楊玉靜，聶瑞強，謝建山,2，范瑞文，許冬梅，董常生

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷 030801；2山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，太原 030001）

小鼠黑素細胞中過表達Oct-1對毛色主效基因的影響

楊玉靜1，聶瑞強1，謝建山1,2，范瑞文1，許冬梅1，董常生1

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷 030801；2山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，太原 030001）

【目的】克隆小鼠八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1（octamer-binding transcription factor 1，Oct-1）基因序列，探討八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1在小鼠黑素細胞中過表達對毛色主效基因表達的影響及在毛色形成中的作用?！痉椒ā渴褂脤嶒炇覂龃娴牡?代小鼠黑素細胞，通過普通PCR方法用引物以小鼠黑素細胞cDNA為模板克隆Oct-1基因cDNA序列， 構(gòu)建小鼠Oct-1克隆載體和真核表達載體；通過KEGG PATHWAY、NCBI、Transfec等軟件對獲得的序列進行生物信息學(xué)分析；在細胞水平通過細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)過量表達小鼠Oct-1；轉(zhuǎn)染后使用熒光顯微鏡觀察細胞轉(zhuǎn)染效率，采用分光光度計對小鼠黑素細胞中黑色素含量進行測定，并進行Real-time PCR實驗檢測轉(zhuǎn)染后黑素細胞中毛色主效基因在mRNA水平表達量的變化，Western blot實驗檢測轉(zhuǎn)染后細胞中MITF、TYR、TYRP-1和TYRP-2蛋白水平的變化?！窘Y(jié)果】經(jīng)測序和拼接最終獲得長度為2 313 bp的小鼠Oct-1基因的cDNA 序列；成功構(gòu)建真核表達載體， 載體上連有小鼠黑素細胞特異性TYRP-2基因啟動子和一個啟動報告基因綠色熒光蛋白；通過KEGG PATHWAY 分析獲得與毛色形成有關(guān)的34個候選基因，NCBI查找出34各個基因的啟動子，由Transfec啟動子分析軟件找出Oct-1可以調(diào)節(jié)的毛色主效基因；細胞轉(zhuǎn)染后，在熒光顯微鏡下可觀察到黑素細胞帶有綠色熒光說明轉(zhuǎn)染效率明顯；分光光度計檢測顯示，轉(zhuǎn)染后小鼠黑素細胞中黑色素含量減少（P＜0.05）；熒光定量檢測結(jié)果顯示，小鼠黑素細胞中Oct-1 mRNA表達量顯著增加（P＜0.001），表明小鼠Oct-1轉(zhuǎn)染效率顯著，MITF mRNA顯著降低至0.70倍（P＜0.01），TCF mRNA顯著降低至0.66倍（P＜0.01），Ras、Frizzled、ERK2和TYRP-2 mRNA的表達未見變化，TYR mRNA顯著增加至7.69倍（P＜0.01），TYRP-1 mRNA升高至3.11倍（P＜0.01），αMSH mRNA顯著增加至18.49倍（P＜0.001），AC mRNA顯著增加至6.88倍（P＜0.01），c-kit mRNA顯著增加至18.75倍（P＜0.001），ET1 mRNA增加至1.50倍（P＜0.05），ETB-R mRNA顯著增加至13.47倍（P＜0.001），CAM mRNA增加至1.46倍（P＜0.05）；蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，小鼠黑素細胞中Oct-1轉(zhuǎn)染組MITF蛋白顯著降低至0.67倍（P＜0.01），TYR蛋白增加至1.16倍（P＜0.05），TYRP-1蛋白升高至1.15倍（P＜0.05），TYRP-2蛋白未見變化?！窘Y(jié)論】通過PCR和克隆技術(shù)及核酸測序技術(shù)獲得了小鼠Oct-1基因全長2 313 bp的CDS區(qū)，經(jīng)生物信息學(xué)分析找出Oct-1作用的毛色主效基因，過表達Oct-1后使黑素細胞中MITF和TCF的表達降低，TYR、TYRP-1、αMSH、AC、c-kit、ET1、ETB-R和CAM的表達增加。證實Oct-1可調(diào)節(jié)毛色主效基因的表達，參與黑色素合成的調(diào)節(jié)，改變毛色。

