可用于血清游離銅快速檢測(cè)的特異性識(shí)別元件

熊亞敏，黃沛力

首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100069

銅是生命體必需的微量元素之一，廣泛分布于生物組織中，其可作為輔酶因子參與生命活動(dòng)，也可以參與紅細(xì)胞的形成，同時(shí)內(nèi)環(huán)境中銅離子的穩(wěn)定亦是維持機(jī)體健康的前提。隨著銅在制造業(yè)、化工及藥物合成等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，人們通過環(huán)境暴露、職業(yè)暴露以及醫(yī)源性暴露等接觸銅的機(jī)會(huì)越來越多，生物體攝入過量的銅后產(chǎn)生的大量自由基，可對(duì)造成機(jī)體氧化損傷[1-2]。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(EPA)中規(guī)定飲用水中Cu2+的限值為1.3 mg·L-1，我國(guó)《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB5749—2006)中規(guī)定飲用水中Cu2+的限值為1.0 mg·L-1。銅進(jìn)入血液后先與白蛋白松散結(jié)合，90%～98%的銅被運(yùn)送至肝臟內(nèi)與2球蛋白牢固結(jié)合形成銅藍(lán)蛋白，再釋放到血液中。根據(jù)結(jié)合銅原子數(shù)的不同，銅藍(lán)蛋白可分為飽和銅藍(lán)蛋白和不飽和銅藍(lán)蛋白。在機(jī)體中銅藍(lán)蛋白合成障礙時(shí)會(huì)導(dǎo)致血液中游離銅含量增加，這些過多的游離銅在肝、腎、腦等器官沉積，從而造成器官功能障礙[3]。

同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，血清游離銅(包括血清中的自由銅離子以及與白蛋白、氨基酸松散結(jié)合的銅離子)過量與肝豆?fàn)詈俗冃?Wilson disease，WD)、阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD)、帕金森病(Parkinson's disease，PD)、血管性癡呆(vascular dementia，VD)等疾病有關(guān)[4-8]。以血清游離銅作為銅代謝障礙相關(guān)疾病臨床診斷生物標(biāo)志物及治療過程評(píng)價(jià)指標(biāo)的研究受到了廣泛關(guān)注[9-10]。臨床上，血清游離銅含量一般通過計(jì)算血清總銅與銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅的差值得到，計(jì)算公式為：游離銅=血清總銅(mg·L-1)-0.3×銅藍(lán)蛋白(mg·L-1)/100，或游離銅=血清總銅(mol·L-1) -0.049×銅藍(lán)蛋白(mg·L-1)[11-12]。然而該計(jì)算方式在超過20%的病人中得到陰性結(jié)果，可能的原因在于采用免疫沉淀法測(cè)得的銅藍(lán)蛋白包括不飽和銅藍(lán)蛋白，使銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅部分結(jié)果偏高[13]。另外，血清游離銅還可通過采用EDTA等螯合劑將游離銅從白蛋白等蛋白質(zhì)上剝離，經(jīng)超濾后通過電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)、原子吸收光譜法(AAS)、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)等方法進(jìn)行測(cè)定[14-16]，這些檢測(cè)方法雖然結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，但所需儀器昂貴，操作難度大，樣品前處理復(fù)雜，且對(duì)操作人員要求高，在基層醫(yī)院難以普及。因此，發(fā)展快速、靈敏、簡(jiǎn)便的高選擇性血清游離銅檢測(cè)方法具有重要的臨床意義。目前的研究表明，基于銅離子特異性識(shí)別元件構(gòu)建的熒光或電化學(xué)檢測(cè)方法的出現(xiàn)，使得游離銅的快速靈敏檢測(cè)成為可能。由于構(gòu)建快速檢測(cè)銅離子方法的關(guān)鍵在于如何選擇和設(shè)計(jì)能對(duì)銅離子特異性響應(yīng)的識(shí)別元件，因此本文對(duì)常用的銅離子特異性識(shí)別元件進(jìn)行了歸類與概述。

1 有機(jī)小分子(Organic small molecules)

