一些種類甚至?xí)?dǎo)致其他動物和人類致病[12～16]。本研究通過生長試驗比較了鰻弧菌、溶藻弧菌和河流弧菌的生長速度，以期為相應(yīng)疾病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種來源及活化

菌種來源：鰻弧菌、溶藻弧菌和河流弧菌菌種均為上海海洋大學(xué)所贈。

菌種活化：將-80℃冰箱凍存的菌種置于37℃的水浴鍋中解凍溶解，然后放入到新制備的 5mLLB液體培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化鈉)中在37℃、220r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)12h。將培養(yǎng)培養(yǎng)12h的菌液采用細菌平板涂布的方法，接種到LB固體培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化鈉、1.2%瓊脂糖)中，在恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)12h，培養(yǎng)后的細菌放入到4℃冰箱保存待用。

1.2 試驗方法

將上述鰻弧菌、溶藻弧菌和河流弧菌的固體培養(yǎng)基取出后放置于潔凈工作臺中，嚴格按照無菌操作的要求，分別挑取鰻弧菌、溶藻弧菌和河流弧菌的單個菌落放置于裝有5mL新配制的LB 液體培養(yǎng)基的EP管中，在37℃、220r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)6h后，以LB 液體培養(yǎng)基作為基準，利用紫外分光光度計測定3種致病弧菌菌體懸浮培養(yǎng)液的D600nm值。每間隔10min測定1次，待D600nm達到1.0時，停止培養(yǎng)。再將D600nm達到1.0的3種弧菌培養(yǎng)液分別取出100μL，按照1∶500的比例加入到裝有50mL新配制的LB液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中進行擴大培養(yǎng)，每種弧菌擴大培養(yǎng)3組。

利用配制的LB液體培養(yǎng)基作為參照，測定每種弧菌在不同培養(yǎng)時間段的D600nm值，取其平均值并記錄數(shù)據(jù)。同時分別取對應(yīng)時間段的弧菌培養(yǎng)液1mL于已稱其重量的EP管中，利用高速離心機12000r/min離心1min，使弧菌菌體沉淀于EP管底部，用移液槍盡可能取盡上清LB液體，稱量并計算對應(yīng)時間段菌體重量，取其平均值并記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鰻弧菌的生長速度

圖1A為鰻弧菌菌液在不同培養(yǎng)時間的光密度D600nm，圖1B為每毫升鰻弧菌菌液在不同培養(yǎng)時間的菌體重量。由圖1可知，鰻弧菌在LB 液體培養(yǎng)基中37℃、220r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)，5.75h后D600nm為1.046，其在0～5.5h之間生長速度不斷加快，而5.5～5.75h之間生長速度減慢。

圖1 不同培養(yǎng)時間的鰻弧菌菌液D600nm值(A)和菌體重量(B)

2.2 溶藻弧菌的生長速度

圖2A為溶藻弧菌菌液在不同培養(yǎng)時間的光密度D600nm，圖2B為每毫升溶藻弧菌菌液在不同培養(yǎng)時間的菌體重量。由圖2可知，溶藻弧菌在LB 液體培養(yǎng)基中在37℃、220r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)，4.5h后D600nm為1.064，其在0～4.25h之間生長速度不斷加快，在4.25～4.5h之間生長速度有放緩的趨勢。

圖2 不同培養(yǎng)時間的溶藻弧菌菌液D600nm值(A)和菌體重量(B)

2.3 河流弧菌生長速度結(jié)果

圖3A為河流弧菌菌液在不同培養(yǎng)時間的光密度D600nm，圖3B為每毫升河流弧菌菌液在不同培養(yǎng)時間的菌體重量。由圖3可知，河流弧菌在LB液體培養(yǎng)基中在37℃、220r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)，3.75h后D600nm為1.071，其在0～3.5h之間生長速度不斷加快，在3.5～3.75h之間生長速度稍有減慢。

圖3 不同培養(yǎng)時間的河流弧菌菌液D600nm值(A)和菌體重量(B)

3 討論與小結(jié)