八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1；黑色素；毛色主效基因；MITF；TYR

0 引言

【研究意義】動物毛色由毛發(fā)中沉著的黑色素含量及其種類決定，不同顏色的被毛是當(dāng)今綠色紡織業(yè)的主要原料，黑色素在黑色素細胞中形成，包括真黑色素和偽黑色素兩種色素成分，使被毛呈現(xiàn)黑色或金黃色[1]。在黑色素形成過程中，受諸多相關(guān)基因的調(diào)控。八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1（octamer-binding transcription factor 1，Oct-1），又稱為POU2F1，屬于POU反式作用因子家族成員，該家族成員都含有保守的功能域即POU結(jié)構(gòu)域，包含兩個螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合域，位于N端的POU特異結(jié)構(gòu)域和位于C端的POU同源異形域，通過一個相對較短的連接器連接[2]。Oct-1蛋白對DNA八聚體元件有高親和性，在組織細胞中廣泛表達[3]，參與調(diào)節(jié)多種組織特異性基因和管家基因的表達[4]。Oct-1蛋白不具有導(dǎo)肽，N端無信號肽，沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，表現(xiàn)為親水性，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要結(jié)構(gòu)元件是無規(guī)卷曲和α-螺旋。Oct-1作為一個轉(zhuǎn)錄抑制因子或作為一個轉(zhuǎn)錄激活因子取決于啟動子序列，Oct-1可以直接結(jié)合到啟動子或與其他轉(zhuǎn)錄因子互相作用結(jié)合到啟動子上調(diào)節(jié)基因的表達[5]?！厩叭搜芯窟M展】關(guān)于Oct-1主要集中在癌細胞、亞型結(jié)構(gòu)、2型糖尿病、與其他基因的相互作用及其過表達或敲除等方面的研究。癌癥生物學(xué)研究Oct-1轉(zhuǎn)錄因子的兩個相反功能顯示，轉(zhuǎn)錄因子Oct-1濃度低時IFN-γ（γ干擾素）刺激膀胱癌細胞增殖，當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子過度積累時促進IFN-γ誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡[6]。在胃癌細胞中，活化的CDC42相關(guān)激酶1（ACK1）磷酸化在細胞存活和凋亡中起重要作用的蛋白激酶B（PKB/AKT），激活A(yù)KT通路中轉(zhuǎn)錄因子Oct-1，結(jié)合靶基因蛻皮激素（ECD）的啟動子區(qū)，調(diào)控ECD的表達[7]。過表達miR-449a（microRNA 449a）可下調(diào)鈣蛋白酶6（CAPN6）和Oct-1，抑制肝腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡[8]。p38蛋白激酶（酪氨酸磷酸蛋白激酶）抑制劑可抑制Oct-1結(jié)合能力[9]。在人乳腺癌細胞（MDA-MB-231）中，Oct-1和Oct-2可結(jié)合誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）啟動子，形成一個高級復(fù)合體，使其不能結(jié)合RNA聚合酶II，導(dǎo)致iNOS轉(zhuǎn)錄不能進行[10]。在乳腺囊泡分泌上皮細胞（MECs）中，Oct-2與Oct-1形成一個異聚體，反式激活催乳激素（HP）誘發(fā)型β-酪蛋白基因表達[11]。ZHAO等研究表明Oct-1亞型的結(jié)構(gòu)改變對其結(jié)合靶基因和組織特異性基因的轉(zhuǎn)錄活性發(fā)揮重要作用，Oct-1Z亞型是Oct-1基因選擇性剪接形成，其蛋白C端較短，但仍可有效地結(jié)合到Oct-1基因結(jié)構(gòu)寡核苷酸上發(fā)揮作用，像Oct-1B亞型，可激活鼠β-酪蛋白基因啟動子活性[4]。KRYLOVA等發(fā)現(xiàn)Oct-1基因亞型Oct-1X的mRNA，在編碼過程中這個亞型mRNA截去N-末端序列，經(jīng)試驗證明其在人類組織和細胞系中廣泛表達，能激活管家基因（組蛋白H2B）和調(diào)控組織特異性基因（B29）的轉(zhuǎn)錄[12]。NG等研究2型糖尿臨床基礎(chǔ)病例中發(fā)現(xiàn)Oct-1基因的6個單核苷酸多態(tài)性，其中rs4657652，rs7532692，rs10918682和rs3767434在大部分2型糖尿病患者中發(fā)揮作用，rs3767434作用于家族性2型糖尿病患者，此外，rs10918682的G等位基因風(fēng)險導(dǎo)致胰島素治療的使用量增加[13]。VOLETI 等研究發(fā)現(xiàn)在細胞中Oct-1作為C-反應(yīng)蛋白（CRP）啟動子的轉(zhuǎn)錄抑制因子，過表達Oct-1會抑制CRP的表達[5]。在人類的干細胞中，Oct-1過表達增強細胞因子誘導(dǎo)人誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（hiNOS）蛋白表達，當(dāng)hiNOS啟動子上Oct-1結(jié)構(gòu)突變，會減少細胞因子誘導(dǎo)hiNOS啟動子的活性[14]。THUM等研究表明敲除Oct-1基因可阻止氧化低密度脂蛋白（oxLDL）介導(dǎo)的細胞色素P450（CYP）基因沉默[15]?！颈狙芯壳腥朦c】關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子Oct-1在毛色方面的研究，有報道乙醇通過減少Oct-1與Slc7a11基因啟動子的結(jié)合增加毛色基因Slc7a11的表達[16]，然而，Oct-1在毛色形成過程中是否起作用尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗通過生物信息學(xué)方法預(yù)測到毛色生成主效基因中有Oct-1的靶基因，通過黑素細胞轉(zhuǎn)染過表達Oct-1，探究Oct-1對黑色素形成過程中靶基因表達的影響，進而分析其對毛色形成的作用。