有機(jī)小分子對(duì)Cu2+的識(shí)別主要是依賴于Cu2+與芳香族化合物形成螯合物后發(fā)生的熒光淬滅現(xiàn)象。Kim等[17]利用水溶性有機(jī)化合物4,5-二羥基-1,3-苯二磺酸在Cu2+存在時(shí)的熒光淬滅性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了Cu2+的特異性檢測(cè)，檢測(cè)范圍為0.03～0.64 mg·L-1，其對(duì)河水中Cu2+的檢測(cè)結(jié)果與AAS和ICP-MS的檢測(cè)結(jié)果一致。Mayr等[18]將識(shí)別及信號(hào)分子熒光黃染料固定在植入親水性聚合物中的纖維素顆粒上，用于飲用水及廢水中Cu2+的檢測(cè)，檢測(cè)范圍為0.00063～6.3 mg·mL-1，響應(yīng)時(shí)間隨Cu2+濃度的不同而變化，廢水中共存的Fe3+、Co2+、Ni2+、Pb2+、Zn2+、Ca2+等對(duì)檢測(cè)的干擾可忽略。研究表明N-aryl-3-aminopropionic acids[19]系列水溶性化合物也可用于天然水和工業(yè)廢水中Cu2+的檢測(cè)，檢測(cè)范圍為0.005～3.0 mg·mL-1，其中N,N-di(2-carboxyethyl)aniline可用于嬰幼兒奶粉中1～12 mg·kg-1Cu2+的檢測(cè)[20]。

由于復(fù)雜樣品中可能有多種可引起熒光淬滅的成分，基于有機(jī)小分子熒光淬滅的“turn-off”檢測(cè)方式在生物樣品和細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)Cu2+產(chǎn)生假陽性信號(hào)的概率較高，因此基于有機(jī)小分子熒光增強(qiáng)的“turn-on”檢測(cè)模式受到了科研工作者的廣泛青睞。Yu等[21]合成了能特異性識(shí)別Cu2+并產(chǎn)生“turn-on”熒光信號(hào)的有機(jī)小分子羅丹明B酰肼類衍生物(Rhodamine B hydrazide derivative)，在Cu2+存在下該化合物所產(chǎn)生的熒光信號(hào)增強(qiáng)，除Hg2+外，過量的其他金屬離子對(duì)信號(hào)干擾極小，被應(yīng)用于Hela細(xì)胞中Cu2+的雙光子成像。此外，Cu+也可選擇性地去除熒光屏蔽基團(tuán)，Taki等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Cu+可使MeO-fluorescein和TokyoGreem衍生物的C-O斷裂并氧化產(chǎn)生熒光，盡管Cu2+無此效應(yīng)，但Cu2+可被GSH快速還原為Cu+，從而被探針識(shí)別并產(chǎn)生熒光，具有細(xì)胞滲透性的TokyoGreem衍生物也被用于Hela細(xì)胞中Cu2+成像。盡管以上有機(jī)小分子熒光探針能夠應(yīng)用于Cu2+的選擇性檢測(cè)，但均存在不可逆的缺陷，不適用于檢測(cè)Cu2+水平隨時(shí)間的變動(dòng)，Yang等[23]首次報(bào)道了一種可逆性Cu+熒光探針，硫冠醚修飾的三芳基吡唑啉熒光探針可選擇性結(jié)合Cu+并通過光致電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生熒光增強(qiáng)信號(hào)，被用于可視化監(jiān)測(cè)NIH3T3細(xì)胞對(duì)銅離子吸收和排放的動(dòng)力學(xué)變化。

Cu2+可在堿性溶液中催化魯米諾(luminol)、光澤精(lucigenin)、洛粉堿(lophine)與過氧化氫(H2O2)反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與Cu2+濃度有關(guān)[24-25]。Lind等[26]將熒光素-NH2OH-化學(xué)發(fā)光體系用于血清中Cu2+的檢測(cè)，線性范圍為0.001～0.02 mg·L-1，除Fe2+和Fe3+外，其他金屬離子對(duì)檢測(cè)干擾較小。1,10-菲羅啉、巰甲丙脯氨酸與H2O2系統(tǒng)也可在堿性條件下被Cu2+識(shí)別并催化產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光[27-28]。盡管這些有機(jī)小分子作為Cu2+的特異性識(shí)別元件，其設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單靈活，構(gòu)建Cu2+檢測(cè)傳感器時(shí)無需額外加入信號(hào)分子，檢測(cè)方法快速簡(jiǎn)便。但是它們通常合成條件苛刻，且Cu2+對(duì)這些有機(jī)熒光分子和化學(xué)發(fā)光底物的識(shí)別特異性稍差，其測(cè)定易受到其他過渡金屬離子的干擾，所以，在檢測(cè)前需要通過沉淀、吸附、加入掩蔽劑等方式去除或屏蔽干擾離子，增加了檢測(cè)的復(fù)雜性，因此難以用于成分不明確復(fù)雜樣品中Cu2+的檢測(cè)。

