郭子明 阮狄克 何王德利 李威 李小川 林凌瀚 陳佳海

IL-1β 作用下功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠對大鼠髓核細胞蛋白多糖和 II 型膠原代謝影響的實驗研究

目的觀察修飾有骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì) 7 ( bone morphogenetic protein 7，BMP-7 ) 功能片段的功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠 RADKPS 在低濃度炎癥因子白介素-1β ( inter leukin-1β，IL-1β ) ( 10 pg / ml )持續(xù)作用下對大鼠髓核細胞蛋白多糖和 II 型膠原代謝的影響。方法 體外分離培養(yǎng) SD 大鼠髓核細胞 ( nucleus pulposus cells，NPCs )，取第 3 代 NPCs 分別在無 BMP-7 功能片段的 RADA16-I 或修飾有 BMP-7 功能片段的RADKPS 中培養(yǎng)，試驗共分 4 組：A 組 ( 無 IL-1β 干預(yù)的 RADA16-I 組 )、B 組 ( 有 IL-1β 干預(yù)的 RADA16-I組 )、C 組 ( 有 IL-1β 干預(yù)的 RADKPS 組 ) 和 D 組 ( 無 IL-1β 干預(yù)的 RADKPS 組 )。分別在培養(yǎng)的第 3 天、第6 天及第 9 天通過 RT-PCR 和 ELISA 檢測髓核細胞蛋白多糖和 II 型膠原在 RNA 和蛋白水平的表達量。結(jié)果RT-PCR 和 ELISA 結(jié)果表明在第 3 天和第 6 天時 C 組蛋白多糖和 II 型膠原的表達水平均明顯高于 A 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 )，但到第 9 天時兩組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＞0.05 )；B 組蛋白多糖和 II 型膠原的表達水平在第 3 天、第 6 天及第 9 天時均低于 A 組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＞0.05 )；在第 3 天時C 組蛋白多糖和 II 型膠原的表達水平低于 D 組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＞0.05 )，在第 6 天和第 9 天時，C 組中兩者的表達量均明顯低于 D 組，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 )。結(jié)論 髓核細胞經(jīng) BMP-7 功能片段刺激后對 IL-1β 抑制其蛋白多糖和 II 型膠原合成的作用更為敏感，但低濃度 IL-1β ( 10 pg / ml ) 不能完全抵消功能化自組裝多肽納米纖維水凝 RADKPS 中 BMP-7 功能片段對大鼠 NPCs 蛋白多糖和 II 型膠原合成的促進作用。本研究表明 RADKPS 在體外條件下有一定的抗 IL-1β 作用，所以即使在炎癥因子 IL-1β 的存在下，RADKPS仍能促進髓核細胞蛋白多糖和 II 型膠原的合成。

組織工程；骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)；白細胞介素；水凝膠；大鼠；髓核細胞

下腰痛是當(dāng)今臨床常見病之一，它不僅嚴重影響患者的生活質(zhì)量和勞動能力，同時還給社會造成嚴重的經(jīng)濟負擔(dān)[1]。研究表明椎間盤退變 ( intervertebral disc degeneration，IDD ) 是造成下腰痛的主要原因之一[2]。髓核細胞外基質(zhì)蛋白多糖和 II 型膠原含量的降低在 IDD 的發(fā)生及發(fā)展中扮演著重要角色，因此提高退變椎間盤中細胞外基質(zhì)蛋白多糖和 II 型膠原的含量將是修復(fù)退變椎間盤的一個有效途徑[3-5]。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì) 7 ( bone morphogenetic protein 7，BMP-7 ) 又名成骨蛋白-1 ( osteogenic protein-1，OP-1 )，是轉(zhuǎn)化生長因子 β ( transforming growth factor-β，TGF-β ) 超家族中的一員，體外及體內(nèi)試驗均表明 BMP-7 可促進犬、兔及人髓核細胞中蛋白多糖和 II 型膠原的合成，同時體內(nèi)實驗表明 BMP-7 注射后還可提高新西蘭大白兔椎間盤內(nèi)的含水量及增加椎間盤高度，進而達到修復(fù)退變椎間盤的作用[6-8]。

