韋旭欽,李曉明,廖東慶,黃日波

(1. 南寧邦爾克生物技術(shù)有限責(zé)任公司，南寧 530003；2. 廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；3. 廣西科學(xué)院，南寧 530007)

長(zhǎng)野芽孢桿菌普魯蘭酶的同源建模及三維結(jié)構(gòu)分析

韋旭欽1*,李曉明1,廖東慶1,黃日波2,3

(1. 南寧邦爾克生物技術(shù)有限責(zé)任公司，南寧 530003；2. 廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；3. 廣西科學(xué)院，南寧 530007)

普魯蘭酶(Pullulanase)是脫支酶，因其能水解葡聚糖的α-1,6-糖苷鍵而有不同的工業(yè)應(yīng)用潛力。本研究通過(guò)同源建模和分子對(duì)接的方法對(duì)長(zhǎng)野芽孢桿菌(Bacillusnaganoensis) 普魯蘭酶進(jìn)行建模及其三維結(jié)構(gòu)分析，表明該酶由CBM41-X45a-X25-X45b-CBM48-GH13_14多結(jié)構(gòu)域組成，酶蛋白中心形成其催化區(qū)，催化區(qū)的Asp619、Glu648和 Asp733三個(gè)殘基構(gòu)成酶的催化三聯(lián)體。同時(shí)，通過(guò)柔性對(duì)接研究了酶與底物分子相互作用的關(guān)系，并預(yù)測(cè)構(gòu)成酶的活性中心相關(guān)氨基酸殘基，為進(jìn)一步改良酶的特性提供重要的理論依據(jù)。

長(zhǎng)野芽孢桿菌；普魯蘭酶；同源建模；結(jié)構(gòu)分析

普魯蘭酶(Pullulanase，EC 3.2.1.41)是一類水解α-1,6-糖苷鍵脫支酶，因其能專一性水解普魯蘭糖而得名，該酶可以水解支鏈淀粉的α-1,6-糖苷鍵而將淀粉分解為葡萄糖、麥芽糖、果糖等食用甜味劑；在以纖維素和淀粉質(zhì)為原料的生物加工過(guò)程中，葡萄糖淀粉酶類水解直鏈的α-1,4-糖苷鍵，普魯蘭酶專門水解支鏈α-1,6-糖苷鍵，使支鏈淀粉型多糖的分支鏈脫離主鏈，形成一系列鏈長(zhǎng)短不一的直鏈淀粉，可見普魯蘭酶和葡萄糖淀粉酶配合使用，可以顯著提高淀粉類原料的利用率，因此，普魯蘭酶在食品、紡織和生物能源等領(lǐng)域有重要的用途[1]。

不同來(lái)源的普魯蘭酶由于其活性低和穩(wěn)定性差等特點(diǎn)，限制了該類酶的工業(yè)化應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)野芽孢桿菌普魯蘭酶(Bacillusnaganoensispullulanase,BnPulB)的最適反應(yīng)溫度為62.5 ℃，在pH為4.5～5.0范圍內(nèi)保持90%的酶活性，這些酶學(xué)特性與淀粉糖化過(guò)程較高的溫度(55～65 ℃)和微酸性環(huán)境(pH 4.5～5.5)相符合，表明長(zhǎng)野芽孢桿菌普魯蘭酶有更大的工業(yè)應(yīng)用潛力[2]。

同源建模法(Homology model)是從蛋白質(zhì)的氨基酸序列出發(fā)預(yù)測(cè)其三維模型的常用方法，為研究未知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的功能提供基礎(chǔ)，如果目的蛋白與模板蛋白的序列同一性大于60%，同源建模的結(jié)果將接近實(shí)驗(yàn)測(cè)試的結(jié)果[3]。為了進(jìn)一步提高酶的活性和穩(wěn)定性等特性，本研究通過(guò)對(duì)長(zhǎng)野芽孢桿菌普魯蘭酶進(jìn)行同源建模及其結(jié)構(gòu)分析，并預(yù)測(cè)其活性部位和功能位點(diǎn)，為改良酶的性能提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 序列來(lái)源

