童鴻斌, 童海江, 盧德趙*

(1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué), 浙江 杭州 310053; 2. 紹興第二醫(yī)院檢驗(yàn)科, 浙江 紹興 312000)

研究論文

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測血清中15種甾體激素的動(dòng)態(tài)變化

童鴻斌1, 童海江2, 盧德趙1*

(1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué), 浙江 杭州 310053; 2. 紹興第二醫(yī)院檢驗(yàn)科, 浙江 紹興 312000)

建立了用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測血清中15種甾體激素的方法。在血清樣品中加入含內(nèi)標(biāo)的乙腈沉淀蛋白質(zhì)后,用100 mmol/L鹽酸羥胺衍生,經(jīng)Agilent-C18柱(50 mm×3.0 mm, 2.7 μm)分離,內(nèi)標(biāo)法定量。質(zhì)譜分析采用電噴霧電離(ESI)正離子掃描,多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測。數(shù)據(jù)顯示,13種激素在0.05～20 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(相關(guān)系數(shù)(R2)不小于0.995 6),檢出限不大于1 ng/mL;皮質(zhì)醇及脫氫表雄酮硫酸酯在50～2 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2不小于0.997 9),檢出限不大于0.5 ng/mL。將該方法應(yīng)用于女性月經(jīng)周期激素變化規(guī)律的研究,結(jié)果表明，15種甾體激素在一個(gè)完整的月經(jīng)周期內(nèi)有不同特征的動(dòng)態(tài)變化，其中雄激素在濾泡期的后期達(dá)到最高值，孕(雌)激素在黃體期達(dá)到最高值，而皮質(zhì)激素則波動(dòng)不明顯。該方法靈敏度高、重復(fù)性好，為臨床診療提供了參考。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;激素;月經(jīng)周期

女性的體內(nèi)激素水平不僅與生殖息息相關(guān)[1,2],其失衡還與高雄激素血癥及腎上腺酶失活等多種疾病具有緊密的聯(lián)系[3,4]。然而,由于激素水平受到個(gè)體差異及物理、病理等因素的影響[5],因此難以對其進(jìn)行準(zhǔn)確衡量。此外,女性體內(nèi)的激素還受到生理周期的影響,如雌二醇及孕酮在女性月經(jīng)周期內(nèi)具有顯著的波動(dòng)[6],且卵巢周期性分泌的激素水平與乳腺生理性結(jié)構(gòu)改變相關(guān)[7]。然而,激素水平的波動(dòng)直接影響臨床診斷結(jié)果的判斷,何時(shí)對女性體內(nèi)各種激素進(jìn)行檢測是一個(gè)非常重要的科學(xué)問題[8]。

目前的研究表明,雖有對女性周期內(nèi)激素如黃體生成激素、卵泡生成激素、雌二醇及孕酮等在月經(jīng)周期內(nèi)波動(dòng)變化的報(bào)道,然而研究的激素種類有限[8-10]。同時(shí),這類研究大部分是基于酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)或者放射免疫分析(radioimmunoassay, RIA)等間接檢測方法[10-13]。已有多篇報(bào)道指出,間接檢測方法由于受到基質(zhì)效應(yīng)、交叉反應(yīng)等影響[14-16],相較于GC-MS、LC-MS等方法,檢測值明顯偏高[17]。另外,間接方法的檢測結(jié)果還受到試劑盒品牌的影響[14],導(dǎo)致不同醫(yī)院之間的結(jié)果不完全一致,造成了一定的資源浪費(fèi)。

