魏冬凱，南 蓬，徐康萍，裘 鋒,3*

(1. 蘇州貝斯派生物科技有限公司 江蘇 蘇州 215123；2. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 上海 200438；3.上海生物信息技術(shù)研究中心 上海 201203)

基于微量DNA樣本的簡化甲基化文庫構(gòu)建方法研究

魏冬凱1,2，南 蓬2，徐康萍1，裘 鋒1,3*

(1. 蘇州貝斯派生物科技有限公司 江蘇 蘇州 215123；2. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 上海 200438；3.上海生物信息技術(shù)研究中心 上海 201203)

RRBS(簡化甲基化測(cè)序)是一種有效研究DNA甲基化狀態(tài)的測(cè)序方案。文庫構(gòu)建是該方案中最關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)步驟之一，RRBS文庫構(gòu)建往往因?yàn)槊盖挟a(chǎn)物少，文庫構(gòu)建步驟繁多等因素，導(dǎo)致DNA起始量需要1 ug以上。然而很多來源于人的樣本，如冰凍組織穿刺、石蠟切片、顯微微切割等，都往往只能獲得100 ng以下的DNA，無法滿足常規(guī)RRBS文庫構(gòu)建的起始DNA總量要求，從而大大限制RRBS技術(shù)的應(yīng)用范圍。本研究主要探討并設(shè)計(jì)了基于微量DNA樣本(<100 ng)的RRBS文庫構(gòu)建策略，主要通過優(yōu)化MspI酶切條件、DNA片段大小篩選、縮減反應(yīng)步驟及減少DNA轉(zhuǎn)移次數(shù)等技術(shù)手段，大大提高了DNA回收率，進(jìn)而建立了2種有效使用微量DNA樣品的RRBS文庫構(gòu)建方案(即EA-Method和WB-Method方案)。EA-Method方案在處理100 ng左右的DNA時(shí)，有經(jīng)濟(jì)、快速、高效的特點(diǎn)，但文庫質(zhì)量略差于WB-Method方案；WB-Method方案可將DNA起始量降低至10 ng，并且文庫質(zhì)量高。為驗(yàn)證WB-Method方法的可靠性，研究人員選取了3種志愿者樣本(全血和口拭子)，采用WB-Method同時(shí)進(jìn)行常量和微量RRBS文庫構(gòu)建，并進(jìn)行Illumina Hiseq平臺(tái)測(cè)序，數(shù)據(jù)通過生物信息分析得到微量RRBS檢測(cè)的CpG，CHG，CHH中C堿基的甲基化比例與常量RRBS結(jié)果一致。同時(shí)，該方法可以大大降低DNA損耗及損傷，因而該方法可將RRBS技術(shù)應(yīng)用到更廣泛的樣本類型中去，有效拓展RRBS的研究領(lǐng)域。

二代測(cè)序；RRBS；簡化甲基化；EA-M；WB-M

表觀遺傳學(xué)是指在不改變DNA 序列的條件下所發(fā)生的可遺傳基因表達(dá)的變化[1]．表觀遺傳學(xué)主要包括DNA 甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)．脊椎動(dòng)物中，DNA 甲基化表現(xiàn)為在DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)作用下，甲基基團(tuán)合成到5′-CpG-3′中胞嘧啶的第五位碳原子上[2]．正常情況下,人類基因組“垃圾”序列的CpG二核苷酸相對(duì)稀少,并且總是處于甲基化狀態(tài)。非甲基化的CpG不是均勻分布，而是呈現(xiàn)局部聚集傾向，形成一些GC含量較高、CpG雙核苷酸相對(duì)聚集的區(qū)域，即CpG島[3].與之相反,人類基因組中大小為100～1000 bp 左右且富含CpG二核苷酸的CpG島則總是處于未甲基化狀態(tài),并且與56%的人類基因組編碼基因相關(guān)[4]。在正常人的基因組DNA中,約有3%～6%的胞嘧啶是甲基化的[5]. 根據(jù)Gardiner-Garden 等[6]的定義，CpG 島是一段長度不小于200 bp、GC 含量不小于50%、CpG 含量與期望含量之比不小于0.6 的區(qū)域．由于該定義將一些重復(fù)片段也包含其中，Takai 和Jones[7]將CpG 島重新定義為長度不小于500 bp、GC 含量不小于55%、CpG 含量與期望含量之比不小于0.65的區(qū)域．據(jù)統(tǒng)計(jì)，多于50%的基因的啟動(dòng)子區(qū)含有CpG 島[8-9]．在早期的認(rèn)識(shí)中，CpG 島都是非甲基化的，但是隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)在印跡基因、失活的X 染色體[10]甚至是正常的體細(xì)胞中都存在甲基化的CpG 島[11]．部分CpG 島的異常甲基化常常伴隨著癌癥等疾病的發(fā)生[12]。高通量測(cè)序技術(shù)堪稱測(cè)序技術(shù)發(fā)展歷程的一個(gè)里程碑，該技術(shù)可以對(duì)數(shù)百萬個(gè)DNA 分子同時(shí)進(jìn)行測(cè)序。這使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行全景式分析成為可能，因此也稱其為深度測(cè)序(Deep sequencing)[13]或下一代測(cè)序技術(shù)(Next generation sequencing，NGS)[14]。新一代高通量測(cè)序技術(shù)使得基因組整體水平高精度的甲基化檢測(cè)成為現(xiàn)實(shí)。目前，高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于擬南芥、人、水稻和家蠶等生物DNA甲基化的研究，并取得了廣泛的研究成果[15-18]。