1 材料與方法

試驗于2015年6月至2015年12月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊駝生物工程實驗室完成。

1.1 主要試劑和儀器

試劑：黑素細胞培養(yǎng)基（Scien Cell）、RIPA裂解液（碧云天）、TRIZOL（Invitrogen，美國）、反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒（TaKaRa，大連）、qRT- PCR kit（TaKaRa，大連）、MITF多克隆抗鼠 IgG抗體（abcam，艾博抗上海）、TYR多克隆抗鼠 IgG抗體（abcam，艾博抗上海）、T4 DNA Ligase（TaKaRa，大連）、蛋白marker（Fermentas公司）；儀器：StepOne Fast Real time PCR System（Life technologies，美國）、高速低溫冷凍離心機（Sigma；德國）、普通PCR儀（Bio RAD，美國）、紫外凝膠成像系統(tǒng)（WV-BP330，Panasonic公司，日本）、核酸蛋白測定儀（Nanodrop-1000，Thermo，美國）。

1.2 試驗方法

1.2.1 Oct-1靶基因的預(yù)測和篩選 本研究根據(jù)KEGG PATHWAY database Melanogenesis（http://www. genome.jp/kegg/pathway.html）獲得與毛色形成有關(guān)的34個候選基因，通過NCBI查找其各個基因的啟動子，通過Transfec啟動子分析軟件找到了Oct-1對多個基因的啟動子有作用，設(shè)計本試驗方案對其是否有調(diào)節(jié)作用進行驗證。

1.2.2 內(nèi)源性O(shè)ct-1前體的克隆 使用GeneBank信息查詢系統(tǒng)檢索小鼠Oct-1 mRNA，找出CDS區(qū)的核酸序列。以cDNA為模版進行PCR擴增，產(chǎn)物電泳檢測，切下目的條帶，送公司進行測序，確定目的序列大小。小鼠Oct-1CDS區(qū)全長引物，由華大科技公司合成。Oct-1引物為F：5′-ATGAATAATCCATCAGA AACCAATAAATCATCTATGG-3′；R：5′-TCACTGTG CCTTGGAGGCAGCTGT-3′。

