趙 丹, 馮 峰, 粟有志, 張菁楠, 于 蓮, 蘇 瑾*, 張 峰*

(1. 佳木斯大學(xué)藥學(xué)院, 黑龍江 佳木斯 154000; 2. 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,食品安全研究所, 北京 100176; 3. 伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局, 新疆 伊寧 835000)

研究論文

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定螺旋藻多糖的單糖組成

趙 丹1,2, 馮 峰2, 粟有志3, 張菁楠1, 于 蓮1, 蘇 瑾1*, 張 峰2*

(1. 佳木斯大學(xué)藥學(xué)院, 黑龍江 佳木斯 154000; 2. 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,食品安全研究所, 北京 100176; 3. 伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局, 新疆 伊寧 835000)

建立了同時(shí)測(cè)定螺旋藻多糖水解產(chǎn)物中鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、甘露醇、核糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸12種糖類(lèi)化合物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。螺旋藻樣品經(jīng)超聲波輔助提取,用三氟乙酸水解,經(jīng)Waters Acquity BEH Amide色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)分離,以10 mmol/L甲酸銨和10 mmol/L甲酸銨-乙腈為流動(dòng)相,在電噴霧電離源負(fù)離子(ESI-)模式下,用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)。結(jié)果表明,12種糖類(lèi)化合物的定量限為0.005～0.15 mg/kg,線性范圍為0.05～5 mg/L。按照樣品中每種糖本底含量的50%、100%、150%進(jìn)行添加,回收率為80.21%～121.6%。應(yīng)用該方法對(duì)螺旋藻樣品進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn):大部分樣品都能檢測(cè)到巖藻糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、木糖、核糖,含量在0.3～889.4 mg/g之間。此外,測(cè)定的15個(gè)樣品中巖藻糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、木糖、核糖是共有組分,含量差異較大,但在所有樣品中均未檢測(cè)到甘露醇和甘露糖。該方法的建立可為闡明螺旋藻多糖的結(jié)構(gòu)組成及其活性提供技術(shù)支撐及基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;單糖;多糖;螺旋藻;質(zhì)量評(píng)價(jià)

多糖是生物體內(nèi)重要的生物大分子。近年來(lái)的研究[1,2]表明,多糖有特殊的生物活性,能提高機(jī)體的免疫功能,在預(yù)防醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、保健食品等方面發(fā)揮重大作用。人們對(duì)多糖的早期研究多集中于藥用植物類(lèi),如黃芪、靈芝多糖等的活性研究。隨著海洋藥物的興起,對(duì)螺旋藻多糖的活性研究已成為目前研究的重點(diǎn)。測(cè)定螺旋藻多糖的單糖組成對(duì)其活性分析和質(zhì)量控制具有重要意義。

目前,對(duì)多糖的測(cè)定方法有:硅膠薄層層析法[3],通過(guò)苯酚-硫酸、蒽酮-硫酸等顯色反應(yīng)的分光光度法[4-6],衍生化的氣相色譜[7]或液相色譜-紫外檢測(cè)法[8-10],液相色譜-蒸發(fā)光檢測(cè)或示差熒光檢測(cè)法[11,12],離子色譜-電化學(xué)檢測(cè)法[13-15]等。上述方法盡管可以粗略測(cè)定多糖的總含量,但用于測(cè)定多糖中單糖組成則存在準(zhǔn)確度低、分離度差、操作繁瑣等缺點(diǎn)。近年來(lái),質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展為糖類(lèi)化合物的分析提供了一個(gè)強(qiáng)有力的分析手段。王川丕等[16]建立了利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定茶葉中8種單糖和寡糖的方法。然而,該方法檢測(cè)的糖的種類(lèi)偏少,此外,方法的基質(zhì)也僅限于茶葉。本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定螺旋藻多糖中12種單糖組成的檢測(cè)方法,成功應(yīng)用于市售實(shí)際螺旋藻產(chǎn)品的單糖組分分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

鼠李糖(rhamnose)、木糖(xylose)、阿拉伯糖(arabinose)、果糖(fructose)、甘露糖(mannose)、葡萄糖(glucose)、半乳糖(galactose)、甘露醇(mannitol)、核糖(ribose)、巖藻糖(fucose)(純度>95%,德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司);葡萄糖醛酸(glucuronic acid)、半乳糖醛酸(galacturonic acid)(純度>95%,美國(guó)U. S. Pharma-copoeia公司);乙腈、甲醇(色譜純,美國(guó)Fisher Scientific公司)、甲酸銨(色譜純,中國(guó)Aladdin公司);三氟乙酸(TFA,純度>99%,中國(guó)J&K Scientific公司)。