HPLC、GC-MS等方法是近年來開發(fā)的檢測更為靈敏、檢出限更低的方法,其雖然能夠檢測體內(nèi)的激素,然而這兩類方法在樣本前處理上比較復(fù)雜。另外,激素本身低揮發(fā)性的化學(xué)特性也限制了GC-MS的應(yīng)用。相較于GC-MS, LC-MS不僅更加適用于分析難揮發(fā)性物質(zhì),同時(shí)兼具分離速度快、結(jié)果重復(fù)性高和檢測靈敏度高等特點(diǎn),近年來在激素檢測方面應(yīng)用較為廣泛。Keelan等[18]運(yùn)用LC-MS/MS方法檢測了1 415例單胎妊娠新生兒臍帶血中的雄激素水平,發(fā)現(xiàn)該類樣本中雄激素受到胎兒、母體及產(chǎn)科相關(guān)其他因素的影響。周雪妍等[19]開發(fā)了血清中雌酮、雌二醇的LC-MS檢測方法,并應(yīng)用該方法對不同月經(jīng)周期狀態(tài)下的雌酮和雌二醇進(jìn)行測定。Haring等[20]及Damgaard-Olesen等[21]則主要進(jìn)行了男性血清中激素的研究。Keefe等[22]比較了月經(jīng)周期內(nèi)多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)患者與正常人13種激素水平的差異,但是,該研究并未闡明女性月經(jīng)周期內(nèi)甾體激素的變化情況。目前,也未見其他較全面的關(guān)于女性月經(jīng)周期甾體激素的相關(guān)報(bào)道。

本研究開發(fā)了一種同時(shí)檢測人體血清中15種甾體激素的LC-MS檢測方法,對女性周期內(nèi)的激素進(jìn)行了全面的檢測,以期確立女性激素檢測的合理時(shí)間窗口,并為臨床研究提供基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

Agilent 1290液相色譜儀,Agilent 6495質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)。

睪酮(testosterone, T)、孕酮(progesterone, P4)、17α-羥孕酮(17α-hydroxyprogesterone, 17-OHP)、皮質(zhì)醇(cortisol, CORT)、11-脫氧皮質(zhì)醇(11-deoxycortisol, S)、皮質(zhì)酮(corticosterone, F)、雄烯二酮(androstenedione, Adione)、還原膽烷醇酮(etiocholanolone, Etio)、脫氧皮質(zhì)酮(deoxy-corticosterone, DOC)、二氫睪酮(dihydrotestosterone, DHT)、脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone, DHEA)、雄酮(androsterone, Andro)、孕烯醇酮(pregnenolone, P5)、雌酮(estrone, E1)、脫氫表雄酮硫酸酯(dehydroepiandrosterone sulfate, DHEAS)購自Sigma Aldrich(德國); d3-T、d9-P4、d8-17-OHP、d4-F、d3-DHT、d6-DHEA、d4-E1及d6-DHEAS購自Toronto Research Chemicals Inc公司(加拿大)。HPLC純的甲醇、乙腈購自Merck公司(德國);其他試劑為分析純,購自國藥集團(tuán)(上海)。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水(CNW公司)。

1.2 含內(nèi)標(biāo)沉淀劑及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

含內(nèi)標(biāo)沉淀劑：取適量同位素標(biāo)準(zhǔn)品溶于乙腈配制成高濃度混合內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，于-20 ℃下保存，用時(shí)將儲(chǔ)備液用乙腈稀釋成含內(nèi)標(biāo)沉淀劑，其中,d3-T、d9-P4、d8-17-OHP的質(zhì)量濃度為2 ng/mL; d4-F、d3-DHT、d6-DHEA、d4-E1、d6-DHEAS的質(zhì)量濃度分別為50、3、6、0.1、500 ng/mL。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制:準(zhǔn)確稱取13種激素(除CORT及DHEAS)標(biāo)準(zhǔn)品100 mg,分別用甲醇定容至10 mL,再混合成各激素均為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;根據(jù)實(shí)際樣本的情況,CORT及DHEAS需要配制到較高濃度,因此這2種化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液單獨(dú)配制,其質(zhì)量濃度為10 μg/mL;所有儲(chǔ)備液都保存于-20 ℃,存放時(shí)間不超過6個(gè)月。分別取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用甲醇分別定容至1 mL,得到不同質(zhì)量濃度的參比溶液(R1～R6)。其中,13種激素(除CORT及DHEAS)的質(zhì)量濃度分別為0.05、0.5、2、5、10、20 ng/mL; CORT及DHEAS的質(zhì)量濃度分別為50、200、300、600、1 000、2 000 ng/mL。