細菌最常見的生長繁殖方式是細胞壁沿著橫向開始分裂開而形成2個子代細菌，結(jié)合細菌在培養(yǎng)基中生長的特點將細菌的生長分為4個主要階段：適應(yīng)階段、對數(shù)生長階段、穩(wěn)定階段和衰亡階段[17]。適應(yīng)階段主要是細菌對環(huán)境的適應(yīng)，數(shù)目基本保持不變，僅僅是細菌個體增大，極少細菌出現(xiàn)分裂；對數(shù)生長階段細菌大量生長繁殖，呈對數(shù)增長；平衡階段是受環(huán)境的限制，細菌數(shù)目維持在穩(wěn)定狀態(tài)；衰亡階段細菌開始出現(xiàn)大量死亡，活菌數(shù)減少。通過細菌生長速度的研究，可以了解細菌的生長規(guī)律，對科研、生產(chǎn)等具有重要意義。

本研究比較了3種常見的水產(chǎn)致病弧菌(鰻弧菌、溶藻弧菌和河流弧菌)在LB培養(yǎng)基中的生長規(guī)律，間接反應(yīng)其在水生動物中的致病能力。朱蘇琴[18]在研究河流細菌突變株生長曲線時，利用1∶100的比例擴大培養(yǎng)，在條件為28℃、120r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)了23h，根據(jù)酶標儀測得的D550nm為0.7，并繪制出河流弧菌突變株的生長曲線。與本研究相比，雖然培養(yǎng)條件不同，但是細菌在波長為600 nm時有最大吸收峰，同時弧菌最佳培養(yǎng)溫度在35℃附近[19,20]，因此本研究測定的鰻弧菌在LB液體培養(yǎng)基中37℃、220r/min下培養(yǎng)，5.75h后D600nm為1.046，在0～5.5h生長速度加快，5.5～5.75h生長速度減慢的結(jié)果更符合細菌生長的一般規(guī)律。程海燕[21]將3種溶藻弧菌突變株(ΔtoxR、ΔacfA、C-acfA)分別接種到TSB培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)前原菌液D600nm為0.5，然后按照1∶1的比例，在28℃、200r/min的條件下培養(yǎng)，在4～5h之間溶藻弧菌的D600nm達到1.0。本研究在LB液體培養(yǎng)基中37℃、220r/min下培養(yǎng)，4.5h后其菌液的D600nm為1.064，0～4.25h生長速度加快，4.25～4.5h生長速度減慢，但減慢趨勢不明顯，兩者結(jié)果基本一致，但溫度和擴大培養(yǎng)的倍數(shù)不同，有關(guān)溫度、培養(yǎng)基種類和擴大培養(yǎng)倍數(shù)對結(jié)果的影響需要進一步探討。有關(guān)鰻弧菌生長速度的研究較少，因此本研究發(fā)現(xiàn)其在LB液體培養(yǎng)基中37℃、220r/min下培養(yǎng)，5.75 h后D600nm為1.046，0～5.5h生長速度加快，5.5～5.75h生長速度減慢。測定這3種致病性弧菌的生長速度，在生產(chǎn)實踐中具有重要的意義，可以間接反映致病性弧菌在侵襲動物科學(xué)宿主到爆發(fā)疾病，再到疾病傳播的速度，可讓生產(chǎn)者及時采取預(yù)防和治療措施，減少經(jīng)濟損失。比較3種致病性弧菌的生長速度可以發(fā)現(xiàn)，在37℃的條件下，河流弧菌生長速度最快，因此河流弧菌在進入機體后能夠快速地達到對數(shù)生長期，大量繁殖并產(chǎn)生細菌毒素，對魚體能夠造成快速損傷，所以當生產(chǎn)者發(fā)現(xiàn)河流弧菌感染時，應(yīng)該盡早采取緊急治療措施，減少經(jīng)濟損失；鰻弧菌生長速度最慢，而溶藻弧菌生長速度介于河流弧菌和鰻弧菌之間，說明溶藻弧菌和鰻弧菌侵入機體時，致病速度相對較慢，可以采取抗生素治療的同時利用中草藥制劑增加魚體的抗病能力達到治愈的目的。但是疾病的發(fā)生與傳播還受宿主生理條件、侵入的數(shù)量和種類、環(huán)境條件等因素影響，所以生產(chǎn)實踐種應(yīng)視具體情況采取適當預(yù)防措施。

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[編輯] 余文斌

2016-09-29

濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心(長江大學(xué))開放課題(KF201608)。

羅凱(1992-)，男，碩士生，研究方向為名特水產(chǎn)養(yǎng)殖。通信作者：郜衛(wèi)華，35507883@qq.com。

S917.1

A

1673-1409(2017)02-0025-04

[引著格式]羅凱，艾克特，夏理海，等.3種水產(chǎn)致病弧菌的生長速度對比研究[J].長江大學(xué)學(xué)報(自科版)，2017，14(2)：25～28.