AB 5500型三重四極桿質(zhì)譜,配有ESI源(美國(guó)AB公司); Acquity超高效液相色譜(美國(guó)Waters公司); Milli-Q去離子水發(fā)生器(美國(guó)Millipore公司); KQ-500DE型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司); DKN612C型烘箱(日本雅瑪拓公司); AllegraTMX-22R型離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司)。XBridge Amide色譜柱(150 mm×4.6 mm, 3.5 μm)、Acquity BEH HILIC色譜柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)和Acquity BEH Amide色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)(美國(guó)Waters公司), Inertsustain NH2色譜柱(100 mm×2.1 mm, 3 μm,日本島津公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取100 mg標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.1 mg),用乙腈-水(1∶1, v/v)配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中備用。并用乙腈-水(1∶1, v/v)稀釋成質(zhì)量濃度為10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液,用于質(zhì)譜條件優(yōu)化。

移取1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,添加適量乙腈-水(1∶1, v/v),稀釋成系列質(zhì)量濃度(0.05～5 mg/L)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品處理

稱(chēng)取0.5 g的螺旋藻粉末,加12.5 mL水,于40 ℃水中以400 W超聲提取40 min,離心。取上清液,加水超聲離心過(guò)程重復(fù)2次,合并上清液,定容到100 mL。取2 mL定容后的溶液加入Sevage溶液(正丁醇-氯仿,1∶5, v/v)萃取多次以除去蛋白質(zhì),直至兩相間無(wú)乳白色絮狀物。取上清液,按照1∶1的體積比加入2 mol/L三氟乙酸溶液,放入120 ℃恒溫干燥箱中水解3 h,水解液加入甲醇洗滌后氮吹,甲醇洗滌和氮吹過(guò)程重復(fù)3次,將三氟乙酸除去,用1 mL水復(fù)溶后再經(jīng)0.22 μm水相濾膜過(guò)濾,上機(jī)分析。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱:Acquity BEH Amide柱;流動(dòng)相:10 mmol/L甲酸銨溶液(流動(dòng)相A)和10 mmol/L甲酸銨-乙腈溶液(流動(dòng)相B);流速:0.2 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL;柱溫:30 ℃。梯度洗脫程序:0～7.50 min, 90%B～80%B; 7.50～9.50 min, 80%B～60%B; 9.50～9.51 min, 60%B～90%B; 9.51～13.00 min, 90%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源:ESI-;離子源溫度:500 ℃;掃描方式:負(fù)離子模式;霧化氣GS1壓力:380 kPa;輔助氣GS2壓力:414 kPa;毛細(xì)管?chē)婌F電壓:-5.5 kV;入口電壓:-10 V;出口電壓:-13 V。12種糖的質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表1。

表 1 12種糖的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、去簇電壓和碰撞氣能量

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲輔助提取多糖方法的優(yōu)化

已有研究[17,18]表明,對(duì)于分析物中多糖的提取,超聲輔助提取法的效果要優(yōu)于常規(guī)加熱提取法。為此,本研究重點(diǎn)對(duì)超聲輔助提取方法中的超聲時(shí)間、超聲功率、提取溫度、提取次數(shù)、液料比5個(gè)影響因素進(jìn)行了優(yōu)化,測(cè)定了巖藻糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、木糖、核糖8種單糖的總糖提取率。結(jié)果如圖1所示,最佳提取條件為提取2次,超聲功率為400 W,提取溫度為40 ℃,超聲時(shí)間為40 min,液料比(體積質(zhì)量比)為25 mL/g。

圖 1 (a)提取次數(shù)、(b)超聲功率、(c)提取溫度、(d)超聲時(shí)間、 (e)液料比對(duì)螺旋藻多糖中單糖提取率的影響(n=3) Fig. 1 Effects of (a) extraction times, (b) ultrasonic power, (c) extraction temperature, (d) ultrasonic time, (e) water/material ratio on the extraction efficiency of monosaccharides from spirulina polysaccharides (n=3)

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

單糖或寡糖富含羥基,屬于高親水的化合物,并且由于羥基的位點(diǎn)不同而有許多同分異構(gòu)體。本研究中擬檢測(cè)的12種單糖包含4組同分異構(gòu)體:組1包括甘露糖、半乳糖、葡萄糖、果糖;組2包括巖藻糖、鼠李糖;組3包括阿拉伯糖、木糖、核糖;組4包括葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。比較了XBridge Amide柱、Acquity BEH HILIC柱、Inertsustain NH2柱和Acquity BEH Amide柱4款親水色譜柱對(duì)12種糖的分離效果。以10 mmol/L甲酸銨-乙腈作為流動(dòng)相,每種色譜柱在最優(yōu)條件下對(duì)化合物進(jìn)行分離。以組1為例,結(jié)果如圖2所示,使用Acquity BEH HILIC柱和Inertsustain NH2柱時(shí),4種同分異構(gòu)體均沒(méi)有完全分開(kāi);使用XBridge Amide柱與Acquity BEH Amide柱時(shí),4種同分異構(gòu)體都得到了分離,但使用XBridge Amide柱時(shí),峰形較差。故選擇Acquity BEH Amide柱作為分析柱。

