劉玲 翁澤斌 王恒 朱星宇 陳志鵬 吳麗

[摘要]研究青娥丸方中3種有效成分京尼平苷酸、補骨脂素、異補骨脂素在大鼠體內的藥代動力學過程與其抗骨質疏松作用的相關性。該實驗通過大鼠灌胃給藥青娥丸生品與鹽炙品后，選取不同時間點進行眼眶取血，采用UHPLCMS/MS測定大鼠血漿中京尼平苷酸、補骨脂素和異補骨脂素的藥物濃度，繪制藥時曲線；以成骨細胞的增殖率為藥效學指標，采用MTT法測定不同時間點含藥血清作用于成骨細胞后的增殖率，繪制時效曲線。比較時效曲線和藥時曲線可以發(fā)現(xiàn)，在成骨細胞的增殖率達到峰值時，京尼平苷酸和補骨脂素的血藥濃度也在峰值附近，表明兩者具有較好的相關性。而異補骨脂素的血藥濃度峰值相對于藥效峰值具有一定的滯后性。將青娥丸生品及鹽炙品各成分的時效曲線與藥時曲線進行擬合，進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)鹽炙品組各成分的相關性略高于生品組。上述實驗結果表明，青娥丸中京尼平苷酸、補骨脂素的藥時曲線和時效曲線具有良好的相關性，且與生品相比，青娥丸鹽炙品中兩者的相關性更高。

[關鍵詞]青娥丸； 藥動學； 藥效學； 京尼平苷酸； 補骨脂素； 異補骨脂素

Analysis on pharmacokineticspharmacodynamics correlation of

effective ingredients of Qing′e wan

LIU Ling1，2， WENG Zebin3， WANG Heng1，2， ZHU Xingyu1，2， CHEN Zhipeng1，2， WU Li1，2， LI Weidong1，2*

（1 Jiangsu Key Laboratory of Chinese Medicine Processing， Nanjing University of Chinese Medicine， Engineering Center

for Standardization of Traditional Chinese Medicine Processing under State Ministry of Education， Nanjing 210046， China；

2 Pharmacy College of Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210046， China；

3 China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China）

[Abstract]To study the pharmacokinetics of three active ingredients in Qing′e wan， namely geniposidic acid， psoralen and isopsoralen， in rats， in order to investigate their correlation in the antiosteoporotic effect The rats were taken blood from their eye sockets at different time points after being orally administered with raw and saltprocessed Qing′e wan Geniposidic acid， psoralen and isopsoralen in rats plasma were determined by means of UHPLCMS/MS to draw the concentrationtime curve The proliferation rate of osteoblasts was taken as the pharmacodynamic index， and determined by MTT method to draw effecttime curve In comparison between the effecttime curve and the concentrationtime curve， the blood concentrations of geniposidic acid and psoralen were close to the peak when the cell proliferation rate reached its peak， indicating a good correlation between them The peak blood concentration of isopsoralen was slightly lagging behind the peak of efficacy According to the correlation analysis after fitting the effecttime curve and the concentrationtime curve， saltprocessed Qing′e wan had a better correlation than the raw one The above experimental results showed that the effecttime curve and the concentrationtime curve of geniposidic acid and psoralen had a good correlation， and the correlation of saltprocessed Qing′e wan was better than the raw one

[Key words]Qing′e wan； pharmacokinetics； pharmacodynamics； geniposidic acid； psoralen； isopsoralen

doi：10.4268/cjcmm20162323

青娥丸首載于宋代《太平惠民和劑局方》，并收載于2015年版《中國藥典》，主要用于治療腎虛腰痛，起坐不利，膝軟乏力。處方組成為鹽杜仲、鹽補骨脂、核桃仁（炒）以及大蒜[1]。

方中君藥杜仲能促進成骨細胞增殖，抑制破骨細胞活性[2]。研究表明，杜仲中京尼平苷酸、紫云英苷、黃芩苷、咖啡酸4種成分有促進成骨細胞分化成熟的能力，是杜仲抗骨質疏松的活性成分。其中京尼平苷酸還能抑制成骨細胞轉化為破骨細胞[3]。臣藥補骨脂能刺激成骨細胞增殖，減少骨量丟失[4]；還有很強的雌激素樣作用[5]。補骨脂中主要活性成分為香豆素類，包括補骨脂素和異補骨脂素等。補骨脂素具有植物雌激素作用[6]，能促進成骨細胞分化成熟[7]，抑制破骨細胞分化成熟[8]；異補骨脂素也具有雌激素樣作用[9]，可選擇性作用于雌激素受體，促進成骨細胞分化成熟[10]，還能與鋅聯(lián)合應用協(xié)同增效，促進成骨細胞相關轉錄因子的表達[11]，是補骨脂治療骨質疏松的活性成分?；诜街卸胖?、補骨脂藥材的主要功效，結合兩者主要化學成分的藥理作用，復方青娥丸目前在臨床上主要用于治療骨質疏松癥[1213]。實驗采用UHPLCMS/MS監(jiān)測青娥丸方中有效成分的藥動學變化，以青娥丸生品與鹽品含藥血清對成骨細胞的增殖率為效應指標，評價青娥丸有效成分與其抗骨質疏松作用的相關性，進一步探討青娥丸抗骨質疏松的藥效物質基礎。