1.2.3 Oct-1真核表達載體的構(gòu)建 小鼠Oct-1載體的構(gòu)建方法為先用T-Vector pMD19載體試劑連接克隆載體，得到質(zhì)粒，送公司測序，確定Oct-1序列連到克隆載體上，再進行真核表達載體的構(gòu)建，將克隆載體質(zhì)粒和實驗室存有的慢病毒載體質(zhì)粒一起用相同的限制性內(nèi)切酶xbal、SalI進行雙酶切和電泳，獲得目的基因和真核表達載體的DNA片段，再用T4連接酶試劑進行連接，經(jīng)過轉(zhuǎn)化和涂板，挑菌搖菌，提出質(zhì)粒并測序，確定表達載體是否構(gòu)建成功。

1.2.4 小鼠黑色素細胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將實驗室凍存第5代小鼠黑素細胞從液氮中取出，迅速置于37℃水浴鍋中進行解凍，在水中迅速搖動，直至全部溶解，接種于加有黑素細胞培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)板上，在37℃5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在6孔板底壁長到60%—80%匯合時，通過轉(zhuǎn)染連接有小鼠黑色素細胞特異性TYRP2啟動子的GFP表達質(zhì)粒，培養(yǎng)72 h，提取總蛋白和RNA進行測定。

1.2.5 黑色素測定 將空白、空載體和轉(zhuǎn)染組的小鼠黑色素細胞收集起來，PBS沖洗2—3次后，用0.2 mol·L-1NaOH溶解黑色素細胞，進行黑色素含量的測定[17]。

1.2.6 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄合成 總RNA的提取按照Trizol試劑盒說明書進行，然后用6210A反轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成長鏈cDNA，反應(yīng)后，用核酸蛋白測定儀測定其濃度，保存后用于基因的擴增。

1.2.7 實時熒光定量PCR 通過Premier 5.0引物設(shè)計軟件，根據(jù)KEGG通路中得知Oct-1的靶基因，結(jié)合NCBI確定靶基因的序列，設(shè)計靶基因的實時熒光定量PCR擴增引物，并通過NCBI和UCSC檢測引物的特異性。引物見表1。

進行定量PCR反應(yīng)后，先判定PCR反應(yīng)的特異性，再用熒光曲線的CT值計算定量結(jié)果，相對表達量采用△△CT法計算[18]。所得數(shù)據(jù)用Microsoft Excel進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用平均值±標準誤（Means±SE）表示，每個基因通過內(nèi)參基因β-actin校正后得出不同基因數(shù)據(jù)，采用Prism軟件進行數(shù)據(jù)分析，判斷每個基因的表達是否存在差異[19]。

1.2.8 Western Blot分析 按照總蛋白提取試劑盒說明書方法提取黑色素細胞總蛋白，然后進行SDS-PAGE電泳，當(dāng)電泳將條帶分散后，切出需要的蛋白大小的膠，進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后將NC膜封閉1h（提前1 h配好封閉液），一抗4℃孵育過夜。孵育后用TBST洗膜，二抗37℃孵育1 h；二抗孵育后TBST洗膜30min，最后，在暗室曝光顯現(xiàn)目的基因蛋白條帶，得到有條帶的膠片，標記大小?；叶戎捣治鲇肣uantity one軟件進行，同時通過β-actin作為內(nèi)參，誤差校正=目的蛋白灰度值/β-actin蛋白含量灰度值，所得值用Microsoft Excel進行統(tǒng)計，通過Prism軟件進行數(shù)據(jù)分析，判斷每個基因的表達是否存在差異。

2 結(jié)果

2.1 Oct-1的生物信息學(xué)預(yù)測和篩選

通過篩選發(fā)現(xiàn)MITF、TCF、Ras、Frizzled、ERK2、TYRP-2、TYR、TYRP-1、αMSH、AC、c-kit、ET1、ETB-R和CAM可能是Oct-1調(diào)節(jié)的靶基因，并且它們是黑色素合成與毛色形成過程中的關(guān)鍵基因，其直接參與了黑色素生成的調(diào)控過程，從而影響動物毛色的形成。