1.3 樣本采集及前處理

血清采集自2015年9～10月25例年齡為22～47周歲的女性志愿者,其中20～25歲13例,26～30歲6例,大于30歲6例。各年齡段的身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)計(jì)算通過體重(kg)除以高度(m)的平方獲得,其數(shù)值分別為20.98±0.31、21.62±0.50及21.67±0.45。排除標(biāo)準(zhǔn):吸煙史、酗酒史、正在減肥者、內(nèi)分泌紊亂者以及參與高強(qiáng)度體育鍛煉者。研究從女性月經(jīng)來潮第一天開始計(jì)算,從第3天開始每3天進(jìn)行一次血樣采集,共采集樣本10次。將采集的樣本離心,取血清分裝后保存于-80 ℃,統(tǒng)一分析。

分析時(shí),血清于4 ℃下解凍,渦旋混勻后取150 μL于1.5 mL離心管中,加入600 μL含內(nèi)標(biāo)沉淀劑,超聲2 min,渦旋震蕩30 s;混合液在4 ℃下以15 000 r/min離心10 min,取上清液700 μL凍干;將其復(fù)溶于50 μL 100 mmol/L鹽酸羥胺水溶液中,60 ℃水浴衍生30 min,離心后取上清液供LC-MS分析。每個(gè)實(shí)際樣本中取50 μL，混勻后作為質(zhì)控(QC)樣本用于監(jiān)控分析序列的重復(fù)性和穩(wěn)定性,每10個(gè)測試樣品插入一個(gè)QC樣本,預(yù)處理方法同上。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件:色譜柱為Agilent-C18柱(50 mm×3.0 mm, 2.7 μm)(美國Agilent公司)。柱溫為35 ℃,進(jìn)樣量為5 μL。流動(dòng)相為0.1%(v/v)甲酸水溶液(A)和乙腈(B),流速0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0～7 min, 90%A～5%A; 7～10 min, 5%A～70%A; 10～10.1 min, 70%A～90%A,并保持至14 min。

質(zhì)譜條件:ESI正離子模式,多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。質(zhì)譜離子化參數(shù):噴嘴壓力344.74 kPa (50 psi); 干燥氣(N2)流速18 L/min;鞘氣溫度380 ℃;鞘氣流速11 L/min;離子源溫度250 ℃;噴霧電壓5.5 kV。各激素的碰撞電壓(collision energy, CE)見表1。

1.5 數(shù)據(jù)采集與處理

各個(gè)激素的峰面積通過MassHunter Quantitative Analysis軟件(美國Agilent公司)進(jìn)行積分得到,采用內(nèi)標(biāo)法,以參比溶液R1～R6構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線,血清中各種激素的定量結(jié)果根據(jù)內(nèi)標(biāo)法計(jì)算得到。由于激素的絕對含量存在較大的個(gè)體差異，以每個(gè)人在月經(jīng)周期內(nèi)單個(gè)激素的總量進(jìn)行歸一化計(jì)算，以百分含量進(jìn)行下一步數(shù)據(jù)處理。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)聚類分析采用MeV4.9.0軟件(美國Dana-Farber Cancer Institute),多元統(tǒng)計(jì)分析采用SIMCA-P 13.0軟件(瑞典Umetrics公司)。單變量統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPad Prism 6.01軟件(美國GraphPad Software公司)。

表 1 15種甾體激素的保留時(shí)間和質(zhì)譜條件

T: testosterone; P4: progesterone; 17-OHP: 17α-hydroxyprogesterone; CORT: cortisol; S: 11-deoxycortisol; F: corticosterone; Adione: androstenedione; Etio: etiocholanolone; DOC: deoxy-corticosterone; DHT: dihydrotestosterone; DHEA: dehydroepiandrosterone; Andro: androsterone; P5: pregnenolone; E1: estrone; DHEAS: dehydroepiandrosterone sulfate. *Quantitation ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

激素易溶于甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑,首先分別考察了甲醇和乙腈作為B相溶劑時(shí)的分離效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn),乙腈分離雜質(zhì)峰少,分離效果優(yōu)于甲醇。比較了0.1%(v/v)甲酸水、0.1%(v/v)乙酸水和10 mmol/L乙酸銨溶液(pH=2.0)3種不同pH水相溶液與乙腈組合的流動(dòng)相體系的分離效果和靈敏度，結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)A相為0.1%(v/v)甲酸水溶液時(shí),15種激素的分離效果和靈敏度最優(yōu)。因此,流動(dòng)相確定為(A)0.1%(v/v)甲酸水溶液和(B)乙腈。1.4節(jié)條件下的MRM色譜圖見圖1。

圖 1 15種甾體激素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the 15 steroid standards1. DHEAS; 2. CORT; 3. F; 4. S; 5. DHEA; 6. DOC; 7. E1; 8. Adione; 9. 17-OHP; 10. T; 11. Andro; 12. Etio; 13. DHT; 14. P4; 15. P5.