長(zhǎng)野芽孢桿菌普魯蘭酶BnPulB的蛋白質(zhì)序列來(lái)源于NCBI，該酶是由926個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，其GenBank登陸號(hào)為AEV53626，本研究所采用的6個(gè)普魯蘭酶序列及其晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(見表1)取自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Data Bank, PDB)[4]，序列分析利用DiAlige服務(wù)器(http://www.genomatix.de/)進(jìn)行[5]。

1.2 同源建模與結(jié)構(gòu)分析

將BnPulB蛋白質(zhì)序列提交到在線服務(wù)器SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行自動(dòng)模式搜索和同源建模[6]，用PyMol生物軟件對(duì)其模型進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和作圖。

1.3底物對(duì)接和活性位點(diǎn)分析

用Autodock 4.2生物軟件對(duì)普魯蘭酶BnPulB與底物進(jìn)行柔性對(duì)接及其活性位點(diǎn)分析[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1BnPulB的同源建模

通過(guò)在線服務(wù)器SWISS-MODEL自動(dòng)模式搜索(各參數(shù)為默認(rèn)值)，發(fā)現(xiàn)BnPulB與普魯蘭酶家族的有不同程度的序列同一性(見表1，各酶的PDB編號(hào)分別為2WAN、3WDI、2E9B、2YA0、2YOC和2FHC，aa表示蛋白序列的氨基酸殘基個(gè)數(shù))，其中它與嗜酸普魯蘭芽孢桿菌普魯蘭酶(Bacillusacidopullulyticuspullulanase,BaPul13A)蛋白質(zhì)序列同一性達(dá)64%，以BaPul13A三維結(jié)構(gòu)(PDB：2WAN，1.65?)為模板[8]，對(duì)BnPulB進(jìn)行同源建模，得到N端和C端分別缺失108和8個(gè)氨基酸的并由其Pro109～Gln918區(qū)間氨基酸肽段組成的分子量更小的結(jié)構(gòu)，其QMEAN值僅為-0.01，加上BnPulB蛋白質(zhì)序列與模板BaPul13A的同一性很高，可見BnPulB同源建模的結(jié)果接近實(shí)驗(yàn)測(cè)試的結(jié)果。

表1 BnPulB與6個(gè)有晶體結(jié)構(gòu)的普魯蘭酶序列同一性Table 1 Pairwise sequence identity of BnPulB and 6 known crystal structure pullulanases %

2.2 BnPulB結(jié)構(gòu)分析

將BnPulB模型與BaPul13A的進(jìn)行整體結(jié)構(gòu)比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)酶各殘基的Ca原子空間坐標(biāo)幾乎完全重疊，其總體RMSD 值僅為0.050?，表明BnPulB結(jié)構(gòu)與BaPul13A的結(jié)構(gòu)非常相似，兩者的整體結(jié)構(gòu)幾乎重疊在一起(見圖 1)。

圖 1 普魯蘭酶BnPulB與BaPul13A結(jié)構(gòu)重疊分析*Fig.1 Structural superposition of pullulanase BnPulB and BaPul13A

*注：圖中BnPulB的結(jié)構(gòu)為藍(lán)色，BaPul13A 結(jié)構(gòu)(PDB編號(hào)：2WAN)為粉紅色，BaPul13A催化三聯(lián)體為Asp622、Glu651 和 Asp736三個(gè)氨基酸殘基，對(duì)應(yīng)BnPulB的分別為Asp619、Glu648 和 Asp733.

彩圖見電子版(http://swxxx.alljournals.cn/ch/index.aspx)(2017年第1期DOI:10.3969/j.issn.1672-5565.2017.01.201606002)。

將BnPulB模型與表1中所述的6種普魯蘭酶同時(shí)進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì)(見圖2)，由于它們的序列長(zhǎng)度和序列本身存在較大差異(見表1)，它們的整體結(jié)構(gòu)并不完全重疊(見圖2(a))，但它們的活性中心的結(jié)構(gòu)(底物結(jié)合口袋)卻非常相似(見圖2(b))，其氨基酸殘基高度保守，都由空間坐標(biāo)幾乎重疊的Asp、Glu和Asp三個(gè)殘基構(gòu)成催化三聯(lián)體(見圖2(c))，表明不同來(lái)源的普魯蘭酶在漫長(zhǎng)的家族進(jìn)化過(guò)程中存在未知的可變性，它們整體的序列同一性可能很低，但其催化區(qū)是高度保守的，符合蛋白質(zhì)生物進(jìn)化的基本規(guī)律，可見長(zhǎng)野芽孢桿菌普魯蘭酶的催化區(qū)同樣具有普魯蘭酶家族共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