表1 引物序列Table 1 Primes in this experiment

2.2 Oct-1真核表達載體構(gòu)建及測序

GeneBank中獲得小鼠目的基因Oct-1的CDS區(qū)序列，擴增出單一條帶用于構(gòu)建真核表達載體（圖1）。試驗所用慢病毒載體，連有小鼠黑素細胞特異性TYRP-2基因啟動子和一個啟動報告基因綠色熒光蛋白，載體中已有酶切位點，用限制性內(nèi)切酶XbaI和SalI切出載體，同樣用XbaI和SalI從克隆載體中切出目的條帶，進行連接反應(yīng)。成功構(gòu)建表達載體，質(zhì)粒提取，公司測序后，在NCBI進行BLAST比對測序得到的結(jié)果和已知目的基因序列，得出序列大小完全匹配，為2 313 bp。

圖1 小鼠Oct-1真核表達載體結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of over-expression vectiry Mus Oct-1

2.3 黑色素細胞的生長形態(tài)特征

小鼠黑色素細胞傳代后正常培養(yǎng)6 h，可見活細胞貼壁伸展，再過18 h呈明顯的樹突狀，生長良好。繼續(xù)培養(yǎng)4 d后，在6孔培養(yǎng)板的每孔中鋪滿底壁的60%—80%時，可進行傳代或轉(zhuǎn)染試驗（圖2）。

2.4 Oct-1在黑色素細胞系的轉(zhuǎn)染

2.4.1 黑色素細胞的轉(zhuǎn)染效率觀察 正常培養(yǎng)的小鼠色素細胞，長到對數(shù)生長期時即可進行轉(zhuǎn)染試驗，經(jīng)過多次轉(zhuǎn)染試驗的探索，得出轉(zhuǎn)染效率最高的是7.5 μgDNA/孔，最終確定該轉(zhuǎn)染DNA濃度為轉(zhuǎn)染試驗的最佳濃度（圖3）。

圖2 小鼠黑色素細胞的形態(tài)Fig. 2 Morphology of melanocytes of mice

圖3 小鼠Oct-1轉(zhuǎn)染黑色素細胞的效率Fig. 3 The efficiency of transfected melanocytes by Mus Oct-1

2.4.2實時熒光定量PCR檢測Oct-1在黑色素細胞系的轉(zhuǎn)染效率試驗設(shè)計小鼠黑色素細胞空白對照組、空載組和試驗組，當(dāng)細胞長到對數(shù)生長期進行轉(zhuǎn)染試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗組小鼠Oct-1被極顯著的提高（P＜0.001）（圖4）。

圖4 轉(zhuǎn)染小鼠Oct-1黑色素細胞Oct-1含量Fig. 4 Oct-1 mRNA levels in melanocytes transfected by the Mus Oct-1

2.4.3 轉(zhuǎn)染后黑色素含量測定 小鼠黑色素細胞中黑色素含量通過分光光度法測定，測定空白組、空載體組和轉(zhuǎn)染組，結(jié)果得出，轉(zhuǎn)染后黑色素含量降低至0.87倍（P＜0.05）（圖5）。

圖5 小鼠Oct-1轉(zhuǎn)染后黑色素細胞中黑色素mRNA水平Fig. 5 Melanin content in melanocytes transfected by the Mus Oct-1