2.2 方法學(xué)評價(jià)

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

本實(shí)驗(yàn)以內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。將待測樣本中檢測到的各激素的峰面積與其相對應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積之比(Y)對樣本中各激素的質(zhì)量濃度(X,ng/mL)進(jìn)行線性回歸，得到各激素的線性方程。13種激素在0.05～20 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(相關(guān)系數(shù)(R2)≥0.995 6), CORT及DHEAS在50～2 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2>0.9979)。按3倍信噪比計(jì)算,檢出限均小于1 ng/mL(見表2)。

表 2 15種目標(biāo)物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

Y: peak area ratio of analyte to internal standard;X: mass concentration, ng/mL.

2.2.2 精密度和回收率

計(jì)算同一天內(nèi)的6份平行QC樣本的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),將其作為日內(nèi)精密度;連續(xù)測試3天、每天3份平行QC樣本,計(jì)算9個(gè)測試結(jié)果的RSD,作為日間精密度。15種甾體激素的日內(nèi)精密度≤18.36%,日間精密度≤16.03%(見表3)。

表 3 15種甾體激素的日間和日內(nèi)精密度

同時(shí)，在空白胎牛血清中分別添加按照人體血液樣本濃度范圍的高、中、低3種不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中CORT和DHEAS加標(biāo)質(zhì)量濃度為200、600、1000 ng/mL，其余13種激素加標(biāo)質(zhì)量濃度為0.5、2、10 ng/mL。所獲得的檢測結(jié)果扣除本底之后與加入量對比，進(jìn)行方法回收率的驗(yàn)證，回收率在75%～112%。

2.3 女性月經(jīng)周期內(nèi)激素水平變化規(guī)律研究

2.3.1 濾泡期及黃體期激素水平的比較

采用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)對第6天(濾泡期)及第24天(黃體期)激素歸一化數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，研究這兩個(gè)月經(jīng)周期的激素差異。得分圖和載荷圖見圖2，主成分?jǐn)?shù)為2，R2Y和Q2為0.597和0.406，采用交叉驗(yàn)證，R2Y和Q2的截距分別為0.159和-0.223，表明模型沒有過擬合。從得分圖可以看出，這兩個(gè)時(shí)期的激素水平存在顯著的差異。載荷圖則表明，黃體期P4、17-OHP、P5、DOC及E1等激素含量較濾泡期顯著上升。這說明這些激素在黃體期都呈現(xiàn)了不同程度的升高，與之前報(bào)道的結(jié)果一致[10,16,23]。

2.3.2 激素的周期性變化規(guī)律研究

對整個(gè)月經(jīng)周期的激素?cái)?shù)據(jù)采用MeV基于皮爾森相關(guān)系數(shù)進(jìn)行分層聚類分析，結(jié)果見圖3。性質(zhì)相近的激素具有較為相似的變化規(guī)律，如孕激素P4與17-OHP、皮質(zhì)激素CORT與S、雄激素T與Adione具有較好的相關(guān)性，而這些變化類似的激素在甾體激素代謝通路中處于連續(xù)并相鄰的位置[23]。

表 4 生理周期內(nèi)激素百分含量的動(dòng)態(tài)變化(n=15)

圖 2 濾泡期及黃體期激素的PLS-DA(a)得分圖及(b)載荷圖Fig. 2 (a) Score plot and (b) loading plot of partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA) in follicular phase and luteal phase

圖 3 15種甾體激素的聚類關(guān)系圖Fig. 3 Plot of hierarchical clustering of the 15 steroids

15種激素的百分含量均值(RSD: 3.58%～25.41%)在一個(gè)完整的周期內(nèi)都有不同特征的動(dòng)態(tài)變化(見表4)，15種激素在生理周期內(nèi)達(dá)到最高值及最低值的時(shí)間也有所不同。