已有研究表明，BaPul13A是由Asp622、Glu651和Asp736三個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成其催化三聯(lián)體，在CAZY GH13糖苷酶家族中，這三個(gè)位于催化區(qū)的氨基酸殘基非常保守，在酶的催化過(guò)程中，Asp622充當(dāng)進(jìn)攻底物的親核基團(tuán)，Glu651作為廣義的酸堿催化劑，Asp736對(duì)酶-底物復(fù)合物的過(guò)度態(tài)起到穩(wěn)定性的作用[8]。通過(guò)結(jié)構(gòu)比對(duì)分析，可以預(yù)測(cè)，構(gòu)成對(duì)應(yīng)的長(zhǎng)野芽孢桿菌BnPulB催化三聯(lián)體是由Asp619、Glu648和Asp733三個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成(如圖1和圖2(c)所示)，這三個(gè)殘基與表1所述的6種同類普魯蘭酶催化三聯(lián)體的空間坐標(biāo)大致重疊(見圖2(c))，因此這三個(gè)殘基在酶的催化過(guò)程中可能起到與BaPul13A催化三聯(lián)體相似的關(guān)鍵作用。

圖 2 BnPulB與6種普魯蘭酶的結(jié)構(gòu)比對(duì)分析*Fig.2 Structural superposition of BnPulB with 6 known pullulanases

注：圖中BnPulB (藍(lán)色)、2WAN(粉紅色)、3WDI (紅色)、2E9B (青色)、2YA0 (黃色)、2YOC (紅色)、2FHC (灰色)。

彩圖見電子版(http://swxxx.alljournals.cn/ch/index.aspx)(2017年第1期DOI:10.3969/j.issn.1672-5565.2017.01.201606002)。

BaPul13A是由921個(gè)氨基酸殘基組成CBM41-X45a-X25-X45b-CBM48-GH13_14多結(jié)構(gòu)域的蛋白，其中X45a-X25-X45b 的功能未知，CBM48為糖原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，催化結(jié)構(gòu)域GH13_14屬于 CAZY GH13家族，其N端1～100氨基酸為功能未明的結(jié)構(gòu)域CBM41，CBM41高度無(wú)序而無(wú)法模擬其結(jié)構(gòu)[7]。Chen等[9]最新研究表明，刪除BaPul13A酶的CBM41結(jié)構(gòu)域，能有效地提高該酶的可溶表達(dá)和分泌水平，突變酶的活力是野生酶的2.9倍，并且其作用的溫度和pH與野生酶的相當(dāng)，由此可見CBM41結(jié)構(gòu)域是酶分子上冗余的元件，刪除該結(jié)構(gòu)域的突變酶更適合工業(yè)化應(yīng)用。因此，可以推斷，長(zhǎng)野芽孢桿菌普魯蘭酶BnPulB對(duì)應(yīng)的N端1～108氨基酸可能是酶分子上冗余的序列，刪除這個(gè)結(jié)構(gòu)可能得到分子量更小的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定的突變酶。

Wang等[10]近期研究發(fā)現(xiàn)，刪除長(zhǎng)野芽孢桿菌BnPulB酶N端前106個(gè)氨基酸殘基，或C端9個(gè)，或C端36個(gè)殘基的突變體，突變酶的催化溫度和pH沒(méi)有改變，突變酶對(duì)底物親和力和催化效率有不同程度的改觀，與本研究預(yù)測(cè)的結(jié)果基本相符。