研究DNA 甲基化的高通量測(cè)序技術(shù)方法主要包括：全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序(Bisulfite sequencing，Bi-seq) 和簡化表達(dá)重亞硫酸鹽測(cè)序 (Reduced Representation Bisulfite Sequencing, RRBS)、甲基化DNA 免疫共沉淀測(cè)序(Methylated DNA immuno precipitation sequencing, MeDIP-seq)、甲基化DNA 富集結(jié)合高通量測(cè)序(Methylated DNA binding domain sequencing, MBD-Seq)等。目前，重亞硫酸鹽修飾被公認(rèn)為DNA 甲基化檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。Bi-seq和RRBS技術(shù)均是基于上述修飾。全基因組Bisulfite 測(cè)序技術(shù)可以得到單堿基分辨率的全基因組甲基化圖譜。這一技術(shù)最初被Cokus等[15]應(yīng)用在植物擬南芥的全基因甲基化圖譜分析上(借助了Solexa 測(cè)序技術(shù))。2009年Lister 等[19]利用全基因組Bisulfite 測(cè)序發(fā)表了第一篇人類的全基因組甲基化圖譜( 利用了Solexa 測(cè)序)，隨后該技術(shù)開始在人類疾病，如肥胖癥的研究中得以應(yīng)用[20]?；趯?duì)黃種人的外周血單核細(xì)胞DNA 樣品進(jìn)行Bisulfite 處理后，結(jié)合Solexa 測(cè)序技術(shù)進(jìn)行深度測(cè)序，2010年Li等[21]成功繪制出了“炎黃一號(hào)”高精確度的全基因組甲基化圖譜。然而，重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化全基因組法高昂的測(cè)序成本，在一定程度上限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

簡化表達(dá)亞硫酸鹽測(cè)序(RRBS)，又稱基于酶切消化的重亞硫酸鹽測(cè)序, 是一種簡便、高效、經(jīng)濟(jì)的DNA甲基化研究方法，通過酶切富集啟動(dòng)子及CpG島區(qū)域，并進(jìn)行Bisulfite測(cè)序，同時(shí)實(shí)現(xiàn)DNA甲基化狀態(tài)檢測(cè)的高分辨率和測(cè)序數(shù)據(jù)的高利用率。2005年Meissner 等[22]最初結(jié)合Sanger 測(cè)序發(fā)明了該項(xiàng)技術(shù)，并將其成功應(yīng)用于鼠胚胎干細(xì)胞去甲基轉(zhuǎn)移酶前后的甲基化譜的檢測(cè)。接著Meissner領(lǐng)導(dǎo)的研究小組通過改用MspI 酶切來富集小鼠全基因組近90%的CpG島片段，結(jié)合Illumina 公司的高通量測(cè)序技術(shù)，建立并完善了適用于哺乳動(dòng)物全基因組甲基化測(cè)序分析的方法[23]。2010年該課題組又發(fā)表了一篇關(guān)于RRBS的文章，在其先前的工作基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化RRBS 技術(shù)并挖掘其在臨床應(yīng)用上的潛力[24]。2012年華大基因研究院與深圳大學(xué)、中山大學(xué)及華南科技大學(xué)合作發(fā)表了RRBS與Bisulfite 測(cè)序的比較方法學(xué)文章[25]。Wang等[26]發(fā)現(xiàn)雙酶切(MspI，ApeKI)可以提高RRBS建庫成功率，并且提高覆蓋率。

目前RRBS構(gòu)建測(cè)序文庫時(shí)所需DNA出發(fā)量一般大于100 ng[27]，某些樣本甚至需要到達(dá)1 μg以上[28-29]。然而很多情況下實(shí)驗(yàn)樣本很珍貴，如FFPE樣本或者單細(xì)胞樣本，這樣對(duì)RRBS建庫的要求和難度都大幅度提高，目前對(duì)于少于100 ng的樣本進(jìn)行RRBS建庫缺乏有效的技術(shù)方法，本實(shí)驗(yàn)對(duì)從微量DNA樣品出發(fā)構(gòu)建RRBS文庫進(jìn)行了較為細(xì)致的研究，并試圖找出并建立一種更簡便高效的方法。這對(duì)于拓寬簡化甲基化測(cè)序的應(yīng)用領(lǐng)域有著重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所使用的gDNA來源為實(shí)驗(yàn)室自傳代人類紅白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞，細(xì)胞采用懸浮培養(yǎng)至密度80%(K562細(xì)胞作為一種常見的研究用細(xì)胞系，具有一定代表性，并為保證細(xì)胞狀態(tài)最佳，所以將細(xì)胞培養(yǎng)至密度80%左右。)，培養(yǎng)皿大小100 mm，培養(yǎng)基選用DMEM+10%FBS(胎牛血清)，為保證gDNA來源保持一致，本實(shí)驗(yàn)所用DNA采用一次性提取3個(gè)培養(yǎng)皿的混合K562細(xì)胞所得。

本實(shí)驗(yàn)中，用于驗(yàn)證WB-Method可靠性的人源樣本來源于3位志愿者，常量樣本采用靜脈血200 μL，微量樣本采用少量口腔上皮細(xì)胞(為驗(yàn)證WB-M方案應(yīng)用至真實(shí)人源樣本的可靠性，所以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)采用志愿者自采集樣本。)。

1.2 gDNA提取

gDNA提取方法采用蛋白酶K消化法，將細(xì)胞收集至15 mL離心管中，加入3 mL PBS緩沖液重懸細(xì)胞后，依次加入500 μL蛋白酶K(20 mg/mL)、7 mL 裂解液(SDS、EDTA、Tris-HCl)，放置56 ℃孵育4 h后，1∶1(V/V)加入酚氯仿異戊醇(25∶24∶1)溶液，充分混勻后離心取上清，再按1∶1加入氯仿異戊醇(24∶1)溶液，充分混勻后離心取上清，加入0.8倍體積異丙醇(-20 ℃預(yù)冷)充分混勻后，可見白色團(tuán)狀沉淀，使用槍頭將沉淀撈出，并使用70%乙醇漂洗沉淀2次，干燥揮發(fā)乙醇3 min后，使用Qiagen EB Buffer溶解沉淀。提取的DNA采用Qubit，NanoDrop和電泳進(jìn)行質(zhì)檢。

靜脈血gDNA提取方法使用QiaAmp Blood Mini Kit，按照操作手冊(cè)進(jìn)行DNA提取，大致方法如下：將200 μL靜脈血置于冰水混合物中融化后加入20 μL蛋白酶K和600 μL AL緩沖液，混勻后置于56 ℃水浴15～30 min，裂解產(chǎn)物加入1倍體積乙醇充分混勻后過離心柱，所有產(chǎn)物過離心柱后依次加入AW1、AW2緩沖液洗滌離心柱2次，空氣干燥2～3 min，加入AE緩沖液洗脫DNA，提取的DNA采用Qubit，NanoDrop和電泳進(jìn)行質(zhì)檢。

