馬晉，張蜀瀾，胡朝軍，柳樂(lè)，李慶春，李夢(mèng)濤，曾小峰

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫科 風(fēng)濕免疫病學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100730)

ChinJAllergyClinImmunol，2017，11(2)：112- 118

抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(anti-neutrophil cytoplas-mic autoantibodies, ANCA)是最早由Davies及其同事在研究節(jié)段性壞死性腎小球腎炎患者抗核抗體時(shí)所發(fā)現(xiàn)的一種自身抗體[1]?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明ANCA是包括壞死性肉芽腫性血管炎、顯微鏡下多脈管炎和Churg-Strauss綜合征等疾病在內(nèi)的系統(tǒng)性小血管炎(systemic small vasculitis, SSV)臨床診斷的重要血清學(xué)指標(biāo)[2- 4]。大約85%～90%的壞死性肉芽腫性血管炎、顯微鏡下多脈管炎和Churg-Strauss綜合征等疾病患者的體內(nèi)都能夠檢測(cè)到ANCA。其中，抗蛋白酶3(proteinase 3, PR3)抗體和抗髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)抗體對(duì)SSV具有良好的診斷特異性，而且抗體的滴度與疾病的活動(dòng)度具有相關(guān)性[5]。因此，在臨床實(shí)踐中作為重要的ANCA靶抗原確認(rèn)實(shí)驗(yàn)而廣泛開(kāi)展。

目前臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)抗MPO抗體和抗PR3抗體多采用基于20世紀(jì)70年代的傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)技術(shù)[6- 8]。近年來(lái)，新的免疫學(xué)技術(shù)已經(jīng)逐步應(yīng)用到臨床自身抗體檢測(cè)實(shí)踐中[9- 11]。具有全自動(dòng)、定量、隨機(jī)上樣以及檢測(cè)線性范圍更寬等優(yōu)勢(shì)的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光(chemiluminescent immunoassay, CLIA)檢測(cè)技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床樣本檢測(cè)。本研究采用CLIA方法對(duì)臨床常規(guī)樣本開(kāi)展抗MPO和抗PR3抗體檢測(cè)，探討其在抗MPO抗體和抗PR3抗體檢測(cè)中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)象與方法

對(duì)象

收集北京協(xié)和醫(yī)院門診和住院申請(qǐng)ANCA檢測(cè)項(xiàng)目的常規(guī)臨床樣本242例，其中住院患者29例，門診患者213例；男性97例，年齡7～87歲，平均(52.0±18.5)歲，女性145例，年齡10～87歲，平均(48.1±17.1)歲。所有入組樣本中，119例具有明確疾病診斷信息(表1)，其中包括47例SSV患者和72例非SSV患者(含29例風(fēng)濕炎癥疾病和43例非自身免疫疾病)。待檢測(cè)患者清晨空腹靜脈采血，離心分離血清后，應(yīng)用免疫熒光法(immunofluorescent assay，

表1　具有明確疾病診斷信息的入組樣本臨床特點(diǎn)Table 1　Demographic and clinical characteristics of subjects with disease diagnosis

SSV:系統(tǒng)性小血管炎; 風(fēng)濕炎癥疾病組包括6例系統(tǒng)性紅斑狼瘡、9例結(jié)締組織病、12例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及2例系統(tǒng)性硬化癥

IFA)開(kāi)展ANCA篩查檢測(cè)的同時(shí)，平行采用CLIA和ELISA開(kāi)展抗MPO抗體和抗PR3抗體檢測(cè)。

試劑和儀器

CLIA自身抗體檢測(cè)系統(tǒng)，包括全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(LumiRay 1260)及抗MPO抗體和抗PR3抗體檢測(cè)試劑(蘇州浩歐博生物醫(yī)藥有限公司)。IFA檢測(cè)試劑盒：同時(shí)包被HEp- 2細(xì)胞、靈長(zhǎng)類肝組織片、甲醛固定中性粒細(xì)胞和乙醇固定中性粒細(xì)胞等基質(zhì)的粒細(xì)胞馬賽克檢測(cè)試劑盒(德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)診斷股份公司)。對(duì)比ELISA試劑盒：抗MPO抗體和抗PR3抗體ELISA檢測(cè)試劑盒(德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)診斷股份公司)。第三方ELISA驗(yàn)證試劑盒：由于抗MPO抗體和抗PR3抗體缺乏公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)參考方法，本研究針對(duì)CLIA與ELISA檢測(cè)結(jié)果不一致樣本選擇第三方驗(yàn)證ELISA檢測(cè)試劑盒(德國(guó)AESKU Diagnostic公司)開(kāi)展復(fù)測(cè)。SUNRISE酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus)。