1材料

11儀器與試劑

液相色譜輸液泵（LC10ATvp泵，日本島津公司）；5500 MS系統(tǒng)三重四級桿質譜儀（美國ABSCIEX公司）；BEHC18分析柱（21 mm×100 mm， 17 μm，Water公司）；C18保護柱（21 mm×10 mm， 17 μm，Water公司）。

京尼平苷酸（純度>990%，四川維克奇生物科技有限公司）；大黃酸（純度>990%，中國食品藥品檢定研究院）；補骨脂素（純度>990%，上海友思生物技術有限公司）；異補骨脂素（純度>990%，上海友思生物技術有限公司）；濱蒿內酯（純度>990%，上海友思生物技術有限公司）；甲醇（色譜純，加拿大Calepure公司）；甲酸（化學純，德國Merk公司）；去離子水為實驗室自制。

青娥丸生品：杜仲、補骨脂、核桃仁、大蒜，以上4味按2015年版《中國藥典》制丸；青娥丸鹽炙品：將杜仲、補骨脂生品按藥典標準鹽炙后，加核桃仁、大蒜按藥典標準制丸。

12實驗動物

SpragueDawley大鼠，雌性各半，體重180～220 g（南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心），動物合格證號SCXK（滬）20080016。

13細胞培養(yǎng)

絕經后婦女松質骨組織由江蘇省中醫(yī)院骨科提供，無菌條件取出絕經后婦女股骨松質骨組織，PBS沖洗3遍。剪成1 mm×1 mm×1 mm的骨片。放入培養(yǎng)皿（瓶）中，加入αMEM培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗3遍，加入胰酶消化1 h，血清終止消化。加入含10%胎牛血清的αMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每48 h更換培養(yǎng)液。7～14 d后細胞開始貼壁。細胞匯合鋪滿細胞瓶后，使用胰蛋白酶消化，1∶3傳代培養(yǎng)，實驗采用P3代細胞。

2方法

21青娥丸生品及鹽炙品的制備

取青娥丸生品和鹽炙品各10 g，置于圓底燒瓶內，精密加入超純水100 mL，加熱回流提取40 min，過濾，減壓濃縮至01 g·mL-1，備用。

22供試品溶液中京尼平苷酸含量的測定

取21項制備的樣品，分別精密吸取青娥丸生品和鹽炙品供試品溶液各1 mL，用純水稀釋10倍，過濾（045 μm微孔濾膜），取續(xù)濾液作為供試品溶液。采用上述色譜條件，測定供試品溶液中京尼平苷酸、補骨脂素和異補骨脂素的含量，其中生品中京尼平苷酸、補骨脂素、異補骨脂素的質量分數(shù)分別為2126，2148，1563 mg·g-1；鹽炙品中京尼平苷酸、補骨脂素、異補骨脂素的質量分數(shù)分別為3147，2159，2053 mg·g-1。

23藥代動力學試驗

231UHPLCMS/MS測定條件液相條件：流動相01%甲酸水溶液（A）乙腈（B），梯度洗脫，0～2 min，5%～50%B，2～5 min，50%～95%B，5～6 min，95%B，6～61min，95%～5%B，流速03 mL·min-1；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。

負離子模式質譜條件：離子源為ESI源；CUR：35 psi（1 psi=6895 kPa）；CAD：8 V；IS：5 500 N；TEM：550 ℃；GS1：55 psi；GS2：55 psi；CE：-181 V；DP：-550 V；EP：-140 V；CXP：-90 V。用于定量分析的離子分別為[M+H]+m/z 3729/1229（京尼平苷酸）和m/z 2821/1830 （大黃酸）。

正離子模式質譜條件：離子源為ESI源；CUR：35 psi；CAD：8 V；IS：5 500 N；TEM：600 ℃；GS1：50 psi；GS2：60 psi；CE：3022 V；DP：8613 V；EP：653 V；CXP：969 V。用于定量分析的離子分別為[M+H]+m/z 1872/1310（補骨脂和異補骨脂素）和m/z 2072/1511（濱蒿內酯）。

232血清樣品的采集及處理SD大鼠12只，隨機分為生品組和鹽炙品組，每組6只，實驗前12 h禁食不禁水，實驗期間自由飲水，實驗12 h后進水。按照青娥丸水提物001 mL·g-1的灌胃劑量給藥。分別于給藥后010，025，050，075，100，150，250，400，600，1000，1200，2400 h經大鼠眼球后靜脈叢采血約05 mL，置肝素化試管中，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清，-20 ℃冷凍保存，備用。