RADA16-I ( AcN-RADARADARADARADA-CNH )是一種新型自組裝多肽納米纖維支架材料，通過在其C 端末端復(fù)合短的具有不同功能的生物活性多肽片段提高其生物學(xué)活性，從而達到與組織細胞特異性作用的目的，并將這種經(jīng)過修飾后的 RADA16-I 材料稱之為“功能化自組裝納米纖維支架”[9]。本研究前期將短的具有 BMP-7 功能的多肽片段 ( KPSSAPTQLN )通過化學(xué)鍵方式結(jié)合在 RADA16-I 的 C 端從而構(gòu)建出功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠支架材料RADA-KPSS，再把 RADA-KPSS 與 RADA16-I 以1∶1 比例混合形成新型功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠支架材料 RADKPS，研究表明，RADKPS 在體外可明顯促進人退變髓核細胞中蛋白多糖和 II 型膠原的合成，且后續(xù)的研究進一步展現(xiàn)了 RADKPS 應(yīng)用于修復(fù)退變椎間盤的良好潛力[10-13]。

研究證實退變椎間盤組織中 IL-1β 的含量明顯升高，且其通過抑制髓核細胞外基質(zhì)的合成和加速細胞外基質(zhì)的降解進而加速椎間盤的退變，所以IL-1β 可能影響 RADKPS 應(yīng)用于修復(fù)退變椎間盤的遠期體內(nèi)實驗[14-16]。關(guān)于 RADKPS 在 IL-1β 持續(xù)作用下對髓核細胞外基質(zhì)蛋白多糖和 II 型膠原的代謝的影響，目前尚未有文獻報道，本研究擬在體外觀察修飾有 BMP-7 功能片段的 RADKPS 在低濃度 IL-1β 的持續(xù)作用下對大鼠髓核細胞蛋白多糖和II 型膠原代謝的影響，為 RADKPS 進一步應(yīng)用于體內(nèi)修復(fù)退變椎間盤提供指導(dǎo)。

材料與方法

一、試驗動物

清潔級健康雄性 SD 大鼠，5 只 ( 3 個月齡，體質(zhì)量 330～370 g )，均由解放軍海軍總醫(yī)院動物試驗中心提供，動物處理方案經(jīng)過海軍總醫(yī)院倫理委員會批準。

二、主要材料、儀器及試劑

RADA16-I [ 氨基酸序列：ACN- ( RADA ) 4-CONH2 ]與 RADA-KPSS [ 氨基酸序列列：ACN-( RADA ) 4GGKPSSAPTQLN-CONH ]多肽粉末各100 mg ( 利用固相合成法合成，純度＞90%；上海生工生物工程有限公司；RADA16-I，P10325；RADA-KPSS，P10324 )；胎牛血清 FBS ( Gibco，美國，16000-044 )；LG-DMEM 培養(yǎng)基 ( Solarbio，中國，31600-500 )；PBS 緩沖液 ( Hyclone，美國，SH30256.01 )；II 型膠原酶 ( Sigma，美國，C6885 )；胰酶 ( Gibco，美國，25300-054 )；Trizol ( Invitrogen，美國，15596026 ) IL-1β ( Peprotech，美國，200-01B )；RT-PCR 試劑盒 ( Takara，日本，RR820A )；RT-PCR 儀 ( Thermo Fisher，美國，TCR0096 )；ELISA 檢測試劑盒 ( Blue Gene，中國；大鼠蛋白多糖，E02P0161；大鼠 II 型膠原，E02C0779 )；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis試劑盒 ( Takara，日本，RR036A )。Millicell cell culture insert ( 孔徑 0.4 μm，直徑 12 mm，Merck，美國，PICM01250 )；培養(yǎng)瓶 ( Corning，美國，431464U )；培養(yǎng)板 ( Corning，美國，NY14831 )。細胞培養(yǎng)箱 ( Thermo，美國，HERACell 150i )；倒置相差顯微鏡 ( Olympus，日本，703516 )；超聲破碎儀( Ameritech，中國，UC-5832 )。