2.4.4 轉(zhuǎn)染黑色素細胞后主效基因mRNA的檢測 通過RT-PCR的方法檢測了小鼠Oct-1過表達對主效基因mRNA表達的影響。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，與空載組相比，轉(zhuǎn)染組的MITF mRNA顯著降低至0.70倍（P＜0.01），TCF mRNA顯著降低至0.66倍（P＜0.01），Ras mRNA未見變化，F(xiàn)rizzled mRNA未見變化，ERK2 mRNA未見變化，TYRP-2 mRNA未見變化；TYR mRNA顯著增加至7.69倍（P＜0.01），TYRP-1 mRNA升高至3.11倍（P＜0.01），αMSH mRNA顯著增加至18.49倍（P＜0.001），AC mRNA顯著增加至6.88倍（P＜0.01），c-kit mRNA顯著增加至18.75倍（P＜0.001），ET1 mRNA增加至1.50倍（P＜0.05），ETB-R mRNA顯著增加至13.47倍（P＜0.001），CAM mRNA增加至1.46倍（P＜0.05），（圖6）。由此可見，過表達Oct-1能改變毛色主效基因mRNA的表達，MITF和TCF表達量顯著降低，Ras、Frizzled、ERK2和TYRP-2表達量未見變化，TYR、TYRP-1、αMSH、AC、c-kit、ET1、ETB-R和CAM表達量增加。

2.4.5 Western blot 檢測MITF、TYR、TYRP-1和TYRP-2蛋白在轉(zhuǎn)染后黑色素細胞中的表達 通過Western blot對所選主效基因進行檢測，得出蛋白條帶，經(jīng)軟件統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，與空載組相比，轉(zhuǎn)染組MITF蛋白顯著降低至0.67倍（P＜0.01），TYR蛋白升高至1.16倍（P＜0.05），TYRP-1蛋白升高至1.15倍（P＜0.05），TYRP-2蛋白沒有變化。由此得出，過表達Oct-1可以顯著減少MITF蛋白的表達，增加TYR和TYRP-1蛋白表達量，對TYRP-2蛋白表達未見影響（圖7）。

3 討論

圖6 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染小鼠Oct-1后黑色素細胞中主效基因mRNA的表達Fig. 6 Real-time PCR analysis of major genes expression in melanocytes transfected by the Mus Oct-1

圖7 Western blot 檢測轉(zhuǎn)染小鼠Oct-1后黑色素細胞中MITF、TYR、TYRP-1和TYRP-2蛋白的表達Fig. 7 Western blot analysis of MITF,TYR,TYRP-1 and TYRP-2 expression in melanocytes transfected by the Mus Oct-1