結(jié)合圖3的聚類分析結(jié)果可以看出不同類型的激素在月經(jīng)周期內(nèi)存在共性的變化規(guī)律，進(jìn)一步選取了性激素T、孕激素P4及皮質(zhì)激素S的均值進(jìn)行周期性分析(見圖4)。可以發(fā)現(xiàn)，雄激素在濾泡期的后期(第12～15天)達(dá)到最高值，孕(雌)激素在黃體期(第21～24天)達(dá)到最高值，而皮質(zhì)激素則波動(dòng)不明顯。

圖 4 T、P4及S在女性月經(jīng)周期內(nèi)的波動(dòng)(n=25)Fig. 4 Changes of T, P4 and S during a menstrual cycle of women (n=25)

激素含量隨月經(jīng)有周期性的變化，采樣時(shí)間點(diǎn)的差異可能導(dǎo)致較大的變異，針對不同的激素選擇在其波動(dòng)最小時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行檢測，則可能獲得較為穩(wěn)定的檢測結(jié)果。月經(jīng)周期內(nèi)激素含量波動(dòng)情況通過計(jì)算 |Xn-Xn-1|+ |Xn+1-Xn|(采樣順序號n=2,3…,9；X為檢測結(jié)果歸一后的百分含量)進(jìn)行比較，獲得在6天內(nèi)波動(dòng)最小時(shí)間點(diǎn)。結(jié)果表明， 17-OHP、DOC、DHT的波動(dòng)最小時(shí)間范圍為第3天左右；P4的波動(dòng)最小時(shí)間范圍為第6天左右；CORT、Etio的波動(dòng)最小時(shí)間范圍為第18天左右；S和F的最小波動(dòng)時(shí)間范圍為第21天左右；DHEA、DHEAS的波動(dòng)最小時(shí)間范圍為第24天左右； T、Adione、Andro、P5及E1的波動(dòng)最小時(shí)間范圍為第30天左右。

3 結(jié)論

本研究建立了同時(shí)測定血液中15種甾體激素的LC-MS分析方法。該方法具有靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí),通過對女性月經(jīng)周期內(nèi)激素波動(dòng)變化的分析,確定了15種甾體激素在周期內(nèi)發(fā)生的規(guī)律性波動(dòng),為臨床女性激素檢測及研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Monitoring of dynamic changes of 15 steroids in serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry

TONG Hongbin1, TONG Haijiang2, LU Dezhao1*

(1.ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310053,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,theSecondHospitalofShaoxing,Shaoxing312000,China)

A liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was developed for the determination of 15 steroids. Acetonitrile containing internal standard was added to the serum samples to precipitate the proteins. Then the derivatization of the samples was conducted with 100 mmol/L hydroxylamine hydrochloride. The separation of the samples was performed on an Agilent-C18 column (50 mm×3.0 mm, 2.7 μm), and quantified with internal standard method. The steroids were determined by multiple-reaction monitoring (MRM) with electrospray ionization (positive mode) MS. The 13 steroids showed linear relationships from 0.05 to 20 ng/mL (R2≥0.995 6) with limits of detection no more than 1 ng/mL; cortisol and dehydroepiandrosterone sulfate showed linear relationships from 50 to 2 000 ng/mL (R2≥0.997 9) with limits of detection less than 0.5 ng/mL. The method was used for the monitoring of the dynamic changes of steroids in a menstrual cycle of women. The 15 steroids fluctuated with different properties, in which androgens reached the peak in late follicular phase, progesterone (estrogens) reached the peak in luteal phase, while the changes of cortical steroids were not so evident. The method is sensitive and repeatable. The data in this project can provide some references for clinical practice.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); steroids; menstrual cycle

10.3724/SP.J.1123.2016.09015

2016-09-05

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014KYB285)；浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃(2012ZA066).

Foundation item: Project of Medical and Health Technology Program of Zhejiang Province (No. 2014KYB285); Traditional Chinese Medical Science and Technology Program of Zhejiang Province (No. 2012ZA066).

O658

A

1000-8713(2017)04-0421-06

* 通訊聯(lián)系人.E-mail:ludezhao@126.com