三、試驗步驟

1. 髓核細胞的分離、培養(yǎng)及傳代：經(jīng)腹腔注射 10% 水合氯醛處死 SD 大鼠，置于 75% 乙醇中浸泡 10 min 后轉(zhuǎn)入經(jīng)紫外照射處理過的無菌動物手術(shù)臺，常規(guī)消毒術(shù)區(qū)、鋪巾，沿背部正中入路切開皮膚，輕柔剝離脊柱周圍附著的肌肉及軟組織結(jié)構(gòu)，于無菌操作下取出 SD 大鼠腰段脊柱，無菌 PBS 緩沖液清洗后立即轉(zhuǎn)入超凈臺，利用尖刀片在解剖顯微鏡下切開椎間盤外層纖維環(huán)，顯露并分離中央膠凍樣髓核組織，眼科鑷夾取后置入裝有 PBS 緩沖液 ( 含 0.1% 雙抗的 ) 的 15 ml 離心管內(nèi)清洗 3 次( 3 min / 次 )，并以 1200 r / min 離心 5 min 后收集組織塊沉淀，隨后轉(zhuǎn)移至 6 孔板中，用眼科剪將 6 孔板中的組織塊剪碎至約 1 mm × 1 mm× 1 mm 大小后完全浸于 0.25% II 型膠原酶溶液，在 37 ℃ 及 5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱進行消化，每隔 30 min 用吸管輕柔吹打數(shù)次。4 h 后用等體積的完全培養(yǎng)基 ( 含 10% FBS 的 LG-DMEM ) 終止消化，用 200 目無菌篩網(wǎng)過濾后收集細胞沉淀，PBS 漂洗 2 次 ( 3 min / 次 )，1000 r / min 離心 5 min，棄上清，加入完全培養(yǎng)基重懸并用吸管輕柔吹打混勻細胞，隨后將細胞以1×105個 / ml 接種于 25 cm2的無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于5% CO2、37 ℃ 飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每 3 天換液 1 次。在倒置相差顯微鏡下觀察髓核細胞生長狀況，待細胞融合至 80%～90% 時，用 0.25% 胰酶( 含 0.01% EDTA ) 消化后按 1∶3 進行傳代培養(yǎng)，取第 3 代髓核細胞用于后續(xù)試驗。

2. 多肽水凝膠的制備：用無菌超純水將RADA16-I 和 RADA-KPSS 多肽粉末溶解后分別配制成濃度為 1% ( m / v ) 的多肽溶液，4 ℃ 條件下使用超聲破碎儀探針超聲 30 min 使多肽粉末充分溶解；將 1% RADA16-I 溶液與 1% RADA-KPSS 溶液等體積混合形成 1% RADKPS；置于 4 ℃ 保存以用于后續(xù)試驗 ( 圖1 )。

3. 細胞 / 多肽水凝膠支架材料的制備：將 transwell 小室輕置于 24 孔培養(yǎng)板內(nèi)，然后用 10% ( m / v )的蔗糖溶液重懸收集到的第 3 代髓核細胞并制備成濃度為 2.5×106個 / ml 的細胞懸液，取 20 μl 細胞懸液 ( 含有 5×104個髓核細胞 ) 分別與 100 μl 的 1% RADA16-I 和 1% RADKPS 的多肽溶液迅速混勻。隨后立即將細胞 / 多肽水凝膠支架材料混懸液移入transwell 小室，用移液槍在 24 孔板底面輕緩的加入100 μl 完全培養(yǎng)基，隨后置入 5% CO2、37 ℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 10 min 以成膠，成膠后移除 24 孔板底面的完全培養(yǎng)基，輕緩地在 24 孔板培養(yǎng)孔內(nèi)和水凝膠表面加入完全培養(yǎng)基共 1 ml，再次置入 5% CO2、37 ℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 30 min，之后每 30 min 更換 1 次培養(yǎng)孔內(nèi)及凝膠表面的完全培養(yǎng)基，至少更換 2 次以平衡水凝膠的 pH 值 ( 圖2 )。

4. 試驗分組及 IL-1β 干預(yù)：試驗共分為四組：A組，無 IL-1β 干預(yù)的 RADA16-I 組；B 組，有 IL-1β ( 10 pg / ml ) 干預(yù)的 RADA16-I 組；C 組：有 IL-1β ( 10 pg / ml ) 干預(yù)的 RADKPS 組；D 組：無 IL-1β 干預(yù)的 RADKPS 組。細胞 / 多肽水凝膠支架材料制備成功后在 A 組和 D 組培養(yǎng)孔內(nèi)和水凝膠表面輕緩加入完全培養(yǎng)基共 1 ml，B 組和 C 組在加入 1 ml 完全培養(yǎng)基的同時加入 IL-1β ( 10 pg / ml )。此后每天換液 1 次，每次換液時在 B 組和 C 組均加入 IL-1β ( 10 pg / ml )。