1.3 MspI酶切條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)使用MspI限制性內(nèi)切酶(NEB，20 U/μL)對(duì)gDNA進(jìn)行酶切處理(因MspI酶切位點(diǎn)CCGG與人類CpG Island序列相似，并且該酶對(duì)甲基化區(qū)域不敏感，可以最大限度的富集CpG Island區(qū)域。)，得到有效的簡化末端。因MspI酶對(duì)溫度不敏感，所以工作中只對(duì)MspI酶的用量和酶切時(shí)間進(jìn)行條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)材料使用8 μg gDNA均分為7份，保證每份gDNA>1 μg，分別對(duì)每份gDNA，在37 ℃下采用不同時(shí)間和不同酶用量進(jìn)行酶切，酶切體積50 μL，酶切完成后，65 ℃變性20 min，取25 μL酶切產(chǎn)物加入6X Loading Dye 5 μL，點(diǎn)2% 瓊脂糖凝膠 100 V 電泳2 h檢測(cè)酶切效率并回收相應(yīng)片段。

1.4 片段大小篩選方法優(yōu)化

片段大小篩選采用2種方法進(jìn)行，分別是瓊脂糖凝膠電泳(加入Carrier DNA)(本實(shí)驗(yàn)中所用的Carrier DNA為完全未甲基化的大腸桿菌DNA，unmethylation DNA，Promega)和磁珠兩步法篩選。

瓊脂糖凝膠電泳(加入Carrier DNA)方案，采用1 μg gDNA MspI 酶切后并進(jìn)行補(bǔ)平和連接測(cè)序接頭所得的連接產(chǎn)物為材料，Carrier DNA采用unmethylation DNA (Promega)covaris打斷至150～300 bp，在連接產(chǎn)物中加入200 ng，不加入Carrier DNA的做為對(duì)照，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，100 V 2h檢測(cè)加入CarrierDNA的效果。

磁珠兩步法篩選大小方案，方案原理基于AMpureXP Beads對(duì)PEG(MW 6 000)的終濃度敏感，從而影響結(jié)合DNA片段大小。本實(shí)驗(yàn)采用1 μg gDNA covaris打斷至100～700 bp作為材料，不同PEG濃度進(jìn)行片段大小篩選，并采用2%瓊脂糖凝膠電泳和BioAnalyzer 2100(毛細(xì)管電泳)進(jìn)行片段大小檢測(cè)。

1.5 常規(guī)RRBS建庫方法

常規(guī)RRBS建庫方法 (Conventional Method, CO-M)(見圖1(a))，采用1 μg，100 ng，50 ng，10 ng gDNA，加1 μL (20 U/μL)MspI(以下所有使用酶試劑及酶反應(yīng)buffer，均使用NEB來源，除特殊標(biāo)注外)酶切 37 ℃ 0.5 h，加入末端修復(fù)反應(yīng)試劑(10× Ligase Buffer 10 μL, 10 nM dNTPs 4 μL, 10 mM ATP 2.5 μL, T4 DNA Polymerase(3 U/μL) 5 μL，T4 PNK(10 U/μL) 5 μL，Klenow Large Fragment(5 U/μL) 1 μL，并補(bǔ)水至100 μL，20 ℃ 孵育30 min，產(chǎn)物用QiaAmp MinElute PCR Kit(Qiagen)進(jìn)行純化并洗脫至30 μL，加入末端加A反應(yīng)試劑(10mmol/L dATP 5 μL，Klenow Buffer 5 μL，5 U/μL Klenow exo-3 μL)，補(bǔ)水至50 μL，37 ℃孵育30 min，產(chǎn)物用QiaAmp MinElute PCR Kit(Qiagen)進(jìn)行純化并洗脫至30 μL，加入測(cè)序接頭連接反應(yīng)試劑(甲基化處理的測(cè)序接頭(Illumina)1 μL，T4 ligase (10 U/μL) 3 μL，10×T4 ligase buffer 5 μL)，加水補(bǔ)充至50 μL，22 ℃孵育15 min，連接產(chǎn)物使用QiaAmp MinElute PCR Kit(Qiagen)進(jìn)行純化并洗脫至75 μL，重亞硫酸鹽CT轉(zhuǎn)化采用Zymo Gold Methylation Kit (Zymo Research)，操作根據(jù)試劑盒說明書并將產(chǎn)物純化至20 μL，加入6× loading dye (Life Technologies)4 μL，2%瓊脂糖凝膠電泳回收150～350 bp片段，膠回收采用QiaAmp MinElute Gel Extraction Kit(Qiagen)，回收至20 μL。加入文庫擴(kuò)增試劑(Illumina Primer Mix 5 μL，2× KAPA uracil+ PCR Ready Mix (KAPA Biosystem) 20 μL，反應(yīng)程序95 ℃ 10 min，擴(kuò)增循環(huán)(95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)(1 μg DNA起始采用 10個(gè)循環(huán)，100 ng DNA及以下采用15個(gè)循環(huán))，72 ℃ 4 min)，得到的PCR產(chǎn)物采用QiaAmp MinElute PCR Kit(Qiagen)進(jìn)行純化至20 μL，Qubit測(cè)定文庫濃度，BioAnalyzer 2100(Agilent)檢測(cè)文庫片段分布。