圖 2 半乳糖、甘露糖、葡萄糖、果糖在不同色譜柱中的總離子流圖Fig. 2 Total ion chromatograms of galactose, mannose,glucose and fructose with different chromatographic columns a. XBridge Amide column; b. Acquity BEH HILIC column; c. Inertsustain NH2 column; d. Acquity BEH Amide column. Peaks: 1. mannose; 2. glucose; 3. fructose; 4. galactose.

2.2.2 流動(dòng)相添加劑的選擇

液相色譜-質(zhì)譜法分析樣品時(shí),在流動(dòng)相中添加適量的緩沖鹽可調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值,提高分析的靈敏度,改善峰型,提高分離度。由于使用Acquity BEH Amide柱時(shí),12種糖類(lèi)化合物得到了分離,但未達(dá)到基線分離,因此考慮在流動(dòng)相中添加適量的緩沖鹽。本試驗(yàn)考察了10 mmol/L甲酸銨-10 mmol甲酸銨乙腈、0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)氨水-0.1%氨水乙腈、10 mol/L乙酸銨-10 mmol乙酸銨3種流動(dòng)相對(duì)分離的影響。結(jié)果如圖3所示,以組1為例,3種添加劑對(duì)4種糖的分離效果影響較大。添加劑為氨水時(shí),甘露糖和果糖沒(méi)有得到很好的分離,且出峰較晚;添加劑為乙酸銨時(shí),只出現(xiàn)3個(gè)峰,且峰較寬;添加劑為甲酸銨時(shí),4種糖得到了分離,雖然果糖、葡萄糖未達(dá)到基線分離,但不影響定量。流動(dòng)相中添加氨水和乙酸銨并未改善分離度。因此,本試驗(yàn)選擇甲酸銨作為流動(dòng)相的添加劑。

圖 3 半乳糖、甘露糖、葡萄糖、果糖在不同流動(dòng)相中的總離子流圖Fig. 3 Total ion chromatograms of galactose, mannose, glucose and fructose in different mobile phases a. 10 mmol/L ammonium formate-10 mmol/L ammonium formate/acetonitrile solution; b. 0.1% (v/v) ammonia 0.1% (v/v) ammonia/acetonitrile solution; c. 10 mmol/L ammonium 10 mmol/L ammonium acetate/acetonitrile acetate solution. Peaks: 1. mannose; 2. glucose; 3. fructose; 4. galactose.

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液,通過(guò)針泵進(jìn)樣,在負(fù)離子檢測(cè)方式下進(jìn)行母離子全掃描,得到葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖等的分子離子峰,以每種糖的分子離子峰為母離子,進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,采集全掃描的二級(jí)質(zhì)譜圖,得到碎片離子信息,再對(duì)每種糖的二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,使每種糖的定性離子與定量離子產(chǎn)生的離子對(duì)強(qiáng)度達(dá)到最大時(shí)為最佳,得到最佳質(zhì)譜參數(shù)(見(jiàn)表1)。經(jīng)過(guò)色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化,得到12種糖的MRM色譜圖(見(jiàn)圖4)。

圖 4 12種糖的MRM色譜圖Fig. 4 MRM chromatograms of 12 carbohydrates Peaks: 1. ribose; 2. xylose; 3. arabinose; 4. fucose; 5. rhamnose; 6. mannitol; 7. mannose; 8. glucose; 9. fructose; 10. galactose; 11. glucuronic acid; 12. galacturonic acid.

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1 線性關(guān)系、檢出限、定量限

在優(yōu)化好的色譜條件下,對(duì)12種糖類(lèi)化合物在0.05～5 mg/L范圍內(nèi)進(jìn)行了考察,分別以信噪比(S/N)為3和10時(shí)的質(zhì)量濃度為檢出限和定量限。阿拉伯糖、巖藻糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、果糖、半乳糖的線性范圍為0.1～5 mg/L,核糖、木糖、甘露醇、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸的線性范圍為0.05～2 mg/L。12種糖的檢出限為0.002～0.05 mg/L,定量限為0.005～0.15 mg/kg(見(jiàn)表2)。

