嚴(yán)麗娟, 李文斌, 洪煜琛, 吳 敏, 徐敦明*, 林立毅, 顧春燕

(1. 廈門出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心, 福建 廈門 361026; 2. 北京迪馬科技有限公司, 北京 100029)

研究論文

液相色譜-大氣壓化學(xué)電離串聯(lián)質(zhì)譜法測定嬰幼兒配方奶粉中的維生素D

嚴(yán)麗娟1, 李文斌2, 洪煜琛1, 吳 敏1, 徐敦明1*, 林立毅1, 顧春燕2

(1. 廈門出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心, 福建 廈門 361026; 2. 北京迪馬科技有限公司, 北京 100029)

建立了嬰幼兒配方奶粉中維生素D的液相色譜-大氣壓化學(xué)電離串聯(lián)質(zhì)譜(LC-APCI-MS/MS)分析方法。樣品經(jīng)正己烷和甲基叔丁基醚混合溶液提取,ProElut VDC固相萃取柱凈化,Kinetex C18色譜柱分離,采用大氣壓化學(xué)電離(APCI)源、正離子掃描和多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式對維生素D2和維生素D3進(jìn)行檢測,內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明維生素D2和維生素D3在5～5 000 μg/L范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系,檢出限為2 μg/kg,定量限為5 μg/kg。在5、10和100 μg/kg添加水平下,維生素D2和維生素D3的回收率為85.2%～105.3%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.7%～8.1%。該方法簡便準(zhǔn)確,靈敏度高,適用于嬰幼兒奶粉中維生素D的測定。

液相色譜-大氣壓化學(xué)電離串聯(lián)質(zhì)譜;維生素D;嬰幼兒配方奶粉

維生素D為固醇類衍生物,是一種重要的脂溶性維生素。維生素D參與人體內(nèi)分泌系統(tǒng)對骨骼和無機(jī)鹽的代謝調(diào)節(jié),對于人體健康有諸多益處,具有預(yù)防佝僂病和調(diào)節(jié)人體鈣吸收的作用,還能起到有效治療軟骨病的功效。維生素D是一種激素的前體,可由人體皮膚合成,合成量具有波動性,維生素D家族成員中最重要的成員是維生素D2(麥角鈣化醇)和維生素D3(膽鈣化醇)。在陽光充足的情況下,人體自身可以合成維生素D3。嬰幼兒是維生素D缺乏的潛在高危人群,維生素D缺乏易患佝僂病,引起生長遲緩和骨骼變形,童年時保證攝入足夠的維生素D能降低成年后患骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險。嬰幼兒奶粉中維生素D允許使用的添加形式為維生素D2或維生素D3[1]。

目前乳制品中維生素D的檢測過程通常是先將樣品進(jìn)行皂化處理,然后用有機(jī)溶劑進(jìn)行液液萃取,采用液相色譜法[2-7]或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8-14]分析。由于樣品中維生素D含量低,基質(zhì)干擾嚴(yán)重,且前處理過程繁瑣,維生素D損失較大,很難對維生素D進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量檢測。本文改進(jìn)了嬰幼兒配方奶粉中維生素D的測定方法,樣品未經(jīng)皂化,直接提取,然后通過ProElut VDC固相萃取柱凈化,用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測定,同位素內(nèi)標(biāo)法定量,有效地降低了基質(zhì)干擾,操作過程簡單,為嬰幼兒奶粉中維生素D的檢測提供了更為簡便有效的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290高效液相色譜儀(美國安捷倫公司); QTRAP 6500質(zhì)譜儀,配有大氣壓化學(xué)電離(APCI)源(美國AB SCIEX公司);硅膠、N-丙基乙二胺(PSA)、弗羅里硅土(Florisil)和ProElut VDC(2 g/12 mL)固相萃取柱(北京迪馬公司)。Allegra 64R型高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司);旋渦混合器(德國IKA公司); N-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本EYELA公司); Fotector-06自動固相萃取儀(廈門?？乒?;自動氮吹濃縮儀(美國Capiler Life Sciences公司); UV-2450紫外分光光度計(日本島津公司); CP225D電子分析天平(德國Sartorius公司)。