2 納米材料(Nanomaterials)

納米材料由于量子效應(yīng)使其具有不同于大尺寸材料的獨(dú)特性質(zhì)，如卓越的光、電、磁及催化活性等，其作為信號(hào)分子或識(shí)別分子已被成功用于DNA、蛋白質(zhì)和小分子檢測(cè)領(lǐng)域。其在Cu2+檢測(cè)方面的應(yīng)用亦受到了廣泛關(guān)注，如納米金、量子點(diǎn)等[29-31]。

納米金(AuNPs)具有尺寸依賴的光學(xué)性質(zhì)，在可見光區(qū)域有強(qiáng)烈的表面拉曼吸收，制備簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，并具有良好的生物相容性。Liu等[32]合成十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)穩(wěn)定的AuNPs，在S2O32-存在下反應(yīng)生成Au(S2O32-)23-絡(luò)合物，使部分AuNPs被溶解，AuNPs表面的等離子體共振(SPR)吸收降低，由于Cu2+可催化這一反應(yīng)過程，且SPR吸收強(qiáng)度與Cu2+濃度負(fù)相關(guān)，Liu等將這一基于Cu2+對(duì)AuNPs蝕刻的傳感器用于自來水以及消解后的哈喇樣品中Cu2+的檢測(cè)，其結(jié)果與ICP-MS檢測(cè)結(jié)果相一致。

量子點(diǎn)(QDs)因具備可協(xié)調(diào)發(fā)射光譜、高熒光量子產(chǎn)率和光穩(wěn)定性等優(yōu)越性能已被用于對(duì)Cu2+的檢測(cè)[33-35]。Nurerk等[36]分別以巰基乙酸(TGA)、3-巰基丙酸(MPA)和谷胱甘肽(GSH)為穩(wěn)定劑合成CdTe QDs用于水溶液中Cu2+的檢測(cè)，并對(duì)比了不同穩(wěn)定劑對(duì)檢測(cè)靈敏度和特異性的影響，發(fā)現(xiàn)TGA和MPA修飾的QDs在檢測(cè)時(shí)會(huì)受到Ag+的干擾，GSH修飾的QDs對(duì)Cu2+的選擇性最高，檢測(cè)限為0.06 μg·L-1?；赒Ds表面陽離子交換的Cu2+檢測(cè)方法大多易受到Hg2+和Ag+的干擾，主要是由于三者均可取代QDs表面的Cd2+導(dǎo)致熒光淬滅。Jin等[37]在檢測(cè)體系中加入硫代硫酸鹽在QDs表面形成鈍化層，加入金屬離子后，Cu2+仍可取代Cd2+，而Hg2+和Ag+被鈍化層阻擋，顯著改善Cu2+檢測(cè)的靈敏度和選擇性，檢測(cè)限低至0.14 nmol·L-1。

Cu2+與石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)表面的羧基結(jié)合，產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致GQDs的熒光淬滅，響應(yīng)區(qū)間為0.1～10mol·L-1[38]。根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移機(jī)理，GQDs表面的羧基個(gè)數(shù)對(duì)檢測(cè)靈敏度有較大影響，Li等[39]采用K2S2O8對(duì)合成的GQDs進(jìn)行后氧化處理，增加GQDs的氧化程度并將其用于水中Cu2+的檢測(cè)，檢測(cè)范圍為0～20mol·L-1。Baruah等[40]利用氧化石墨烯量子點(diǎn)(GOQDs)作為交聯(lián)劑誘導(dǎo)聚乙二醇(PVA)形成嵌合有GOQDs的水凝膠，F(xiàn)e2+、Co2+和Cu2+可與GOQDs表面的-NHR基團(tuán)形成金屬離子復(fù)合物，并從水凝膠中釋放到溶液中使溶液呈現(xiàn)相應(yīng)的顏色，該過程可通過UV-vis光譜檢測(cè)，Cu2+檢測(cè)限為10-7mol·L-1。