取大鼠血清樣品100 μL置于10 mL具塞離心試管中，加入內標液10 μL，搖振，再加入300 μL乙腈，渦旋混合3 min，4 000 r·min-1離心5 min，上清液轉移至小EP管中，12 000 r·min-1高速離心3 min，取上清液5 μL用于UHPLCMS/MS分析。

24藥效學實驗

選擇對數(shù)生長期中生長旺盛的人成骨細胞，按細胞密度為8×103個/孔，接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h，棄去原培養(yǎng)液，換無血清培養(yǎng)液，饑餓細胞24 h，棄去無血清培養(yǎng)液，向96孔板中加入20%濃度的各時間點含藥血清培養(yǎng)液，以含10%胎牛血清的培養(yǎng)液為空白對照，每藥重復6個孔，每孔100 μL，分別培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)液，加入5 g·L-1 的MTT溶液50 μL，37 ℃培養(yǎng)4 h后，吸凈上清液，每孔加入150 μL DMSO，在搖床上振搖10 min使結晶充分溶解，用酶標儀在490 nm處測定吸光值。細胞增殖率=（A樣品-A空白）/（A對照-A空白）×100%。

25統(tǒng)計學處理

實驗中所有項目檢測數(shù)據(jù)均以±s表示，采用Excel軟件和藥動學計算程序DAS 20處理，組間比較采用t檢驗。

3結果

31藥動學結果

青娥丸生品及鹽炙品的水提物灌胃給藥后，采用已建立的UHPLCMS/MS分析方法，測定給藥后不同時間點的大鼠血漿樣品中京尼平苷酸、補骨脂素和異補骨脂素的濃度，結果見圖1。動力學參數(shù)通過DAS 20軟件進行處理，京尼平苷酸在大鼠體內的主要藥動學參數(shù)見表1。從圖1可知，灌胃給藥青娥丸生品和鹽炙品后京尼平苷酸、補骨脂素和異補骨脂素的藥時濃度曲線差異比較明顯，表明鹽炙對青娥丸中成分體內吸收影響較大。從表1的藥代動力學參數(shù)可見，青娥丸鹽炙品組京尼平苷酸的Cmax，補骨脂素MRT和Tmax，異補骨脂素的AUC，MRT，Tmax與生品組相比具有顯著性差異，其他參數(shù)也有不同程度的升高，可能與鹽炙增加了有效成分的溶出有關。

32藥效學結果

青娥丸生品及鹽炙品的水提物灌胃給藥后，不同時間點的血清對成骨細胞具有一定的促增殖作用，其時間效應曲線見圖2。

33藥動學與藥效學相關性分析

采用 DAS 20 軟件，對京尼平苷酸、補骨脂素、異補骨脂素血藥濃度（X）與成骨細胞增殖率（Y） 進行量效關系分析，用散點相關法，X取對數(shù)進行作圖，見圖3，以Y=a+b·lnX數(shù)學模型進行擬合，結果見表2。

由圖3可以看出，京尼平苷酸、補骨脂素和異補骨脂素的血藥濃度與青娥丸生品及鹽炙品含藥血清促成骨細胞增殖能力之間具有良好的相關性，當京尼平苷酸血藥濃度達到最大值時，其成骨細胞增殖率也達到最大值；當成骨細胞增殖率達到最大值時，補骨脂素和異補骨脂素的血藥濃度也接近最大值，顯示具有良好的相關性。

4討論

根據(jù)受體動力學原理，藥物進入機體后，先與體內特殊部位如受體相結合才能產生效應，藥效強度與藥物在靶部位的濃度相關。由于靶部位的藥物濃度難以直接測定，一般通過檢測血液中藥物的濃度間接反映靶部位藥物濃度，并以其預測藥效強度，指導臨床用藥。但有時靶部位藥物濃度與血藥濃度并不一致，藥效的消長規(guī)律也不一定與血藥濃度變化過程完全同步。因此，研究藥物動力學和藥效動力學的相互關系，建立兩者的相關性模型，對臨床合理用藥以及研究藥物體內過程和作用機制具有重要意義。

現(xiàn)代研究表明，杜仲鹽炙后能促進京尼平苷酸的吸收，增加其生物利用度[14]。補骨脂中補骨脂素與異補骨脂素在大鼠血液中的吸收與消除過程都較慢[15]，鹽炙后能促進補骨脂素和異補骨脂素的體內吸收[16]。現(xiàn)有的研究大多關注于單味藥材中單體化合物的藥效學或藥動學，未將兩者結合，也鮮有研究中藥復方活性成分PKPD的相關性。而中醫(yī)藥治療疾病，基本是將中藥配伍成復方用于臨床，或制成不同劑型后進入體內起效，所以對于中藥復方的研究尤為重要。本實驗以復方青娥丸為研究對象，將京尼平苷酸、補骨脂素和異補骨脂素的藥動學與其促進成骨細胞增殖作用的藥效學結果相結合，探討3種成分藥動學與抗骨質疏松作用藥效學的相關性，更能闡明復方青娥丸抗骨質疏松作用的藥效物質基礎，從而更好地指導臨床用藥，該研究模式將在中藥復方的研究中起到一定的示范作用。