1.6 EA一步RRBS建庫方法

EA一步建庫方法(EA Method, EA-M)(見圖1(b))，采用100 ng，50 ng，10 ng gDNA，加MspI(以下所有使用酶試劑及酶反應(yīng)buffer，均使用NEB來源，除特殊標(biāo)注外)1 μL酶切 37 ℃ 0.5 h，加入末端修復(fù)反應(yīng)試劑(10× Ligase Buffer 2.5 μL, 10 nmol/L dNTPs 1 μL, 10 mmol/L ATP 2.5 μL, T4 DNA Polymerase (3 U/μL)2.5 μL，T4 PNK(10 U/μL) 2.5 μL, Taq Polymerase(10 U/μL) 1 μL),補(bǔ)水至25 μL，12 ℃15 min，37 ℃ 15 min，72 ℃ 20 min，產(chǎn)物不純化，直接加入測(cè)序接頭連接反應(yīng)試劑(甲基化處理后的測(cè)序接頭(Illumina)1 μL，T4 ligase 3 μL，T4 ligase buffer 1 μL，加水補(bǔ)充至35 μL)，22 ℃孵育15 min，連接產(chǎn)物使用QiaAmp MinElute PCR Kit(Qiagen)進(jìn)行純化并洗脫至75 μL，重亞硫酸鹽CT轉(zhuǎn)化采用Zymo Gold Methylation Kit(Zymo Research) ，操作根據(jù)試劑盒說明書并將產(chǎn)物純化至20 μL，加入6× loading dye(Life Technologies) 4 μL，2%瓊脂糖凝膠電泳回收150～350 bp片段，膠回收采用QiaAmp MinElute Gel Extraction Kit(Qiagen)，回收至20 μL。加入文庫擴(kuò)增試劑(Illumina Primer Mix 5 μL，2× KAPA uracil+ PCR Ready Mix (KAPA Biosystem) 20 μL，反應(yīng)程序95 ℃ 10 min，擴(kuò)增循環(huán)(95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)(1 μg DNA起始采用 10個(gè)循環(huán)，100 ng DNA及以下采用15個(gè)循環(huán))，72 ℃ 4 min)，得到的PCR產(chǎn)物采用QiaAmp MinElute PCR Kit(Qiagen)進(jìn)行純化至20 μL，Qubit測(cè)定文庫濃度，BioAnalyzer 2100(Agilent)檢測(cè)文庫片段分布。

1.7 磁珠包被RRBS建庫方法

磁珠包被RRBS建庫方法 (WB Method, WB-M)(見圖 1(c))，采用100 ng，50 ng，10 ng gDNA，加1 μL MspI酶(以下所有使用酶試劑及酶反應(yīng)buffer，均使用NEB來源，除特殊標(biāo)注外) 37 ℃ 酶切過夜，加入末端修復(fù)試劑(10× Ligase Buffer 10 μL, 10 nmol/L dNTPs 4 μL, 10 mmol/L ATP 2.5 μL, T4 DNA Polymerase(3 U/μL) 5 μL，T4 PNK(10 U/μL) 5 μL, Klenow Large Fragment(5 U/μL) 1 μL),補(bǔ)水至100 μL，20 ℃ 孵育30 min，產(chǎn)物用150 μL Ampure XP Beads(Beckman)純化，純化步驟按照AmpureXP Beads說明書進(jìn)行至揮發(fā)晾干殘留乙醇，加EB Buffer(Qiagen)37 μL，室溫放置1 min，無需去除磁珠，直接加入末端加A反應(yīng)試劑(10 mmol/L dATP 5 μL，Klenow Buffer 5 μL，5 U/μL Klenow exo-3 μL)，37 ℃孵育30 min，產(chǎn)物加入PEG/NaCl(20% PEG8000(Sigma), 9% NaCl(Sigma))溶液 50 μL，重懸磁珠，并按照AmPureXP Beads說明書進(jìn)行至揮發(fā)晾干殘留乙醇，加EB Buffer(Qiagen)41 μL，室溫放置1 min，無需去除磁珠，加入測(cè)序接頭連接反應(yīng)試劑(甲基化處理后的測(cè)序接頭(Illumina)1 μL，T4 ligase(10 U/μL) 3 μL，T4 ligase buffer 5 μL)，加水補(bǔ)充至50 μL，22 ℃孵育15 min，產(chǎn)物加入PEG/NaCl(20% PEG8000, 9% NaCl)溶液 50 μL，重懸磁珠，并按照AmPureXP Beads說明書進(jìn)行至揮發(fā)晾干殘留乙醇，加EB Buffer(Qiagen)75 μL，室溫放置1 min，無需去除磁珠，重亞硫酸鹽CT轉(zhuǎn)化采用Zymo Gold Methylation Kit 并純化至20 μL(本步驟使用Zymo試劑盒自帶純化柱，將磁珠去除)，產(chǎn)物采用AmpureXP Beads 二步篩選法篩選片段大小至150～350 bp之間，采用EB Buffer洗脫至20 μL，加入文庫擴(kuò)增反應(yīng)試劑(Illumina Primer Mix 5μL，2× KAPA uracil+ PCR Ready Mix (KAPA Biosystem) 20 μL，反應(yīng)程序95 ℃ 10 min，擴(kuò)增循環(huán)(95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s)(1μg DNA起始采用 10個(gè)循環(huán)，100 ng DNA及以下采用15個(gè)循環(huán))，72 ℃ 4 min)，得到的PCR產(chǎn)物采用AmpureXP Beads進(jìn)行純化至20 μL，Qubit測(cè)定文庫濃度，BioAnalyzer 2100檢測(cè)文庫片段分布。

圖1 三種RRBS文庫構(gòu)建方法流程圖Fig.1 Three methods for RRBS library construction

1.8 WB-Method驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)使用人來源樣本3例，采用WB-Method分別進(jìn)行微量(10 ng)RRBS和常量(1 μg)RRBS文庫構(gòu)建，并使用Illumina Hiseq 3000平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，每個(gè)樣本測(cè)序20 mol/L reads以上。生物信息分析使用Trim_galore進(jìn)行低質(zhì)量(Q<20)數(shù)據(jù)過濾和去重，bismark進(jìn)行序列比對(duì)，參考基因組選用人類基因組hg19，并對(duì)甲基化頻率分布、甲基化覆蓋度、3種context(CpG、CHG、CHH)下C堿基甲基化比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 gDNA提取及質(zhì)量測(cè)定

gDNA提取方法采用經(jīng)典PK法(細(xì)胞和組織樣本)，全血采用QiaAmp使用Blood Mini Kit，Qubit測(cè)定濃度并計(jì)算K562 gDNA總量為386 μg(Qubit 2.0 HSDNA Assay)，Nanodrop 2000檢測(cè)gDNA純度(OD260/OD280=1.91，OD260/OD230=2.12 )，0.6% 瓊脂糖凝膠檢測(cè)gDNA純度，電泳條帶清晰單一，無降解拖尾條帶，片段均在40 kb以上(見圖2)。人來源的每個(gè)常量樣本均獲得2 μg以上DNA(OD260/OD280=1.94，OD260/OD230=2.08)，微量樣本獲得100 ng以上DNA(OD260/OD280=1.90，OD260/OD230=2.16)，純度均符合質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)(1.82.0)。