相比于強(qiáng)度型探針容易受環(huán)境條件、儀器效率、探針濃度等因素的影響，比率型熒光探針則可通過2個(gè)或多個(gè)發(fā)射波段的自校準(zhǔn)消除探針濃度與環(huán)境因素等改變對(duì)測(cè)量體系的擾動(dòng)[41-42]。Zhu等[43]構(gòu)建雙發(fā)射比率型熒光探針選擇性檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Cu2+，包覆在硅殼內(nèi)的CdSe (em=644 nm)僅作為參考信號(hào)消除背景信號(hào)的干擾而對(duì)Cu2+無響應(yīng)，N-(2-aminoethyl)-N,N,N’tris(pyridin-2ylmethyl)ethane- 1,2-diamine (AE-TPEA)功能化的碳量子點(diǎn)(CQDs) (em=485 nm)與CdSe雜交形成殼核型雙發(fā)射QDs，Cu2+淬滅CQDs的藍(lán)色熒光而不影響CdSe的紅色熒光，因此I485/I644隨著Cu2+濃度產(chǎn)生連續(xù)變化，檢測(cè)范圍為5×10-6～2×10-4mol·L-1。Yao等[44]通過EDC/NHS偶聯(lián)2種不同發(fā)射波長(zhǎng)的CdTe QDs形成雙發(fā)射熒光探針，直接利用Cu2+淬滅QDs熒光的特性，實(shí)現(xiàn)了水中Cu2+的可視化檢測(cè)，隨著Cu2+的加入，探針由綠色連續(xù)變?yōu)榧t色，檢測(cè)限為1.1 nmol·L-1。Liu等[45]將羅丹明B (em=585 nm)封裝于硅納米顆粒內(nèi)，并在其表面修飾CQDs (em=467 nm)，在0～3×10-6mol·L-1范圍內(nèi)I467/I585與Cu2+濃度呈負(fù)相關(guān)，檢測(cè)限35.2 nmol·L-1，成功應(yīng)用于MCF-7細(xì)胞中Cu2+的成像。上述幾種比率型熒光探針均是將參比信標(biāo)封裝于納米硅顆粒內(nèi)，極大地降低了QDs的熒光強(qiáng)度，Zou等[46]通過EDC/NHS法在硅納米顆粒表面共價(jià)修飾特異性識(shí)別Cu2+并產(chǎn)生熒光淬滅的CdTe/CdS QDs (紅光)，并在CdTe/CdS QDs表面共價(jià)修飾對(duì)Cu2+不敏感的藍(lán)光碳點(diǎn)(CDs)作為參比信號(hào)，構(gòu)建了比率型熒光納米探針，并對(duì)Hela細(xì)胞中的Cu2+進(jìn)行了成像分析。

納米材料既可作為Cu2+特異性識(shí)別元件，亦是檢測(cè)的信號(hào)分子，以其為識(shí)別元件構(gòu)建的Cu2+檢測(cè)方法具有靈敏度高、信號(hào)穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，可實(shí)現(xiàn)樣品中痕量Cu2+的高靈敏檢測(cè)。然而納米材料的生物相容性較差，在生物樣本中易發(fā)生團(tuán)聚或降解，造成靈敏度下降，限制了其在生物樣品檢測(cè)中的應(yīng)用。

3 生物分子(Biomolecules)

3.1 肽鏈

傳統(tǒng)熒光化學(xué)傳感器的識(shí)別元件多為有機(jī)物構(gòu)成的螯合劑，其合成條件嚴(yán)格且與Cu2+的結(jié)合多為不可逆。而金屬結(jié)合蛋白中的肽基序能夠保持其金屬離子選擇性，且肽鏈合成簡(jiǎn)單，成本低，其作為特異性識(shí)別生物分子已在很多金屬離子檢測(cè)傳感器的設(shè)計(jì)中得到應(yīng)用[47-48]。研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸殘基中的Gly-Gly-His序列是Cu2+的結(jié)合位點(diǎn)，其選擇性可通過改變肽鏈的骨干結(jié)構(gòu)得以實(shí)現(xiàn)。Zheng等[49]設(shè)計(jì)的Gly-Gly-His-Gly序列可以與Cu2+1:1結(jié)合，結(jié)合常數(shù)為3.8×106；Kerim等[50]用Gly-His-Leu-Leu-Cys肽鏈修飾CdS QDs設(shè)計(jì)了對(duì)Cu2+和Ag+具有雙重響應(yīng)的熒光探針。Brianna等[51]以甘氨酸和天冬氨酸合成肽鏈(Gly-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Gly-Gly)做為識(shí)別分子并利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理構(gòu)建熒光探針，在pH 7.0的條件下，該探針對(duì)Cu2+表現(xiàn)出高靈敏度和選擇性，檢測(cè)限為32g·L-1。Bishnu等[52]設(shè)計(jì)了骨架為Cys-X-Gly-His-X-Gly- Glu的金屬離子識(shí)別分子，并發(fā)現(xiàn)當(dāng)X為Gly時(shí)，該肽鏈表現(xiàn)出對(duì)Cu2+的特異性識(shí)別，當(dāng)X為Pro時(shí)，可特異性識(shí)別Zn2+，結(jié)合常數(shù)分別為4.9×1012和6.8×106。