實驗結果發(fā)現(xiàn)，灌胃給予生品及鹽炙品青娥丸水提液后，大鼠含藥血清對成骨細胞的增殖均有促進作用，且鹽炙品的效果較好。比較時間效應曲線和血藥濃度時間曲線可以發(fā)現(xiàn)，在細胞增殖率達到峰值時，京尼平苷酸和補骨脂素的血藥濃度也在峰值附近，兩者具有較好的相關性。異補骨脂素的血藥濃度峰值相對藥效峰值具有一定的滯后性。比較生品及鹽炙品各成分的藥動藥效相關性發(fā)現(xiàn)，鹽炙品組各成分的相關性略高于生品組（異補骨脂素除外）。揭示鹽炙后青娥丸中京尼平苷酸和補骨脂素與藥效的相關性更高。

由于中藥藥效是多種成分相互協(xié)同作用的結果，故以中藥某一單體成分進行藥動學和藥效學研究，并不能完全反映中藥復方的真實情況。后續(xù)實驗中，應建立中藥多成分、多靶點的藥動學和藥效學研究，并建立合適的數(shù)學模型，更好的為臨床用藥提供參考。

[參考文獻]

[1]中國藥典 一部[S]2015：1024

[2]王婷，張金超，楊夢甦，等 抗骨質疏松癥的單味中藥及藥用植物研究進展[J] 中國中藥雜志，2006，31（9）：718

[3]蘭波 杜仲抗骨質疏松藥效物質基礎及機制研究[D] 貴陽：貴陽醫(yī)學院，2015

[4]Zhang R，Liu Z G，Li C，et al DuZhong（Eucommia ulmoides Oliv）cortex extract prevent OVXinduced osteoporosis in rats[J] Bone，2009，45（3）：553

[5]Lim S H，Ha T Y，Ahn J，et al Estrogenic zctivities of Psoralea corylifolia Lseed extracts and main constituents[J] Phytomedicine，2011，18（5）：425

[6]趙丕文，牛建昭，王繼峰，等 補骨脂素的植物雌激素作用及其機制探討[J] 中國中藥雜志，2008，33（1）：59

[7]翟遠坤，潘亞磊，牛銀波，等 補骨脂素與異補骨脂素對乳鼠顱骨成骨細胞分化成熟影響的比較研究[J] 中國藥理學通報，2012，28（3）：355

[8]王建華，郭敏，鄭麗，等 補骨脂素干預大鼠成骨細胞骨保護素/核因子κB受體激活因子配體mRNA的表達[J] 中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（37）：6927

[9]趙丕文，牛建昭，王繼峰，等 異補骨脂素的植物雌激素作用及其機制的探討[J] 中國藥理學通報，2009，25（9）：1193

[10]明磊國，葛寶豐，陳克明，等 異補骨脂素對體外培養(yǎng)骨髓間充質干細胞增殖與成骨性分化的研究[J] 中國中藥雜志，2011，36（15）：2124

[11]王建華，張軍芳，呂萍，等 異補骨脂素加鋅對大鼠成骨細胞相關細胞因子表達影響的實驗研究[J] 天然產物研究與開發(fā)，2010，22（3）：403

[12]Xu X J，Shen L，Yang Y P，et al Serum sclerostin levels associated with lumbar spine bone mineral density and bone turnover markers in patients with postmenopausal osteoporosis[J] Chin Med J，2013，126（13）：2480

[13]翁澤斌，顏翠萍，張志杰，等 不同炮制品入藥的青娥丸含藥血清對人成骨細胞增殖、分化及礦化的影響[J] 中國實驗方劑學雜志，2015，21（6）：165

[14]高倩倩，翁澤斌，趙根華，等 鹽炙對杜仲中京尼平苷酸體內藥代動力學的影響[J] 南京中醫(yī)藥大學學報，2015，31（5）：453

[15]修彥鳳，施貝，唐昌娟，等 炮制對補骨脂在大鼠體內藥動學特性的影響[C] 北京：中華中醫(yī)藥學會中藥炮制分會2011年學術年會，2011

[16]唐昌娟，施貝，修彥鳳，等 二神湯中補骨脂素、異補骨脂素的藥動學研究[J] 上海中醫(yī)藥雜志，2011（7）：72

[責任編輯曹陽陽]