圖2 基因組DNA電泳質(zhì)量檢測(cè)Fig.2 gDNA electrophoresis

2.2 MspI酶切條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)提及的3種RRBS文庫構(gòu)建方法都需要使用MspI酶切富集CpG Island位點(diǎn)，所以需要優(yōu)化MspI酶切條件，酶切條件選用37 ℃做為酶切溫度，選擇酶切時(shí)間1 h設(shè)置酶用量10 U，20 U，40 U，再根據(jù)MspI的酶切特性，選擇10 U的酶活設(shè)置酶切時(shí)間條件為0.5 h，1.0 h，2.0 h，4.0 h，O/N(16 h)。通過電泳圖(見圖3)可以看到，酶用量加大和酶切時(shí)間延長并不能讓MspI的酶切效率提高，所以從時(shí)間和成本的角度出發(fā)，酶切條件使用10 U，0.5 h，酶切溫度37 ℃，這里需要說明，10 U的酶切用量已經(jīng)可以將1 μg DNA酶切完整，所以本課題所用100 ng DNA使用10 U，0.5 h，37 ℃的酶切條件完全可以消化完全。

圖3 MspI酶切條件優(yōu)化電泳檢測(cè)Fig.3 MspI digest condition optimization

2.3 片段大小篩選方法優(yōu)化

二代測(cè)序儀在測(cè)序時(shí)需要進(jìn)行成簇反應(yīng)(Cluster Generarion)，成簇反應(yīng)對(duì)DNA片段長度有一定要求，根據(jù)Illumina官方解釋，正常情況下，成簇反應(yīng)需求DNA片段長度在200～500 bp之間，所以文庫片段過大或過小都會(huì)影響成簇反應(yīng)進(jìn)行，這也使得篩選合適的DNA片段大小成為文庫構(gòu)建中不可缺少的一步。另外，片段篩選的另一個(gè)作用是去除接頭二聚體，接頭二聚體對(duì)測(cè)序質(zhì)量會(huì)造成極大影響，據(jù)統(tǒng)計(jì)，5%的測(cè)序接頭二聚體含量會(huì)導(dǎo)致最終數(shù)據(jù)50%的損失。片段篩選最常見的方法是瓊脂糖凝膠電泳，本課題因起始DNA量很少，導(dǎo)致連接反應(yīng)的產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上基本不能顯現(xiàn)，導(dǎo)致切膠時(shí)容易誤判并且膠回收效率降低，所以本文采用了加入Carrier DNA的方式提高辨識(shí)度和膠回收效率，由于在片段大小篩選前，已經(jīng)使用重亞硫酸鹽處理過連接產(chǎn)物，Carrier DNA因不含測(cè)序擴(kuò)增接頭序列，在最終的PCR擴(kuò)增中不會(huì)被擴(kuò)增，所以不會(huì)影響最終的測(cè)序結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)采用加入Carrier DNA和未加入Carrier DNA進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，主要比較在瓊脂糖凝膠(見圖 4(a))上的可辨識(shí)度，圖上可以很清楚的加入Carrier DNA的目的電泳片段區(qū)域(150～350 bp)較未加入Carrier DNA的目的電泳片段區(qū)域清晰，切膠時(shí)可以明顯的將接頭二聚體與目的序列分開，有效提高辨識(shí)度并且在膠回收過程中，提高了回收效率，且Carrier DNA可以填補(bǔ)硅膠柱中的死體積，從而達(dá)到提高回收效率的目的。

使用加入Carrier DNA的方法可以提高膠回收的得率，但微量DNA通過瓊脂糖凝膠后的損失率仍然可達(dá)到50%以上，為了進(jìn)一步減少損失，采用了羧基磁珠(Ampure XP Beads)進(jìn)行文庫大小篩選，篩選原理是因羧基磁珠在PEG的影響下，結(jié)合DNA的能力會(huì)產(chǎn)生變化，PEG含量越高，磁珠可結(jié)合的片段就越多，從片段大小上來看，能結(jié)合的小片段就越多，使用不同濃度的PEG對(duì)打斷后的DNA進(jìn)行篩選，并使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分布(見圖4(b))，由圖中可以看到，12%～15%的PEG濃度已經(jīng)可以滿足RRBS文庫構(gòu)建的需要，為驗(yàn)證該方案的可重復(fù)性，繼續(xù)設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)如下：取1μg Fragment DNA(200～600 bp)，分別用12%/15%篩選和10%/12%篩選，并采用BioAnalyzer進(jìn)行片段大小分析，做1個(gè)重復(fù)(見圖4(c))，從2 100檢測(cè)圖種可以看到，12%/15%可用于RRBS文庫構(gòu)建中的片段大小篩選，與瓊脂糖凝膠分離切膠方法相比，得率和穩(wěn)定性有較大提高(見圖4(c))。