金屬和金屬配合物可催化短肽中的肽鍵水解，多肽和蛋白質(zhì)在金屬離子作用下的選擇性切割在分子生物學(xué)和生物化學(xué)中具有重要意義。Cu2+能夠特異性識(shí)別多肽中的“NDKTHC”序列，并切割Lys和Thr形成的肽鍵，切割效率與Cu2+濃度有關(guān)。呂曉利等[53]設(shè)計(jì)“Ser-Asp-Lys-Ser-His-Thr-Lys”多肽鏈識(shí)別Cu2+，肽鏈兩端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，Cu2+存在下切割肽鏈斷裂，熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，熒光恢復(fù)，該設(shè)計(jì)可大大降低背景熒光，提高探針檢測(cè)靈敏度，其在水中的檢測(cè)限為10 nmol·L-1。

以肽鏈為識(shí)別元件的Cu2+檢測(cè)方法具有肽鏈合成簡(jiǎn)單、成本低、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，但在進(jìn)行生物樣品檢測(cè)時(shí)，肽鏈易受到樣本中酶的作用而發(fā)生水解。肽鏈的防酶切保護(hù)是將其應(yīng)用于生物樣品中特異性識(shí)別Cu2+所面臨的最大挑戰(zhàn)。

3.2 功能化核酸

功能化的脫氧核糖核酸(DNA)包括DNA酶(DNAzyme)和核酸適配體(Aptamer)已在細(xì)胞和生物大分子檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。Cu2+依賴的DNAzyme (Cu-DNAzyme)和Cu2+核酸適配體是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)篩選得到的，對(duì)Cu2+具有特異性識(shí)別功能的DNA片段。

Cu-DNAzyme是由Carmi等[54-56]篩選得到的，由2條DNA鏈組成：具有酶活性的序列和與之互補(bǔ)的底物序列，在沒有Cu2+時(shí)，Cu-DNAzyme不具有催化活性，2條DNA鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)，當(dāng)Cu2+存在時(shí)，Cu-DNAzyme催化切割底物鏈，雙螺旋結(jié)構(gòu)降解并釋放出切割后產(chǎn)生的底物鏈碎片。通過在底物鏈上修飾信號(hào)分子，可構(gòu)建比色、熒光、化學(xué)發(fā)光或電化學(xué)傳感器檢測(cè)Cu2+。Liu等[57]在2007年首次使用Cu-DNAzyme構(gòu)建“turn-on”熒光生物傳感器，在幾分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)水中Cu2+的高選擇性靈敏檢測(cè)，檢測(cè)限35 nmol·L-1。隨后，一些以Cu-DNAzyme為特異性識(shí)別分子的Cu2+檢測(cè)方法得到建立。Lu等[58]以AuNPs為載體，同時(shí)修飾Cu-DNAzyme和Zn-DNAzyme，并分別在底物上標(biāo)記不同發(fā)射波長(zhǎng)的熒光染料及對(duì)應(yīng)的淬滅劑，實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)Cu2+和Zn2+的成像及原位同時(shí)檢測(cè)。Yin等[59]采用一段具有HRP活性的DNA酶(HRP-DNAzyme)序列將Cu-DNAzyme與底物序列連接，其在Cu2+存在下，底物序列被切割釋放后，HRP-DNAzyme序列形成G-四聚體結(jié)構(gòu)，捕獲Hemin而產(chǎn)生HRP催化活性，催化TMB底物顯色，該方法在飲用水中的檢測(cè)限為1 μmol·L-1。