本試驗通過構(gòu)建小鼠八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子（Oct-1）過表達載體，采用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達Oct-1，對影響黑色素沉著的調(diào)節(jié)機制進行研究。試驗通過對黑色素細胞中黑色素含量進行測定，同時經(jīng)RT-PCR以及Western bolt方法對黑色素細胞中毛色相關(guān)基因的表達進行檢測。結(jié)果顯示，Oct-1的過表達可使黑素細胞中黑色素含量減少；在mRNA水平，MITF和TCF表達量顯著降低，Ras、Frizzled、ERK2和TYRP-2的表達未見變化，TYR、TYRP-1、αMSH、AC、c-kit、ET1、ETB-R和CAM表達量增加。在蛋白水平，MITF蛋白顯著降低，TYR、TYRP-1蛋白增加，TYRP-2蛋白未見變化。有報道，減少Oct-1結(jié)合到Slc7a11基因，會增加毛色基因Slc7a11的表達[16]，而Sla7a11基因可以使綿羊長出棕色/黃色的毛斑塊[20]。在毛發(fā)和黑素細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，Slc7a11基因是一個主要的褐黑色遺傳控制器，對真黑素的影響最小或沒有[1]，當(dāng)Slc7a11基因突變可使生成褐黑色素的途徑受阻，轉(zhuǎn)向真黑色素合成路徑，導(dǎo)致黑色素細胞內(nèi)真黑色素的生成量顯著增加，然而，試驗中小鼠毛色由紅、黃色變?yōu)榛疑?，顯著降低了毛發(fā)中褐黑色素含量，但是毛發(fā)中真黑色素含量沒有顯著差異[1]。此外，真/褐黑色素轉(zhuǎn)換機制主要與TYR活性有關(guān)，高活性的TYR導(dǎo)致真黑色素產(chǎn)生，對于褐黑色素的生成，是TYR活性降低造成的[21]，這也就說明了為什么Oct-1過表達后會出現(xiàn)一些主效基因表達降低，一些主效基因表達增加，還有一些基因未見變化的現(xiàn)象，Oct-1與黑色素合成通路中相關(guān)基因之間形成復(fù)雜的作用機制，本試驗結(jié)果可為進一步研究Oct-1具體調(diào)控單個主效基因提供基礎(chǔ)。在Oct-1過表達和缺失的相關(guān)報道中，胰島素通過衰減Oct-1的抑制效應(yīng)刺激碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（ChREBP）的表達，過表達Oct-1抑制內(nèi)源性ChREBP mRNA和蛋白的表達，敲除Oct-1導(dǎo)致ChREBP mRNA和蛋白表達增加[22]。Oct-1過表達，人胃癌細胞增殖率導(dǎo)致胃腺癌變[23]。相反，在T細胞中，白介素17啟動子有Oct-1結(jié)合位點， Oct-1基因缺失導(dǎo)致IL-17表達增加[24]。在頭部和頸部癌癥的研究中顯示，敲除Oct-1顯著降低同源異形盒蛋白D10（HOXD10）和同源異形盒蛋白D11（HOXD11）的表達，抑制頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）增殖[25]。在初級人類CD4 T細胞中過表達Oct-1或Oct-2顯示，Oct-1和Oct-2不能結(jié)合到HIV-1基因長末端重復(fù)序列（LTR），對HIV-1的轉(zhuǎn)錄沒有影響[26]。在小鼠胚胎成纖維細胞和人類肺腺癌A549細胞，Oct-1的缺失在細胞生長或生存培養(yǎng)中有很小的影響[27]。此外，還有其他相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠初級胰島細胞，提高環(huán)磷酸腺苷（cAMP）會減少Oct-1的含量，這導(dǎo)致增加高血糖素原和胰島素原mRNA的表達[28]。Oct-1通過O-乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）的改變調(diào)控目的基因活性[27]。Oct-1和/或Oct-2缺陷，影響與II型糖尿病和代謝綜合征有關(guān)的高遷移率族蛋白A1（HMGA1）基因的表達，從而導(dǎo)致胰島素受體基因（INSR）功能缺失，阻礙INSR信號通路[29]。Oct-1充當(dāng)細胞色素P450，家族2亞型，多肽4（CYP2D4）的活化劑，YY-1可能充當(dāng)CYP2D4的抑制劑，YY-1結(jié)合結(jié)構(gòu)的核心序列與Oct-1結(jié)合結(jié)構(gòu)部分重疊，YY-1結(jié)合到神經(jīng)表達調(diào)控元件（NERE），干擾Oct-1激活，從而調(diào)節(jié)CYP2D4基因[30]。在體外共轉(zhuǎn)染Oct-1增加立即早期癌基因BRLF1結(jié)合到各種細胞EB病毒（EBV）啟動子上，提高BRLF1的能力去激活細胞裂解基因表達，促進潛在病毒裂解。在EBV陽性B細胞和EBV陽性上皮細胞系，很低的內(nèi)源性O(shè)ct-1表達降低細胞裂解EBV基因表達水平[31]。通過本試驗可知，轉(zhuǎn)錄因子Oct-1在毛色形成中可能起到抑制的作用，然而具體的調(diào)控機制仍不清楚，由于在黑色素形成過程中存在真色素與褐黑色之間的轉(zhuǎn)化，接下來有必要從真黑色和褐黑色兩個方面分別進行深入探究。

4 結(jié)論

通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染使小鼠八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1在小鼠黑色素細胞中過表達后，黑素細胞中黑色素含量減少，MITF和TCF表達量顯著降低，Ras、Frizzled、ERK2和TYRP-2未見變化，TYR、TYRP-1、αMSH、AC、c-kit、ET1、ETB-R和CAM表達量增加，表明Oct-1可通過調(diào)控毛色主效基因表達的變化，參與調(diào)節(jié)黑色素的合成，影響毛色的變化。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