通過(guò)結(jié)構(gòu)比對(duì)分析，BnPulB各結(jié)構(gòu)域在酶分子上的氨基酸區(qū)間分布如圖3(a)所示，各結(jié)構(gòu)域在酶空間結(jié)構(gòu)的分布如圖3(b)所示，其中X45a、X25和X45b結(jié)構(gòu)域遠(yuǎn)離酶的催化區(qū)(GH13_14結(jié)構(gòu)域)，它們可能有助于結(jié)合更大分子的底物，與酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有關(guān)；CBM48是糖原結(jié)構(gòu)域，它和催化區(qū)的GH13_14結(jié)構(gòu)域鄰近，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合維持了這個(gè)脫支酶的基本功能。BnPulB的催化三聯(lián)體位于GH13_14結(jié)構(gòu)域，底物位于該結(jié)構(gòu)域的深溝中，GH13_14結(jié)構(gòu)域與酶的催化作用密切相關(guān)，改變這個(gè)結(jié)構(gòu)域的相關(guān)氨基酸可能會(huì)明顯影響酶的活性和催化穩(wěn)定性。Chen等[11]將BaPul13A酶位于GH13_14結(jié)構(gòu)域的3個(gè)氨基酸殘基同時(shí)突變(E518I-S662R-Q706P)，突變體酶在60 ℃的半衰期是野生型的11倍，最適反應(yīng)溫度也從60 ℃提升到65 ℃。由于與BaPul13A酶的空間結(jié)構(gòu)非常相似，若將BnPulB空間位置對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基(E515、A659和L703)進(jìn)行相應(yīng)的突變，也可能得到相應(yīng)性能更穩(wěn)定的突變酶。這種通過(guò)比對(duì)結(jié)構(gòu)類似的(關(guān)鍵位點(diǎn)的氨基酸殘基存在差別)，并經(jīng)過(guò)突變其相應(yīng)關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸殘基來(lái)影響酶功能的方法(類比差別法)，將為酶的分子改良開辟一條新的途徑。

圖 3 長(zhǎng)野芽孢桿菌普魯蘭酶(BnPulB)的三維結(jié)構(gòu)圖*Fig.3 3-D structure of the Bacillus naganoensis pullulanase(BnPulB)

注：圖(b)的BnPulB結(jié)構(gòu)用卡通圖形顯示，結(jié)構(gòu)域X45為黃色，X25的為青色，CBM48為藍(lán)色，GH13_14的為粉紅色，麥芽三糖分子為棍棒模型；圖(c)活性中心鄰近氨基酸殘基以繩形顯示，麥芽三糖(棍棒模型)與氨基酸殘基(粉紅色)形成的氫鍵以虛線顯示。

*彩圖見電子版(http://swxxx.alljournals.cn/ch/index.aspx)(2017年第1期DOI:10.3969/j.issn.1672-5565.2017.01.201606002)。

2.3底物對(duì)接

用軟件Autodock 4.2將底物與酶分子進(jìn)行對(duì)接，將BnPulB的催化三聯(lián)體Asp619、Glu648和Asp733設(shè)定為柔性殘基，經(jīng)分析得到這三個(gè)氨基酸殘基的中心坐標(biāo)，將Gridbox中心設(shè)定為X:39.21，Y:37.82，Z:-29.32，將Gridbox大小設(shè)定為30×52×32(單位?)，格點(diǎn)間距為默認(rèn)值0.375 ?，對(duì)接過(guò)程選擇Lamarckian genetic algorithm (LGA)遺傳算法，其他條件均為默認(rèn)值。由于普魯蘭糖是由α-1,4-糖苷鍵連接的麥芽三糖重復(fù)單位經(jīng)α-1,6-糖苷鍵聚合而成的分子量達(dá)2 萬(wàn)～200 萬(wàn)之間直鏈狀多糖，本研究以構(gòu)成普魯蘭糖單元的麥芽三糖為配體，麥芽三糖分子從厭氧芽孢桿菌 LM18-11(Anoxybacillussp. LM18-11)的同類普魯蘭酶晶體結(jié)構(gòu)(PDB：3WDI)中提取[12]。

分子對(duì)接結(jié)果見圖3(b)，底物分子深埋在酶分子的GH13_14結(jié)構(gòu)域空穴中，底物結(jié)合口袋由多個(gè)氨基酸殘基組成，其結(jié)合自由能為-2.75 kcal/mol，抑制劑常數(shù)Ki=9.58 mM，底物分子的成功對(duì)接，為研究酶與底物的相互作用，研究酶的活性中心及其分子改良奠定了理論基礎(chǔ)。