圖4 片段大小篩選方法優(yōu)化Fig.4 Size Selection Optimization

2.4 EA Method 與 Conventional Method比較

EA Method(EA-M)方案主要是將CO-M中的末端修復(fù)及3’端加dA合并成一步，并且在做完末端修復(fù)和3’端加dA之后，直接加入T4 ligase，減少了其中2步純化步驟，從而減少DNA損失。該方法可以將末端修復(fù)及3’端加dA步驟合并使用了Taq Polymerase在72 ℃下可以在3’端加dA的特性，將Taq Polymerase加入到末端修復(fù)的體系中即可實(shí)現(xiàn)3’端加dA的目的，并且將這一步的buffer替換成T4 DNA Ligase Buffer，這就使得在進(jìn)行下一步連接操作時(shí)，不需進(jìn)行純化。本實(shí)驗(yàn)使用100 ng，50 ng，10 ng gDNA，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，共9個(gè)樣本，分別使用CO-M和EA-M進(jìn)行RRBS文庫構(gòu)建，本實(shí)驗(yàn)中PCR控制12個(gè)循環(huán)數(shù)，并使用Qubit測(cè)定并統(tǒng)計(jì)比較2種方法的文庫總量(見圖5(a)) ，CO-M法在處理10 ng，50 ng gDNA時(shí)文庫構(gòu)建失敗，在處理100 ng DNA時(shí)3個(gè)樣本的其中1個(gè)失敗，2個(gè)樣本得率很低，EA-M法在處理10 ng DNA時(shí)得率很低，文庫質(zhì)量差，處理50 ng，100 ng DNA時(shí)已能得到很好的結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)使用1 μg gDNA起始CO-M進(jìn)行RRBS文庫構(gòu)建作為文庫合格的陽性參照，該陽性參照使用Qubit測(cè)定文庫濃度并計(jì)算總量為151.2 ng，并使用BioAnalyzer 2100分別測(cè)定陽性文庫(見圖5(b))和EA-M構(gòu)建的文庫(見圖5(c))，使用EA-M法構(gòu)建的RRBS文庫與陽性對(duì)照文庫相比，大小均分布在200～550之間，沒有接頭二聚體(Adapter dimer)，圖中看到BioAnalyzer2100(Agilent)檢測(cè)出的峰不呈現(xiàn)良好的正態(tài)分布，是因RRBS文庫構(gòu)建中DNA片段化使用MspI酶切產(chǎn)生的酶切末端導(dǎo)致，不會(huì)對(duì)后續(xù)測(cè)序結(jié)果產(chǎn)生任何影響。

圖5 EA-M與CO-M構(gòu)建RRBS文庫比較*Fig.5 EA-M vs CO-M

*注：(a)∶ EA-M和CO-M構(gòu)建RRBS文庫，DNA起始分別使用10 ng，50 ng，100 ng，藍(lán)色*標(biāo)注使用CO-M建庫，紅色*標(biāo)注使用EA-M建庫;(b)∶ CO-M 文庫大小分布;(c)∶ EA-M文庫大小分布。

彩圖見電子版(http∶//swxxx.alljournals.cn.ch/login.aspx)(2017年第1期doi∶10.3969/j.issn.1672-5565.2017.01.201609001)。

2.5 EA Method穩(wěn)定性測(cè)試

根據(jù)EA Method與Conventional Method比較試驗(yàn)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)EA Method在處理50 ng DNA起始量時(shí)，已經(jīng)有很好的效果。為了進(jìn)一步測(cè)試EA Method的穩(wěn)定性，將600 ng gDNA平均分成12份(每份50 ng)，采用EA Method進(jìn)行RRBS文庫構(gòu)建，使用Qubit測(cè)定文庫得率并統(tǒng)計(jì)CV(見圖 6)，發(fā)現(xiàn)EA Method在處理50 ng DNA進(jìn)行RRBS文庫構(gòu)建時(shí)，成功率高，文庫產(chǎn)出也很穩(wěn)定(CV<0.05)。

2.6 WB Method與EA Method比較

由上述研究可以看出，EA-M法對(duì)于微量樣本的處理已初具優(yōu)勢(shì)，但因?yàn)樾枰M(jìn)行切膠和多次DNA轉(zhuǎn)移導(dǎo)致處理50 ng以下的樣本仍比較困難，為了能進(jìn)一步降低DNA出發(fā)量和優(yōu)化文庫質(zhì)量，在磁珠篩選文庫大小方案的啟發(fā)下，建立了全程將DNA與磁珠包被的文庫構(gòu)建方案，該方案的優(yōu)勢(shì)在于，DNA全程與磁珠結(jié)合，大大減少DNA轉(zhuǎn)移的次數(shù)，提高最終有效文庫得率。該方案與CO-M法的步驟基本相同，但在所有的酶反應(yīng)中，DNA都與磁珠結(jié)合在一起進(jìn)行孵育，純化方案中，采用PEG Buffer進(jìn)行結(jié)合和洗脫，在連接反應(yīng)前，使用的PEG濃度均為20%，連接反應(yīng)中采用12%/15%進(jìn)行洗脫，本實(shí)驗(yàn)采用了EA-M法作為對(duì)照，分別取10 ng，50 ng，100 ng做2組重復(fù)，RRBS文庫構(gòu)建完成后，Qubit進(jìn)行測(cè)定并統(tǒng)計(jì)比較2種方法的文庫得率(見圖7(a))，BioAnalyzer 2100分別隨機(jī)抽取2種方法中的1個(gè)文庫進(jìn)行文庫片段大小測(cè)定(見圖7(b),7(c))，發(fā)現(xiàn)WB-M法在處理更微量DNA樣本上比EA有更大的改善，基本可以達(dá)到3倍左右的文庫總量，并且得到的文庫范圍與EA法有高度一致性(見圖7(a)～圖7(c))。

圖6 EA方案穩(wěn)定性測(cè)試Fig.6 EA Method stability test

圖7 WB-M與EA-M構(gòu)建RRBS文庫比較*Fig.7 WB-M vs EA-M

*注：(a)∶ EA-M和CO-M構(gòu)建RRBS文庫，DNA起始分別使用10 ng，50 ng，100 ng，藍(lán)色*標(biāo)注使用CO-M建庫，紅色*標(biāo)注使用EA-M建庫;(b)∶ CO-M 文庫大小分布;(c)∶ EA-M文庫大小分布。

彩圖見電子版(http∶//swxxx.alljournals.cn.ch/login.aspx)(2017年第1期doi∶10.3969/j.issn.1672-5565.2017.01.201609001)。