5. 蛋白多糖和 II 型膠原的 mRNA 檢測：實時熒光定量 PCR ( RT-PCR )：( 1 ) RNA 的提取：使用 Trizol 分別提取各組第 3 天、第 6 天及第 9 天時的髓核細胞的總 RNA；( 2 ) cDNA 合成：采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis 試劑盒，按照說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，37 ℃，15 min；反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)，85 ℃，5 s，得到 RT 反應(yīng)液；( 3 ) SYBR Green RT-PCR 反應(yīng)體系：采用 SYBRPremixEx TaqTM II ( Tli RNaseHPlus ) RT-PCR 試劑盒，按照說明書配制擴增反應(yīng)體系，95 ℃ 預(yù)變性 30 s，進行 40 個循環(huán)，95 ℃ 變性 3 s，60 ℃ 退火延伸 30 s，以 SD 大鼠的 β-actin 作為內(nèi)參基因，檢測各組蛋白多糖及 II 型膠原的 mRNA 相對表達量，以上引物均由北京生工有限公司合成。

圖1 功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠的大體照 a～b：RADA16-I；c～d：RADKPSFig.1 General observation of the functional self-assembling peptide nanof i ber hydrogel scaffold a - b: RADA16-I; c - d: RADKPS

圖2 髓核細胞與 RADA16-I 或 RADKPS 混合后放在 transwell小室內(nèi)培養(yǎng)Fig.2 NPCs / RADA16-I mixtureor NPCs / RADKPS mixture was cultured in transwell

6. 蛋白多糖和 II 型膠原的 ELISA 定量檢測：在第 3 天、第 6 天及第 9 天時用 RIPA 蛋白裂解液分別提取各組的總蛋白，暫存于 -80 ℃ 以用于后續(xù)試驗。用 BCA 法測定每組的總蛋白濃度，根據(jù) ELISA試劑盒說明書對各組蛋白多糖和 II 型膠原進行定量檢測。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料表示為±s。將各組數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗后，再采用單因素方差分析的檢驗方法進行組間比較，每次試驗重復(fù) 3 次。P＜0.05 表示組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、RT-PCR 檢測各組細胞中蛋白多糖和 II 型膠原的 mRNA 表達水平

在第 3 天和第 6 天時 C 組蛋白多糖和 II 型膠原的 mRNA 表達水平均明顯高于 A 組，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 )，在第 9 天時兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＞0.05 )；在第 3 天、第 6 天及第 9 天時B 組蛋白多糖和 II 型膠原的 mRNA 表達水平均低于A 組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＞0.05 )；在第 3 天時 C 組蛋白多糖和 II 型膠原 mRNA 的表達水平均低于 D 組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＞0.05 )，而在第6 天和第 9 天時兩者的表達水平均明顯低于 D 組，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 )，( 圖3 )。

圖3 蛋白多糖和 II 型膠原 mRNA 的相對表達量 (aP ＜ 0.05，A 組與 C 組對比；bP ＜ 0.05，C 組與 D 組對比；A 組：RADA16-I，B 組：RADA16-I + IL-1β，C 組：RADKPS + IL-1β；D 組：RADKPS )Fig.3 Relative expression of Agg and COL2a mRNA (aP ＜ 0.05, group A vs. group C;bP ＜ 0.05, group C vs. group D; Group A: RADA16-I, Group B: RADA16-I + IL-1β, Group C: RADKPS + IL-1β, Group D: RADKPS )

二、ELISA 定量檢測各組中蛋白多糖和 II 型膠原的含量

蛋白多糖和 II 型膠原的 ELISA 定量檢測結(jié)果表明，在第 3 天和第 6 天時 C 組蛋白多糖和 II 型膠原的含量均明顯高于 A 組，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義( P＜0.05 )，但在第 9 天時兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P＞0.05 )；B 組蛋白多糖和 II 型膠原在第 3 天、第6 天及第 9 天時的含量均低于 A 組，兩組之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＞0.05 )；C 組蛋白多糖和 II 型膠原在第 3 天時的含量低于 D 組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＞0.05 )，但在第 6 天和第 9 天時兩者的含量均明顯低于 D 組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 )，( 圖4 )。

圖4 通過 ELISA 檢測到的蛋白多糖和 II 型膠原的含量 (aP ＜ 0.05，A 組與 C 組對比；bP ＜ 0.05，C 組與 D 組對比；A 組：RADA16-I，B 組：RADA16-I + IL-1β，C 組：RADKPS + IL-1β；D 組：RADKPS )Fig.4 The production of Agg and COL2a were determined by ELISA (aP ＜ 0.05, group A vs. group C;bP ＜ 0.05, group C vs. group D; Group A: RADA16-I, Group B: RADA16-I + IL-1β, Group C: RADKPS + IL-1β, Group D: RADKPS )