甲醇、乙腈、無水乙醇、正己烷、乙酸乙酯和二甲基亞砜均為色譜純(美國Merck公司);甲基叔丁基醚和檸檬酸均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。維生素D2(純度99.1%)和維生素D3(純度99.9%)標(biāo)準(zhǔn)品均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司,同位素內(nèi)標(biāo)d3-維生素D3(純度97%)購自美國IsoSciences公司。Phenomenex Kinetex C18色譜柱(100 mm×4.6 mm,粒徑2.6 μm)購自美國菲羅門公司。實驗用水由Milli-Q系統(tǒng)(美國Millipore公司)制得。

準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品,分別用無水乙醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中。維生素D2和維生素D3標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制后需要通過紫外吸光值進(jìn)行校正,具體步驟同GB 5413.9-2010附錄A。移取各標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用無水乙醇稀釋成質(zhì)量濃度為10.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,于-18 ℃下避光保存。根據(jù)需要用乙醇逐級稀釋,配成適當(dāng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 樣品前處理

稱取2.0 g樣品于50 mL離心管中,加入15 μL 10 mg/L d3-維生素D3內(nèi)標(biāo),再加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的檸檬酸水溶液,充分混勻,加入8 mL二甲基亞砜和10 mL甲醇,振蕩提取5 min。然后加入15 mL正己烷-甲基叔丁基醚(1∶1, v/v),振蕩提取5 min,以6 000 r/min的速度離心2 min,收集上清液。再向殘渣中加入10 mL正己烷-甲基叔丁基醚(1∶1, v/v),重復(fù)提取一次,合并上清液。最后將上清液在35 ℃下減壓蒸餾至近干,加入5 mL正己烷,待凈化。

自動固相萃取流程:依次用10 mL乙酸乙酯和10 mL正己烷活化ProElut VDC固相萃取柱,待凈化液過柱后,棄去流出液;依次加入10 mL正己烷和10 mL乙酸乙酯-正己烷(1∶9, v/v)淋洗,棄去流出液;再加入20 mL乙酸乙酯-正己烷(1∶9, v/v)洗脫,收集流出液。將洗脫液在35 ℃下減壓蒸餾至近干,用甲醇定容至1 mL,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后,供液相色譜-質(zhì)譜分析。

1.3 液相色譜與質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱:Phenomenex Kinetex C18色譜柱;柱溫:35 ℃;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL;流動相:水(A相)和乙腈(B相)。梯度洗脫程序:0～4.0 min, 90%B; 4.1～8.0 min, 100%B; 8.1～12.0 min, 90%B。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源:APCI;掃描方式:正離子掃描;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);噴霧氣(GS1)壓力:448 kPa;氣簾氣(CUR)壓力:207 kPa;碰撞氣(CAD): medium;離子源溫度:350 ℃;電流(NC): 3.0 μA;入口電壓(EP): 10 V;出口電壓(CXP): 10 V;駐留時間(dwell time): 50 ms。MRM監(jiān)測離子對、化合物保留時間、去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)等參數(shù)列于表1。

表 1 MRM掃描模式下維生素D2和維生素D3的質(zhì)譜參數(shù)

* Quantitative ion. RT: retention time; Q1: precursor ion; Q3: product ion; DP: declustering potential; CE: collision energy.