方法

CLIA檢測(cè)抗MPO抗體和抗PR3抗體：檢測(cè)流程嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)開(kāi)展檢測(cè)，所有檢測(cè)均在配套的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(LumiRay 1260)上全自動(dòng)開(kāi)展檢測(cè)。抗PR3抗體和抗MPO抗體的檢測(cè)臨界值均為20 RU/ml。

IFA開(kāi)展ANCA篩查檢測(cè)：采用包括乙醇固定粒細(xì)胞、甲醛固定粒細(xì)胞、靈長(zhǎng)類肝組織片和HEp- 2細(xì)胞抗原片等四個(gè)基質(zhì)組合檢測(cè)。血清1∶10稀釋后與抗原基質(zhì)片反應(yīng)30 min(同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性和陰性對(duì)照)，在PBS緩沖液中浸泡5 min，加入熒光素標(biāo)記的抗人IgG抗體避光溫育30 min，再次在PBS緩沖液中浸泡5 min，加甘油基質(zhì)封片并在熒光顯微鏡下觀察和判讀結(jié)果。以抗體滴度≥1∶10為陽(yáng)性。

ELISA檢測(cè)抗MPO和PR3抗體：血清樣本1∶100稀釋，加入包被MPO和PR3抗原的微孔板中，室溫反應(yīng)30 min，用清洗緩沖液清洗3次，每孔加入100 μl酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，室溫反應(yīng)30 min，用清洗緩沖液清洗3次，每孔加入100 μl TMB底物液，室溫反應(yīng)15 min，最后加入100 μl終止液，在酶標(biāo)儀中按照450 nm和620 nm的雙波長(zhǎng)進(jìn)行光密度測(cè)量。根據(jù)光密度值計(jì)算抗體濃度并判讀陰陽(yáng)性結(jié)果。其中對(duì)比ELISA試劑盒和第三方驗(yàn)證ELISA試劑盒的檢測(cè)臨界值分別為20 RU/ml和18 U/ml。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同方法檢測(cè)結(jié)果差異的比較，采用四格表的χ2檢驗(yàn)，兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致性的分析采用Kappa檢驗(yàn)，一致性強(qiáng)度的判斷：當(dāng)Kappa<0.4，一致性強(qiáng)度較差；0.4≤Kappa<0.75，兩者一致性一般；Kappa≥0.75兩者一致性較好。同時(shí)以ELISA作為對(duì)比方法繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC曲線)，借助曲線以下面積(area under the curve, AUC)分析CLIA與ELISA比較的準(zhǔn)確性，判斷標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)0.50.9時(shí)，具有較高的準(zhǔn)確性。當(dāng)兩種方法學(xué)檢測(cè)結(jié)果一致性強(qiáng)度較差時(shí)，差異樣本經(jīng)第三方試劑復(fù)測(cè)的結(jié)果與CLIA和ELISA檢測(cè)結(jié)果分別采用單因素ANOVA分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

CLIA與ELISA檢測(cè)抗MPO抗體的符合率

應(yīng)用CLIA和ELISA同時(shí)對(duì)入組樣本開(kāi)展抗MPO抗體平行檢測(cè)，分別對(duì)兩種方法學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行符合率分析。結(jié)果顯示，CLIA和ELISA在檢測(cè)抗MPO抗體時(shí)表現(xiàn)出良好的一致性，其中陽(yáng)性符合率、陰性符合率及總符合率分別為81.9%、98.8%和93.8%(表2)。以ELISA作為對(duì)比方法繪制ROC曲線，結(jié)果顯示與ELISA比較，CLIA檢測(cè)抗MPO抗體時(shí)具有良好的準(zhǔn)確性，AUC為0.966 (95%置信區(qū)間為0.946～0.986)(圖1)。兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異樣本僅為15例，針對(duì)差異樣本采用第三方試劑開(kāi)展復(fù)測(cè)的結(jié)果見(jiàn)表3。

表2　CLIA與ELISA檢測(cè)抗MPO抗體符合率分析Table 2　Qualitative agreement between CLIA and ELISA for the detection of anti-MPO

MPO：髓過(guò)氧化物酶；CLIA：化學(xué)發(fā)光法；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附法

圖1兩種方法檢測(cè)抗MPO和PR3抗體ROC曲線圖

Fig1Receiver operating characteristic (ROC) curves of anti-MPO and anti-PR3 for the comparison between CLIA and ELISA

MPO：髓過(guò)氧化物酶；PR3：蛋白酶3；ROC：受試者工作特征；AUC：曲線下面積

表3　CLIA與ELISA檢測(cè)抗MPO抗體差異樣本的第三方試劑復(fù)測(cè)結(jié)果Table 3　Retest of discrepant samples between CLIA and ELISA with the validation reagent for anti-MPO

MPO：髓過(guò)氧化物酶；CLIA：化學(xué)發(fā)光法；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附法