The Influences of Over-Expression of Oct-1 on Major Genes of Coat Color in Melanocytes of Mice

YANG YuJing1, NIE RuiQiang1, XIE JianShan1,2, FAN RuiWen1, XU DongMei1, DONG ChangSheng1
(1College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi;2School of Basic Medical Sciences, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001)

Oct-1; melanin; major genes of coat color; MITF; TYR

10.3864/j.issn.0578-1752.2017.04.016

2016-01-26；接受日期：2016-12-20

國家高科技研究發(fā)展計劃（“863”計劃，2013AA102506）、公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303119）、山西農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新團隊建設(shè)計劃（CXTD201201）

聯(lián)系方式：楊玉靜，E-mail：15110679040@163.com。通信作者董常生，E-mail：cs_dong@sxau.edu.cn

Abstract：【Objective】The aim of the study was to clone the octamer-binding transcription factor 1, to investigate whether over-expression of Oct-1 regulated the major genes of coat color in melanocytes of mouse at the transcriptional levels and to explore its influence on the formation of melanin. 【Method】 The CDS region in Oct-1 gene were cloned from melanocytes of mouse by primers and PCR to build a mouse Oct-1 cloning vector and eukaryotic expression vector. The KEGG PATHWAY, NCBI, and Transfec softwares were adopted to analyze the biological information of the obtained sequence. Over-expression of Oct-1 was conducted in the melanocytes of the 5thgeneration mouse through the cell transfection technique and transfer efficiency was observed by fluorescence microscope. The content of melanin in melanocytes was detected by spectrophotometer. The level of major genes were detected using real-time PCR and the proteins of MITF, TYR, TYRP-1 and TYRP-2 were detected using western blot.【Result】Results showed that the 2 313 bp cDNA sequence of Oct-1 gene was obtained by sequencing and splicing. Eukaryotic expression vector was successfully constructed with specific TYRP-2 gene promoter of mouse and a startup report gene of green fluorescent protein. KEGG PATHWAY analysis obtained 34 candidate genes related with coat color, and the promoters of these 34 candidate genes were found by NCBI. The major genes of coat color regulated by Oct 1 was determined by using Transfec software. Under the fluorescence microscope, green fluorescence could be identified in melanocytes of mouse. The contents of melanin in melanocytes were reduced (P＜0.05). Real-time PCR results showed that Oct-1 mRNA was significantly increased (P＜0.001),witch indicated Oct-1 high transfection efficiency. MITF mRNA was significantly reduced to 0.70 times (P＜0.01) and TCF mRNA was significantly reduced to 0.66 times (P＜0.01). The expressions of Ras, Frizzled, ERK2 and TYRP-2 mRNA did not change. TYR mRNA was significantly increased to 7.69 times (P＜0.01), TYRP-1 mRNA was significantly increased to 3.11 times (P＜0.01), αMSH mRNA was significantly increased to 18.49 times (P＜0.001), AC mRNA was significantly increased to 6.88 times (P＜0.01), c-kit mRNA was significantly increased to 18.75 times (P＜0.001), ET1 mRNA was increased to 1.50 times (P＜0.05), ETB-R mRNA was significantly increased to 13.47 times (P＜0.001), and CAM mRNA was increased to 1.46 times (P＜0.05). Western blot results showed that MITF protein was significantly reduced to 0.67 times (P＜0.01), TYR protein was increased to 1.16 times (P＜0.05), TYRP-1 protein was increased to 1.15 times (P＜0.05) and TYRP-2 protein did not change. 【Conclusion】 The 2 313 bp length CDS region of mouse Oct-1 gene was got by PCR, TA cloning and nucleic acid sequencing technology. Major genes of coat color regulated by Oct 1 was determined by bioinformatics analysis. Results of the study suggested that after over-expression of Oct-1, the expression of MITF and TCF was reduced, while that of TYR, TYRP-1, αMSH, AC, c-kit, ET1, ETB-R and CAM was increased. Therefore, the Oct-1 may mediate the alteration of coat color through regulating genes involved in the formation process of coat color.