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

通常使用包被技術(shù)來提高嬰幼兒配方奶粉中添加的維生素D的抗氧化性能,但這也給維生素D的提取和檢測帶來了較大的難度。文獻(xiàn)[5]報道的破壁技術(shù)主要有酶解法、酸水解法、皂化法和有機(jī)溶劑法。酶解法和皂化法需要的實驗時間長,過程繁瑣,而維生素D本身不穩(wěn)定,不宜用酸水解法。由于二甲基亞砜具有極強(qiáng)的穿透性,加入檸檬酸水溶液和二甲基亞砜作為破壁溶液,可破壞維生素D外層的包被物質(zhì),加速維生素D的溶出,同時加入甲醇以提高奶粉樣品和破壁溶液的互溶性,以正己烷和甲基叔丁基醚混合溶劑作為提取試劑,可獲得滿意的回收率。

表 2 維生素D2和維生素D3的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限和定量限

y: peak area ratio;x: mass concentration, μg/L.

2.2 固相萃取條件的優(yōu)化

比較了硅膠、PSA、弗羅里硅土(Florisil)、ProElut VDC等固相萃取柱,發(fā)現(xiàn)硅膠、PSA、Florisil等固相萃取柱對奶粉樣品的凈化效果不佳,不能去除奶粉中的油脂和其他干擾物。ProElut VDC固相萃取柱由PSA和硅膠兩種吸附劑按照一定的比例分層填裝而成。PSA吸附劑通過弱陰離子交換作用和氫鍵作用吸附樣品中的有機(jī)酸類、蛋白質(zhì)、油脂和碳水化合物等雜質(zhì),實現(xiàn)樣品的凈化,同時通過金屬螯合作用,吸附提取液中微量的重金屬,可對樣品基質(zhì)進(jìn)一步凈化。硅膠吸附劑通過弱陽離子交換作用和氫鍵作用,吸附樣品中的蛋白質(zhì)等含堿性基團(tuán)的化合物,同時硅膠表面的硅羥基可與維生素D2和維生素D3形成氫鍵,在一定極性的有機(jī)溶劑洗脫條件下,實現(xiàn)樣品與雜質(zhì)的分離凈化。

比較了體積分?jǐn)?shù)為5%、10%和20%的乙酸乙酯正己烷作為淋洗液和洗脫液對維生素D回收率的影響。試驗發(fā)現(xiàn),當(dāng)乙酸乙酯的體積分?jǐn)?shù)低于10%時,維生素D均不能被完全洗脫下來;而當(dāng)乙酸乙酯的體積分?jǐn)?shù)高于10%時,旋蒸瓶中會出現(xiàn)油,并且在淋洗步驟就已經(jīng)把維生素D洗脫下來,導(dǎo)致回收率偏低,因此最終使用10 mL體積分?jǐn)?shù)為10%的乙酸乙酯正己烷淋洗,再用20 mL體積分?jǐn)?shù)為10%的乙酸乙酯正己烷洗脫。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

脂溶性維生素極性較小,沒有質(zhì)子化位點,較難在溶液中形成質(zhì)子化的離子或去質(zhì)子化離子,在電噴霧電離(ESI)模式下的檢測靈敏度較差,因此本試驗采用APCI模式檢測維生素D,可獲得較高的靈敏度。采用針泵連續(xù)進(jìn)樣,在正離子模式下,分別對0.1 mg/L維生素D2和維生素D3標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描,確定較強(qiáng)的峰[M+H]+為其母離子,優(yōu)化各母離子的去簇電壓。然后分別對其子離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描,選擇豐度較高、干擾較小的兩對子離子為定性離子,豐度最高的離子作為定量離子,然后優(yōu)化其碰撞能量。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

圖 1 (a)維生素D2和維生素D3混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和(b)實際奶粉樣品的MRM色譜圖Fig. 1 MRM chromatograms of (a) vitamin D2 and vitamin D3 mixed standard solution (b) and real formula sample

2.4 線性范圍和檢出限

取質(zhì)量濃度為5、50、500、1 000和5 000 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定,以維生素D與同位素內(nèi)標(biāo)色譜峰的峰面積比值為縱坐標(biāo)，以系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(單位μg/L)，分別繪制維生素D2、維生素D3的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如表2所示,在5～5 000 μg/L范圍內(nèi),維生素D2和維生素D3的質(zhì)量濃度與對應(yīng)的峰面積比值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均大于0.999。在空白奶粉樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別以3倍和10倍信噪比來確定方法的檢出限和定量限,維生素D2和維生素D3的檢出限為2 μg/kg,定量限為5 μg/kg。本方法測定維生素D的線性范圍寬,靈敏度高。圖1為優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下,維生素D2和維生素D3混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和實際奶粉樣品的MRM色譜圖。