2.4 活性中心分析

根據(jù)底物對(duì)接的結(jié)果，表明構(gòu)成BnPulB的底物結(jié)合區(qū)和催化區(qū)的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，如圖3(c)所示，由Trp504、Try506、Asn552、His553、Ser583、Thr585、Arg617、Asp619、Leu620、Glu648、Trp650、Thr651、Arg681、Val688、Tyr728、Ser731、His732、Asp733、Asn734和Asn788 20個(gè)氨基酸殘基組成酶的活性中心，其中催化區(qū)直接與麥芽三糖形成的氫鍵的有Ser583、Asp619、Glu648、Trp650、Asp733和Asn734 6個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基，其催化三聯(lián)體由Asp619、Glu648和Asp733 3個(gè)氨基酸殘基組成，這3個(gè)殘基在同類酶中高度保守(見圖2(c))，直接突變這些位點(diǎn)，可能使酶失去活性，因此，可以考慮對(duì)構(gòu)成其活性中心的其他非形成氫鍵的殘基著手，進(jìn)行適當(dāng)?shù)耐蛔儊?lái)優(yōu)化其底物結(jié)合口袋和催化區(qū)的結(jié)構(gòu)，從而提高酶的催化效率；也可以通過(guò)研究與活性中心鄰近(5～15 ?)的氨基酸殘基來(lái)優(yōu)化酶的構(gòu)象或微環(huán)境來(lái)改善酶的特性[13]。

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)長(zhǎng)野芽孢桿菌普魯蘭酶BnPulB進(jìn)行同源建模，構(gòu)建了BnPulB蛋白的三維結(jié)構(gòu)。通過(guò)理論模擬表明，該普魯蘭酶具有CBM41-X45a-X25-X45b-CBM48-GH13_14多結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，其催化區(qū)位于GH13_14結(jié)構(gòu)域，它的催化三聯(lián)體由Asp619、Glu648和Asp733三個(gè)氨基酸殘基組成，符合已知同類普魯蘭酶結(jié)構(gòu)的相關(guān)特性；酶與底物對(duì)接及其活性中心的預(yù)測(cè)和分析表明，普魯蘭酶家族的底物結(jié)合口袋非常相似，BnPulB與底物形成氫鍵的氨基酸殘基為Ser583、Asp619、Glu648、Trp650、Asp733和Asn734，突變這些殘基可能使酶失去活性，所以在分子改良時(shí)，可考慮對(duì)BnPulB活性中心沒(méi)有形成氫鍵的殘基著手來(lái)改良酶的特性。本文的研究方法具有操作簡(jiǎn)單和直觀易懂等特點(diǎn)，理論成果對(duì)酶的分子改良有一定的參考意義，其不足之處是在同類酶非保守區(qū)或非同源性蛋白的預(yù)測(cè)可能存在較大偏差，其研究方法和理論成果還有待更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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Homology modeling and three-dimensional structure analysis ofBacillusnaganoensispullulanase

WEI Xuqin1*, LI Xiaoming1, LIAO Dongqing1, HUANG Ribo2,3

(1.GuangxiNanningBiocloneBiotechnologyCo.,Ltd.,Nanning530003,China;2.CollegeofLifeScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning530004,China;3.GuangxiAcademyofSciences,Nanning530007,China)

Pullulanase is a debranching enzyme that specifically hydrolyzes the α-1,6-glycosidic bonds in complex carbohydrates and has great potential in various industries. Here, we investigate the structural characteristics of theBacillusnaganoensispullulanase (BnPulB) by homology modeling and molecule docking. Results show that theBnPulB structure comprises the CBM41-X45a-X25-X45b-CBM48-GH13_14 multi-domain architecture and the central region of the protein forms the catalytic domain, and the highly conserved Asp619, Glu648, and Asp733 residues are identified to be catalytic triad. In addition, flexible docking studies of the enzyme-substrate system show the interactions betweenBnPulB and its substrate, maltotriose, and some conserved residues locate in the active centre that participate in ligand binding site are predicted. This study may provide important information for the design of new pullulanase with novel properties.

Bacillusnaganoensis;Pullulanase; Homology modeling; Structure analysis

2016-06-18 ；

2016-09-08.

南寧市科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目 (20146371)。

10.3969/j.issn.1672-5565.2017.01.201606002

Q514

A

1672-5565(2017)01-027-06

*通信作者：韋旭欽，男，理學(xué)博士，高級(jí)工程師，研究方向：微生物發(fā)酵與分子酶工程；E-mail:xqweigxu@163.com.