2.7 WB Method穩(wěn)定性測(cè)試

根據(jù)WB Method與EA Method比較試驗(yàn)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)WB Method在處理10 ng gDNA起始量時(shí)，也有較為滿意的結(jié)果。為了進(jìn)一步測(cè)試WB Method的穩(wěn)定性，將120 ng gDNA均分成12份樣本(每份10 ng)，采用WB Method進(jìn)行RRBS文庫構(gòu)建，使用Qubit測(cè)定文庫得率并統(tǒng)計(jì)CV，發(fā)現(xiàn)WB Method在處理10ng DNA進(jìn)行RRBS文庫構(gòu)建時(shí)，成功率高，文庫產(chǎn)出也很穩(wěn)定(CV<0.05)(見圖 8)。

圖8 WB方案穩(wěn)定性測(cè)試Fig.8 WB Method stability test

2.8 WB-M驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

使用WB-M對(duì)3個(gè)人來源樣本分別進(jìn)行常量(1 μg)RRBS和微量(10 ng)RRBS文庫構(gòu)建，并在Illumina Hiseq3000平臺(tái)上進(jìn)行PE150測(cè)序，每個(gè)樣本至少獲得20 mol/L Reads數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)使用Trim_galore進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量QC(見表1)，可見3個(gè)常量樣本和3個(gè)對(duì)應(yīng)微量樣本的QC結(jié)果一致，得到高質(zhì)量(Q Score>20)數(shù)據(jù)后，再使用Bismark將數(shù)據(jù)比對(duì)至人類參考基因組(hg19版本)，可看到常量與微量對(duì)應(yīng)樣本數(shù)據(jù)Unique Reads均可達(dá)65%(見表1)，再將得到的bam文件統(tǒng)計(jì)各個(gè)位點(diǎn)甲基化位點(diǎn)的甲基化比例及覆蓋度，并比較常量和微量樣本的差異，可見從不同甲基化水平堿基分布來看，微量和常量樣本均符合RRBS文庫的特點(diǎn)，甲基化區(qū)域均富集在Reads的兩頭(見圖9(c),9(d))，并且覆蓋CpG區(qū)域2X以上的reads占比80%以上(見圖9(a),圖9(b))，兩者保持了高度一致。最后統(tǒng)計(jì)了甲基化通常發(fā)生的CpG，CHG，CHH三種不同的context下C堿基的甲基化比例，其中CpG context最常見(見表2)，可以看到常量和微量樣本的甲基化水平也保持一致。

表1 WB方案實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)QC Table 1 WB Method Data QC Analysis

表2 WB方案CpG，CHG，CHH中C堿基甲基化比例Table 2 WB Method MethyC Content In CpG,CHG,CHH %

圖9 WB方案甲基化覆蓋度Fig.9 WB method methylation base coverage

3 討論

隨著表觀遺傳學(xué)研究的深入，二代測(cè)序在甲基化測(cè)序中的研究方法也大幅增多，RRBS(簡化甲基化)測(cè)序以經(jīng)濟(jì)，分辨度高的優(yōu)點(diǎn)在人、小鼠、大鼠的甲基化研究中被高頻使用。RRBS文庫是測(cè)序前樣本處理的關(guān)鍵步驟，其中的核心問題包括：(1)RRBS文庫需要符合MspI酶切的特性；(2)RRBS文庫必須沒有接頭二聚體存在(約125～128 bp)；(3)文庫總量必須滿足二代測(cè)序基本需求(20 ng以上)；(4)實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性(可重復(fù)性)高。本研究中使用的2種改進(jìn)后的基于微量DNA樣品的RRBS文庫構(gòu)建方法，可以很好的解決以上4個(gè)問題，從而滿足RRBS文庫用于后續(xù)測(cè)序的需求。首先，經(jīng)過MspI酶切優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定了MspI酶的最優(yōu)酶切條件，并且在最終文庫中也可以明顯的看到人gDNA被MspI 酶完整酶切的特征序列，并且文庫分布在200～600 bp，有利于在測(cè)序儀上進(jìn)行成簇反應(yīng)(cluster generation)；其次，通過片段大小篩選優(yōu)化方案，切膠純化通過加入carrierDNA 提高膠的辨識(shí)度，從而將接頭二聚體與目的片段間有效分離，磁珠篩選通過不同比例PEG濃度將小片段完整去除，兩種方案都可以有效的將接頭二聚體去除，保證后期測(cè)序數(shù)據(jù)的高質(zhì)量；第三，EA-M法通過末端修復(fù)以及加“A”反應(yīng)，連接合并成一步，大大縮短了步驟，從而提高DNA回收效率，實(shí)現(xiàn)提高最終文庫得率的目的，WB-M法通過將DNA固定在磁珠上的方法減少DNA的被轉(zhuǎn)移次數(shù)，從而提高最終文庫總量，兩種方法分別從減少步驟和減少DNA轉(zhuǎn)移次數(shù)的角度提高了文庫得率，從而實(shí)現(xiàn)10～50 ng微量DNA起始樣品的RRBS文庫構(gòu)建；最后，分別通過2種方法的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，可以看到2種方法的可重復(fù)性很高，成功率基本達(dá)到100%，并且針對(duì)同一個(gè)DNA樣本的重復(fù)性可以達(dá)到CV<0.05的要求，表明這2種方法構(gòu)建RRBS文庫穩(wěn)定性較好，并且WB-M因全程使用磁珠純化，適用于液體工作站上使用，在有效提高建庫規(guī)?；耐瑫r(shí)，有效減少人工參與帶來的建庫誤差。