具有獨(dú)特光學(xué)性質(zhì)的AuNPs常與Cu-DNAzyme相結(jié)合設(shè)計(jì)免標(biāo)記可視化的Cu2+檢測(cè)方法[60-62]，其原理為底物鏈被Cu-DNAzyme催化切斷后會(huì)誘導(dǎo)AuNPs聚集從而引起檢測(cè)體系顏色的變化。同時(shí)相關(guān)的研究表明，通過在電極上結(jié)合Cu-DNAzyme及其底物鏈，當(dāng)Cu2+存在時(shí)，Cu-DNAzyme可切割底物鏈，對(duì)電化學(xué)信號(hào)產(chǎn)生循環(huán)放大，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Cu2+的高靈敏檢測(cè)[63-64]。另外，隨著UO22+，Pb2+等金屬離子依賴的DNAzyme的發(fā)現(xiàn)，基于DNAzyme的金屬離子檢測(cè)微陣列被開發(fā)并應(yīng)用于多種金屬離子的快速同時(shí)檢測(cè)[65]，其高靈敏度、高選擇性和高通量的特點(diǎn)使其在環(huán)境檢測(cè)、食品安全檢測(cè)、臨床診斷等方面具有很大的應(yīng)用潛能。

Cu2+核酸適配體是由Qu等[66]在2016年篩選得到的，目前未見有文獻(xiàn)報(bào)道基于Cu2+核酸適配體作為識(shí)別分子所建立的Cu2+檢測(cè)方法，但作為被稱為“化學(xué)抗體”的核酸適配體，其在Cu2+選擇性檢測(cè)方面必將具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.3 抗體

功能化核酸合成簡(jiǎn)單、化學(xué)穩(wěn)定性好、特異性高、生物相容性好。然而，將其應(yīng)用于生物樣本的檢測(cè)仍然存在著易被酶解的不足。免疫檢測(cè)是利用抗體與抗原的特異性結(jié)合對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行分析，抗體對(duì)相應(yīng)抗原的識(shí)別具有高度特異性，且其作為完整蛋白在生物樣本中的穩(wěn)定性較好。免疫檢測(cè)技術(shù)以其高特異性、低成本和實(shí)時(shí)快捷等優(yōu)勢(shì)已在生物毒素、腫瘤標(biāo)志物和微生物檢測(cè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。1985年Reardan等[67]首次分離出In3+的特異性抗體，從此開啟了重金屬免疫檢測(cè)技術(shù)研究的先河。

Cu2+免疫檢測(cè)的關(guān)鍵在于特異性Cu2+單克隆抗體的制備，特異性單克隆抗體制備的關(guān)鍵又在于重金屬免疫原。Cu2+為小分子物質(zhì)，在生物體內(nèi)不會(huì)引起免疫反應(yīng)，因此應(yīng)先制備具有免疫活性的免疫原。制備Cu2+免疫原通常利用雙功能螯合劑(常為EDTA或DTPA的衍生物)與Cu2+形成Cu-螯合劑復(fù)合物，螯合物為低分子量不具有免疫活性的半抗原，需將其與載體蛋白偶聯(lián)，形成完整的免疫原，常用的載體蛋白有牛血清白蛋白(BSA)、血藍(lán)蛋白(KLH)、卵清白蛋白(OVA)等。在成功制備重金屬抗原之后，可以通過小鼠免疫、細(xì)胞融和、雜交瘤篩選、抗體純化等步驟制備Cu2+特異性單克隆抗體。

目前，重金屬離子的免疫檢測(cè)都是采用抗原抑制檢測(cè)的方法，可分為熒光偏振免疫檢測(cè)、間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA免疫檢測(cè)、一步法免疫檢測(cè)(直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法)、KinExA免疫檢測(cè)和免疫膠體金快速檢測(cè)方法。Liu等[68]利用p-SCN-Bn-DOPA為雙功能螯合劑，KLH為載體蛋白合成Cu2+免疫原，免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤細(xì)胞篩選獲得對(duì)Cu-EDTA具有高親和力和特異性識(shí)別的單克隆抗體，并建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)飲用水中Cu2+和血清中游離銅含量進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限為0.032g·mL-1，除與Hg2+的交叉反應(yīng)率為7.9外，與Cd2+，Cr3+，F(xiàn)e3+，Mn2+，Ca2+等其它常見金屬離子的交叉反應(yīng)率均小于1%，其準(zhǔn)確度與精密度與原子吸收檢測(cè)結(jié)果相比無明顯差別。Kong等[69]用Cu-p-SCN-Bn-DOTA-KLH免疫BALB/c 雌性小鼠制備Cu2+單克隆抗體，并對(duì)水中Cu2+進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限為0.003 mg·L-1，與其他金屬離子交叉反應(yīng)率小于1%。王玉珍等[70]利用ITCBE為雙功能螯合劑，BSA為載體蛋白，免疫小鼠制備Cu2+單克隆抗體，并建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)Cu2+，檢測(cè)限為2.15 ng·mL-1，與Cd2+、Zn2+、Hg2+、Cr3+、Pb2+等金屬離子與EDTA螯合物的交叉反應(yīng)率小于0.1%。