討 論

組織工程應(yīng)用于修復(fù)退變的椎間盤被認為是一種很有前景的方式[17-18]，理想的組織工程材料不僅要提供利于髓核細胞生長的微環(huán)境，而且還要能促進髓核細胞外基質(zhì)的分泌，本試驗前期研究已證明修飾有 BMP-7 功能片段的功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠 RADKPS 不僅能明顯促進髓核細胞外基質(zhì)蛋白多糖和 II 型膠原的合成，而且還具有理想的生物相容性、促進種子細胞增殖及分化等作用[10-13]，這些研究表明 RADKPS 在將來應(yīng)用于體內(nèi)修復(fù)退變椎間盤方面具有良好的潛力。但在退變的椎間盤中炎癥因子的含量是明顯升高的，尤其是 IL-1β，IL-1β 的存在也許會影響 RADKPS 對退變椎間盤的修復(fù)作用[14,19]。本實驗研究表明在低濃度 IL-1β ( 10 pg / ml ) 持續(xù)作用下會在一定程度上弱化，但不能完全抵消 RADKPS 對髓核細胞外基質(zhì)蛋白多糖和II 型膠原合成的促進作用。

關(guān)于 IL-1β 作用濃度的選擇，Huch 等[20]早期研究表明在 IL-1β 的作用濃度為 10 pg / ml 時，BMP-7 ( 50 ng / ml ) 對人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)蛋白多糖的合成仍有積極促進作用，隨后 Zhang 等[19]報道 BMP-7 ( 100 ng / ml ) 可完全抵消 IL-1α ( 0.1 ng / ml ) 對牛髓核細胞外基質(zhì)蛋白多糖合成的抑制作用?；谝陨涎芯浚緦嶒炦x用濃度為 10 pg / ml 的 IL-1β 作為后續(xù)的試驗研究。

RT-PCR 及 ELISA 結(jié)果表明，在第 3 天和第6 天時 C 組蛋白多糖和 II 型膠原的表達水平均明顯高于 A 組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，到第 9 天時C 組中兩者的表達量仍高于 A 組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，以上實驗結(jié)果表明在低濃度 IL-1β 持續(xù)作用 9 天下，IL-1β 不能完全抵消 RADKPS 中 BMP-7 功能片段對大鼠髓核細胞外基質(zhì)蛋白多糖和II 型膠原合成的促進作用。

此外 C 組蛋白多糖和 II 型膠原的表達量在第3 天時均低于 D 組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，在第6 天和第 9 天時均明顯低于 D 組，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；同時在第 3、6 及 9 天時 B 組蛋白多糖和II 型膠原的表達水平均低于 A 組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。Zhang 等[19]在之前的研究中也得出了類似的試驗結(jié)果即在無 BMP-7 刺激后低濃度的 IL-1α ( 0.1 ng / ml ) 對牛髓核細胞外基質(zhì)蛋白多糖的合成有微弱的抑制作用，而同濃度的 IL-1α 對經(jīng) BMP-7 刺激后的牛髓核細胞中蛋白多糖的合成有明顯的抑制作用，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是經(jīng) BMP-7 刺激后的髓核細胞對低濃度 IL-1 的負性調(diào)節(jié)作用更敏感。同時，Zhang 等[19]研究表明無 BMP-7 存在時低濃度的 IL-1α ( 0.1 ng / ml ) 不僅不抑制牛纖維環(huán)細胞外基質(zhì)蛋白多糖的合成，反而對其合成起到一定的促進作用；還有研究表明低濃度的 IL-1β ( 10 pg / ml ) 對人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)蛋白多糖的合成反而有一定的促進作用[20]。

所以雖然修飾有 BMP-7 功能片段的 RADKPS能顯著促進髓核細胞外基質(zhì)蛋白多糖和 II 型膠原的合成，但本試驗結(jié)果表明退變椎間盤中 IL-1β 的存在也許會在一定程度上弱化其對于退變椎間盤的修復(fù)作用。為了使 RADKPS 對退變椎間盤的修復(fù)達到更理想的效果，可以考慮通過抑制 IL-1β 的負面效應(yīng)而達到。最近研究表明 IL-1β 受體拮抗劑阿那白滯素已用于臨床上治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎，且取得了良好的臨床療效[21-22]。目前體外及動物試驗已證實 IL-1β 受體拮抗劑可明顯減輕 IL-1β 對椎間盤組織所產(chǎn)生的致退變作用[23-25]，以上研究表明聯(lián)合使用 IL-1β 受體拮抗劑，也許會使 RADKPS 對退變椎間盤的修復(fù)達到更理想的效果。但目前關(guān)于IL-1β 受體拮抗劑應(yīng)用于修復(fù)退變椎間盤的研究主要局限于體外或者動物試驗，需進行進一步的臨床試驗以驗證其在修復(fù)退變椎間盤方面的應(yīng)用價值。