本研究中最關(guān)鍵的因素在于DNA起始量低，所以根據(jù)不同的DNA起始量，研發(fā)了2種方案，其中EA-M可以針對(duì)50～100 ng的微量DNA樣品的RRBS文庫構(gòu)建，WB-M可以針對(duì)10～50 ng 的微量DNA樣品的RRBS文庫構(gòu)建，然而WB-M方案針對(duì)50～100 ng DNA出發(fā)量時(shí)會(huì)有更好的效果。原因如下：(1)經(jīng)過2個(gè)方案的比較發(fā)現(xiàn)，減少DNA轉(zhuǎn)移次數(shù)可以大大降低DNA在建庫中的損耗及損傷，DNA被固定在磁珠上對(duì)DNA自身也具有一定保護(hù)作用，所以WB-M方案可以有效保證酶切末端，減少在建庫過程中酶切末端的損傷。(2)Unique Reads Ratio(唯一不重復(fù)Reads比例)是二代測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控中的一個(gè)重要指標(biāo)，而影響該指標(biāo)的因素主要是DNA起始量和文庫構(gòu)建中PCR的循環(huán)數(shù)。本課題研究的微量DNA RRBS文庫構(gòu)建方案，起始DNA樣本量少成為影響該指標(biāo)的制約因素，因此如何有效減少文庫構(gòu)建中PCR循環(huán)數(shù)，成為本研究中的關(guān)鍵因素。WB-M可以有效減少DNA損耗，使最終減少PCR循環(huán)數(shù)變成可能，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)50 ng DNA起始樣本量可以將最終PCR循環(huán)次數(shù)降低至10次，10 ng DNA起始可有效降低PCR循環(huán)數(shù)至14次，大大提高測(cè)序數(shù)據(jù)的有效性。經(jīng)過2種方案的比較發(fā)現(xiàn)，WB-M方法在構(gòu)建微量DNA RRBS文庫時(shí)，比CO-M和EA-M更加適合，但EA-M在文庫構(gòu)建時(shí)間上有一定優(yōu)勢(shì)，因?yàn)闇p少了純化和反應(yīng)程序，所以EA-M法構(gòu)建RRBS文庫比其他2種方法減少約1/3時(shí)間。另一方面，從經(jīng)濟(jì)角度來看，EA-M的成本是CO-M的70%左右，WB-M的成本是CO-M的77%左右，所以在進(jìn)行100 ng 左右DNA起始RRBS文庫時(shí)，從時(shí)間和經(jīng)濟(jì)的角度上，推薦使用EA-M法進(jìn)行文庫構(gòu)建，但從質(zhì)量上來看，WB-M法則更為優(yōu)秀。

本研究中因偏重于人來源的微量樣本研究(例如：石蠟切片，顯微微切割等)，所以只使用了人來源的gDNA樣本，后期驗(yàn)證WB-M(因WB-M方案制備的文庫質(zhì)量更優(yōu)于EA-M方案，且在實(shí)際應(yīng)用中WB-M方案更適合檢測(cè)技術(shù)發(fā)展方向，所以本驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)只驗(yàn)證了WB-M方案。)也只使用了人來源樣本，并通過信息學(xué)分析可看到WB-M在同時(shí)處理常量樣本和微量樣本時(shí)，Unique Reads均可達(dá)到65%以上，并且可發(fā)現(xiàn)的CpG context中C堿基甲基化比例也保持高度一致。本研究中提及的WB-M已成功應(yīng)用于顯微微切割樣本的處理。目前還未應(yīng)用于FFPE樣本的處理，從WB-M方案來看，可以適用于FFPE樣本的處理，但在進(jìn)行MspI酶切之后，應(yīng)使用UDG和FpG酶對(duì)FFPE來源DNA進(jìn)行DNA修復(fù)，從而提高文庫構(gòu)建的成功率。隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，單細(xì)胞測(cè)序也廣泛應(yīng)用到醫(yī)療及診斷領(lǐng)域，如PGD，CTCs等，本課題研究中推薦的WB-M方案也可應(yīng)用于單細(xì)胞領(lǐng)域，通過單細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)將單個(gè)細(xì)胞DNA少量擴(kuò)增后，使用WB-M方案進(jìn)行微量DNA樣品的RRBS文庫構(gòu)建，可以獲得高質(zhì)量的RRBS文庫，為后續(xù)測(cè)序及生物信息分析打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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An μLtra-low-input RRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing) library preparation method

WEI Dongkai1,2, NAN Peng2, XU Kangping1, QIU Feng1, 3*

(1.BasePairBio-TechnologyCo.Ltd,JiangSuSuzhou215123,China;2.SchoolofLifeSciencesFudanUniversity,Shanghai200438,China;3.ShanghaicenterforBioinformationtechnology,Shanghai201203,China)

RRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing) is an effective method for DNA methylation study. Library preparation is one of the most critical steps of RRBS experiments. In conventional RRBS library preparation, it usually needs 1 ug or more starting DNA because of less enzyme digested products and losses in various experiment steps. Meanwhile, many clinical samples from patients, such as frozen puncture tissue, FFPE, microdissection, etc., there is only a limited amount of extracted DNA less than 100 ng, and they don’t fit the requirement of the conventional RRBS library preparation, which greatly limits the application field of RRBS technology. This research studies and designs RRBS library preparation using μLtra-low-input DNA samples (<100 ng), mainly by optimizing MspI digestion condition, DNA fragment size selection, reduction of reaction steps and DNA transfer steps in library preparation, which greatly improve the DNA recovery. We set up two effective μLtra-low-input RRBS library preparation methods (EA-Method and WB-Method). The EA-Method is more cost effective, fast, and efficient than WB-Method when DNA input amount around 100 ng, but the library quality is slightly lower than the WB-Method; The WB-Method has higher quality performance when using 10 ng DNA. In order to test the reliability, we construct 3 groups of RRBS libraries (1ug DNA input and 10ng DNA input) from three volunteer samples (whole blood and mouth swab) by WB-Method. The prepared libraries are sequenced on Illumina Hiseq platform. The compatible resμLts are obtained comparing the μLtra-low-input and conventional RRBS method by analysis of detected C bases in the CpG, CHG, CHH methylation rate. Nevertheless, the μLtra-low-input RRBS method can greatly reduce DNA loss and damage during library preparation, and it will be a wider application of RRBS technology to different type samples and promote broader research field of RRBS technology effectively.

NGS; RRBS; Reduced Representation Bisulfite Sequencing; EA-M; WB-M

2016-09-03;

2016-09-20.

魏冬凱，男，碩士研究生，研究方向：高通量測(cè)序技術(shù)及應(yīng)用;E-mail：dkwei@basepair.cn.

*通信作者：裘鋒，男，研究員，研究方向：高通量測(cè)序及液態(tài)活檢； E-mail：qiufeng@scbit.org.

10.3969/j.issn.1672-5565.2017.01.201609001

Q78

A

1672-5565(2017)01-033-13