2.4.2 回收率和精密度

稱(chēng)取0.5 g螺旋藻樣品,加入12種糖的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。通過(guò)對(duì)實(shí)際樣品的測(cè)定,樣品中含有巖藻糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、木糖、核糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸10種單糖,未找到陰性樣品,因此,按照樣品中每種糖本底含量的50%、100%、150% 3個(gè)水平添加標(biāo)準(zhǔn)溶液,螺旋藻樣品中不含有的甘露醇和甘露糖添加水平為10、20、30 μg/kg。按照樣品處理方法制備后進(jìn)行測(cè)定。加標(biāo)處理后的樣品溶液在一天內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次并計(jì)算RSD,即日內(nèi)精密度；重復(fù)測(cè)定5天并計(jì)算RSD,即日間精密度。平均加標(biāo)回收率為80.21%～121.6%,日內(nèi)精密度和日間精密度分別為1.3%～4.8%和1.2%～5.0%(見(jiàn)表3),表明方法準(zhǔn)確度好,精密度高,可對(duì)螺旋藻樣品進(jìn)行測(cè)定。

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

應(yīng)用建立的UPLC-MS/MS方法對(duì)市售的螺旋藻樣品進(jìn)行了分析(見(jiàn)表4)。結(jié)果表明,所有螺旋藻樣品均含有巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、核糖8種單糖成分,這些單糖的含量在0.3～889.4 mg/g之間,另外在個(gè)別樣品中檢出了葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸,它們的含量在5.1～420.4 mg/g之間。多種單糖在不同樣品中含量差異較大,例如,核糖的含量在4.9～368.6 mg/g之間。此外,在這些樣品中檢測(cè)到了果糖,之前未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。不同樣品中糖含量的差異可能與螺旋藻的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān),還需進(jìn)一步的研究。

表 2 12種糖的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限和定量限

Y: peak area;X: mass concentration, mg/L.

表 3 螺旋藻樣品中12種糖的加標(biāo)回收率及精密度(n=5)

表 4 實(shí)際螺旋藻樣品的檢測(cè)結(jié)果(n=3)

ND: not detected.

3 結(jié)論

本研究建立了一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)12種糖類(lèi)化合物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單,準(zhǔn)確度高。應(yīng)用于螺旋藻樣品的檢測(cè)結(jié)果表明,多種單糖在不同樣品中含量差異較大。該方法的建立可為闡明螺旋藻多糖的結(jié)構(gòu)組成及其活性提供技術(shù)支撐及基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Determination of monosaccharide inSpirulinapolysaccharide by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

ZHAO Dan1,2, FENG Feng2, SU Youzhi3, ZHANG Jingnan1,YU Lian1, SU Jin1*, ZHANG Feng2*

(1.CollegeofPharmacy,JiamusiUniversity,Jiamusi154000,China;2.InstituteofFoodSafety,ChineseAcademyofInspection&Quarantine,Beijing100176,China;3.YiliEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Yining835000,China)

An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was developed for the determination of 12 carbohydrates in hydrolysate ofSpirulinaincluding rhamnose, xylose, arabinose, fructose, mannose, glucose, galactose, mannitol, ribose, fucose, glucuronic acid and galacturonic acid. Samples were extracted with deionized water using ultrasonic-assisted extraction (UAE) and hydrolysis by trifluoroacetic acid (TFA). The hydrolysate was separated on a Waters Acquity BEH Aminde column (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm) using 10 mmol/L ammonium formate/water-10 mmol/L ammonium formate/acetonitrile solution as the mobile phase. The electrospray ionization tandem quadrupole mass spectrometric analysis was carried out in the negative ion mode using multiple reaction monitoring (MRM). The limits of detection were 0.005-0.15 mg/kg and the linear ranges were 0.05-5 mg/L. The average recoveries were 80.21%-121.6% at the spiked levels of the carbohydrates contents of 50%, 100% and 150% found in samples. The method was applied to analyze the samples ofSpirulina. Fucose, galactose, arabinose, rhamnose, glucose, fructose, xylose, and ribose were detected in most of the samples, and their contents were in the range of 0.3-889.4 mg/g. The type and content of carbohydrates that can be detected in the sample were significantly different. Common characteristic peaks were identified as fucose, galactose, arabinose, rhamnose, glucose, fructose, xylose, ribosethe. However, mannitol and mannose were not detected in all samples. This developed method could provide technical support and basic data for the study of structure and activity of polysaccharide fromSpirulina.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); monosaccharide; polysaccharide;Spirulina; quality evaluation

10.3724/SP.J.1123.2016.09038

2017-09-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81274101).

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 81274101).

O658

A

1000-8713(2017)04-0413-08

* 通訊聯(lián)系人. E-mail:sj0129@163.com(蘇瑾);E-mail:fengzhang@126.com(張峰).