綜上所述，本實驗通過用 IL-1β 在一定程度上模擬退變椎間盤周圍的炎性環(huán)境以觀察 RADKPS 對大鼠髓核細胞外基質(zhì)蛋白多糖和 II 型膠原代謝的影響，更加完善了功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠RADKPS 在修復(fù)退變椎間盤方面的作用，為其遠期的體內(nèi)試驗提供了一定的指導(dǎo)意義。

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( 本文編輯：李慧文 )

Effect of functionalized self-assembling peptide nanof i ber hydrogel on the metabolism of aggrecan and type II collagen of rat nucleus pulposus cells with the effect of IL-1β

GUO Zi-ming, RUAN Di-ke, HE Qing, WANG De-li,LI Wei, LI Xiao-chuan, LIN Ling-han, CHEN Jia-hai. Naval Clinical College of Anhui Medical University, Hefei, Anhui, 230032, China

RUAN Di-ke, Email: ruandikengh@163.com

ObjectiveTo observe the effect of RADKPS which is modif i ed with BMP-7 functional fragments on the metabolism of aggrecan and type II collagen of nucleus pulposus cells of rats when a low concentration of interleukin-1 beta ( IL-1β, 10 pg / ml ) is existent. Methods Nucleus pulposus cells ( NPCs ) were isolated from Sprague-Dawley rats and cultured to the 3rd passage in vitro. NPCs were cultured in the presence of RADA16-I which was without BMP-7 functional fragment or RADKPS which was combined with BMP-7 functional fragments. Experiments were divided into 4 groups: group A ( RADA16-I without IL-1β ), group B ( RADA16-I with IL-1β ), group C ( RADKPS with IL-1β ) and group D ( RADKPS without IL-1β ). Real-time PCR ( RT-PCR ) and enzymelinked immunosorbent assay ( ELISA ) were performed to determine the RNA and protein expressions of aggrecan and type II collagen of each group on the 3rd day, the 6th day and the 9th day. Results The results of RT-PCR and ELISA showed that the expression level of aggrecan and type II collagen of group C was signif i cantly higher than that of group A on the 3rd day and the 6th day and the difference was statistically signif i cant ( P ＜ 0.05 ), but the differencebetween the 2 groups was not statistically signif i cant on the 9th day ( P ＞ 0.05 ); the expression level of aggrecan and type II collagen of group B was lower than that of group A at the 3rd day, the 6th day and the 9th day, but the difference between the 2 groups was not statistically signif i cant at the 3 time points ( P ＞ 0.05 ); the expression level of aggrecan and type II collagen of group C was lower than that of group D on the 3rd day and there was no statistical signif i cance ( P ＞ 0.05 ). But the expression level of aggrecan and type II collagen of group C was signif i cantly lower than that of group D on the 6th day and the 9th day, and the difference between the 2 groups was statistically signif i cant ( P ＜0.05 ). Conclusions After being stimulated by BMP-7 functional fragments, nucleus pulposus cells are more sensitive to the inhibition of IL-1β on the synthesis of aggrecan and type II collagen. However, IL-1β ( 10 pg / ml ) could not completely counteract the positive effect of BMP-7 functional fragments which are compounded in the functionalized self-assembled peptide nanof i ber hydrogel RADKPS on the synthesis of aggrecan and type II collagen of NPCs. The present study shows that RADKPS has a certain anti-IL-1β effect in vitro. Therefore, RADKPS can still promote the synthesis of aggrecan and type II collagen of NPCs when proinf l ammatory cytokine IL-1β is present.

Tissue engineering; Bone morphogenetic protein 7; Interleukin-1 beta; Hydrogel; Rats; Nucleus pulposus cells

10.3969/j.issn.2095-252X.2017.03.009

R318

國家自然科學(xué)基金面上項目 ( 81472121 )

230032 合肥，安徽醫(yī)科大學(xué)海軍臨床學(xué)院 ( 郭子明、阮狄克 )；100048 北京，海軍總醫(yī)院骨科 ( 何、王德利、李威、李小川、林凌瀚、陳佳海 )

阮狄克，Email：ruandikengh@163.com

2016-12-20 )