2.5 回收率試驗

在空白奶粉樣品中分別添加5、10和100 μg/kg維生素D2和維生素D3混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按本文所述方法進(jìn)行提取、凈化和測定,每個添加水平重復(fù)3次。如表3所示，維生素D2和維生素D3的平均回收率為85.2%～105.3%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.7%～8.1%。該方法可獲得較滿意的回收率和精密度。

2.6 實際奶粉樣品的測定

取3個不同品牌嬰幼兒配方奶粉樣品,按照上述方法處理樣品并測定,計算待測樣品溶液中維生素D2和D3的濃度。各奶粉樣品中均未檢出維生素D2,維生素D的測定結(jié)果見表4。

表 3 空白奶粉中添加維生素D2和D3的平均

ND: not detected.

3 結(jié)論

本實驗建立了嬰幼兒配方奶粉中維生素D的測定方法,可操作性強(qiáng),采用固相萃取小柱凈化的方法,大大縮短了分析時間,并具有較好的回收率和重復(fù)性,有較高的實際應(yīng)用價值。對比GB 5413.9-2010,本方法不需要兩臺液相色譜完成維生素D的凈化和檢測,用PrElut VDC固相萃取柱代替國標(biāo)中的硅膠色譜柱進(jìn)行凈化,簡化了前處理步驟,降低了檢測成本,并能有效去除油脂等雜質(zhì),保證了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

[1] GB 14880-2012

[2] GB 5413.9-2010

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Determination of vitamin D in infant formula using liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry

YAN Lijuan1, LI Wenbin2, HONG Yuchen1, WU Min1,XU Dunming1*, LIN Liyi1, GU Chunyan2

(1.TechnologyCenterofXiamenEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Xiamen361026,China;2.BeijingDikmaTechnologiesInc.,Beijing100029,China)

A method using liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry (LC-APCI-MS/MS) was developed for the determination of vitamin D in infant formula. The milk powder sample was extracted with hexane and tert-butyl methyl ether followed by clean-up with ProElut VDC cartridge. The LC separation was performed on Kinetex C18column (100 mm×4.6 mm, 2.6 μm) by a gradient elution using water and acetonitrile as the mobile phases with a flow rate of 1.0 mL/min. Identification of vitamin D2and vitamin D3was achieved by APCI-MS/MS using multiple reaction monitoring (MRM). The quantification analysis was performed by internal standard method. The calibration curves showed a good linearity in the range of 5-5 000 μg/L. The limits of detection (LODs) for vitamin D2and vitamin D3in the formula were 2 μg/kg. The limits of quantification (LOQs) for vitamin D2and vitamin D3in the formula were 5 μg/kg. The average recoveries of vitamin D from milk powder spiked at 5, 10 and 100 μg/kg levels were between 85.2% and 105.3%, and the relative standard deviations were between 4.7% and 8.1%. The simple, accurate and sensitive method is suitable for the determination of vitamin D in infant formula.

liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry (LC-APCI-MS/MS); vitamin D; infant formula

10.3724/SP.J.1123.2016.10036

2016-10-12

福建省自然科學(xué)基金項目(2016J01071,2014J01057);長三角科技合作項目(15395810100,16395810100).

Foundation item: Natural Science Foundation of Fujian Province (Nos. 2016J01071, 2014J01057); Yangtze River Delta Science and Technology Cooperation Project (Nos. 15395810100, 16395810100).

O658

A

1000-8713(2017)04-0427-05

* 通訊聯(lián)系人.Tel:(0592)7250900,E-mail:xudm@xmciq.gov.cn.