Ouyang等[71]在間接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光(CLIA)免疫檢測(cè)Cu2+的基礎(chǔ)上，利用Cu-EDTA自身具有的催化Luminol-H2O2化學(xué)發(fā)光的性質(zhì)，建立了一種免標(biāo)記增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)Cu2+的方法。與傳統(tǒng)的CLIA相比，免標(biāo)記CLIA檢測(cè)限更低(0.33 ng·mL-1)、線性范圍更寬(1.0～1 000 ng·mL-1)；另外，免標(biāo)記CLIA的特異性來自于Cu2+單克隆抗體和Cu-EDTA催化Luminol-H2O2化學(xué)發(fā)光體系的雙重特異性，避免了常見金屬離子的干擾。免疫層析膠體金試紙條檢測(cè)法是通過固相載體硝酸纖維膜、玻璃纖維膜等層析材料的毛細(xì)擴(kuò)散作用，使樣品溶液沿一定方向泳動(dòng)，同時(shí)使固定于其上的膠體金標(biāo)記的待測(cè)物受體或待測(cè)物與待測(cè)樣品中抗原或抗體發(fā)生高親和力的特異性免疫反應(yīng)，并在檢測(cè)區(qū)上富集，得到肉眼可判的顯色結(jié)果。唐佳佳[72]和劉文迪[73]分別利用銅單克隆抗體制備Cu2+檢測(cè)膠體金試紙條，肉眼檢測(cè)限分別為200 ng·mL-1和75 ng·mL-1，在4 ℃避光保存下60 d，試紙條依然有效。

抗體作為Cu2+的識(shí)別元件具有高特異性和高親和力的優(yōu)勢(shì)，但其制備過程耗時(shí)長(zhǎng)、成本高。目前以免疫檢測(cè)為核心的Cu2+檢測(cè)技術(shù)尚處于起步階段，仍然存在著不少的問題，主要表現(xiàn)在：商品化Cu2+單克隆抗體較少，且無統(tǒng)一評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，研究者多使用自制抗體，效價(jià)參差不齊，使各項(xiàng)工作的橫向評(píng)價(jià)比較困難。

4 展望(Prospect)

綜上所述，目前Cu2+檢測(cè)所用的特異性識(shí)別元件可分為有機(jī)小分子、納米材料和生物分子。有機(jī)小分子一般在做為識(shí)別元件的同時(shí)也是信號(hào)分子，其設(shè)計(jì)靈活，可通過不同功能基團(tuán)的修飾改變其選擇性；納米材料可通過表面功能化修飾實(shí)現(xiàn)對(duì)Cu2+的高靈敏、特異性響應(yīng)；生物分子作為Cu2+識(shí)別分子則具有良好的生物相容性，其中肽鏈和功能化核酸具備合成簡(jiǎn)單、成本低、易修飾等優(yōu)點(diǎn)，而Cu2+單克隆抗體則具備對(duì)Cu2+的高特異性識(shí)別性能。因此基于上述特異性識(shí)別元件構(gòu)建的Cu2+檢測(cè)方法已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境及食品中Cu2+的檢測(cè)，但由于血清中游離銅含量較低、存在形式復(fù)雜、血清中干擾成分多等原因，其應(yīng)用于血清游離銅檢測(cè)的方法鮮有報(bào)道。盡管如此，或許我們可以通過對(duì)上述特異性識(shí)別元件進(jìn)行修飾和改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)生物樣品中游離銅的快速檢測(cè)，其中如何進(jìn)一步提高銅離子識(shí)別元件對(duì)游離銅的親和力、特異性以及在生物樣品中的穩(wěn)定性和抗干擾能力是構(gòu)建低成本、高靈敏、高特異性的血清游離銅快速檢測(cè)方法的關(guān)鍵所在。

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