CLIA與ELISA檢測(cè)抗PR3抗體的符合率

應(yīng)用CLIA和ELISA同時(shí)對(duì)入組樣本開(kāi)展抗PR3抗體平行檢測(cè)，對(duì)兩種方法學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行符合率分析。結(jié)果顯示，CLIA與ELISA在檢測(cè)抗PR3抗體時(shí)符合率和一致性較低，其中陽(yáng)性符合率、陰性符合率和總符合率分別為35.1%、96.1%和86.8%(表4)。兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異樣本合計(jì)為32例，針對(duì)差異樣本采用第三方試劑開(kāi)展復(fù)測(cè)，結(jié)果顯示，CLIA結(jié)果與第三方試劑復(fù)測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而ELISA結(jié)果與第三方試劑復(fù)測(cè)結(jié)果差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表5)。以ELISA作為對(duì)照方法繪制ROC曲線，結(jié)果顯示與ELISA比較時(shí)，CLIA在檢測(cè)抗PR3抗體時(shí)具有一定的準(zhǔn)確性， AUC為0.839 (95%置信區(qū)間為0.773～0.905)(圖1)。

CLIA和ELISA分別與IFA篩查ANCA檢測(cè)結(jié)果的符合率

臨床實(shí)踐中，首先以包括乙醇和甲醛固定的中性粒細(xì)胞為基質(zhì)的IFA開(kāi)展ANCA初篩試驗(yàn)，然后進(jìn)一步采用免疫印跡法或ELISA方法開(kāi)展抗PR3抗體和抗MPO抗體的確認(rèn)試驗(yàn)。本研究中242例樣本以抗

表4　CLIA與ELISA檢測(cè)抗PR3抗體符合率分析Table 4　Qualitative agreement between CLIA and ELISA for the detection of anti-PR3

PR3：蛋白酶3；CLIA：化學(xué)發(fā)光法；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附法

表5　CLIA與ELISA檢測(cè)抗PR3抗體差異樣本的第三方試劑復(fù)測(cè)結(jié)果分析Table 5　Analysis of discrepant samples between CLIA and ELISA retested with the validation reagent for anti-PR3　(n)

PR3：蛋白酶3；CLIA：化學(xué)發(fā)光法；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附法。CLIA與第三方驗(yàn)證結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，ELISA與第三方驗(yàn)證結(jié)果差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

MPO和(或)抗PR3抗體陽(yáng)性作陽(yáng)性樣本，分別開(kāi)展兩種方法與IFA檢測(cè)結(jié)果的符合率比較。結(jié)果顯示，CLIA與IFA的陰性符合率(94.8%)明顯優(yōu)于ELISA與IFA的陰性符合率(77.2%)(表6)。

CLIA和ELISA抗MPO抗體和抗PR3抗體檢測(cè)性能對(duì)比分析

本研究中，共有119例入組樣本具有明確的疾病診斷，其中包括47例SSV以及72例非SSV。應(yīng)用上述兩組樣本的檢測(cè)結(jié)果，分別比較CLIA和ELISA抗PR3抗體和抗MPO抗體的檢測(cè)性能。結(jié)果顯示在抗PR3抗體檢測(cè)時(shí)，CLIA敏感度(21.3%)略低于ELISA(29.8%)，但CLIA特異度(92.3%)優(yōu)于ELISA(87.5%)。而在檢測(cè)抗MPO抗體時(shí)，兩種方法學(xué)的敏感度基本相當(dāng)，但CLIA特異度(68.1%)高于ELISA(58.3%)(表7)。

表6　CLIA及ELISA確認(rèn)試驗(yàn)與IFA篩查檢測(cè)結(jié)果符合率比較Table 6　The qualitative agreement between IFA screening test and confirmatory test with CLIA and ELISA

MPO：髓過(guò)氧化物酶；PR3：蛋白酶3；CLIA：化學(xué)發(fā)光法；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附法；IFA：免疫熒光法

表7　CLIA和ELISA抗MPO和PR3抗體檢測(cè)性能對(duì)比分析Table 7　The comparison of clinical performance between CLIA and ELISA for the detection of anti-MPO and anti-PR3

SSV：系統(tǒng)性小血管炎；MPO：髓過(guò)氧化物酶；PR3：蛋白酶3；CLIA：化學(xué)發(fā)光法；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附法

討　　論

ANCA是SSV臨床診斷的重要血清學(xué)指標(biāo)。大約85%～90%的壞死性肉芽腫性血管炎、顯微鏡下多脈管炎和Churg-Strauss綜合征等疾病患者的體內(nèi)都能夠檢測(cè)到ANCA。應(yīng)用IFA方法檢測(cè)ANCA時(shí)，在乙醇固定的中性粒細(xì)胞基質(zhì)中可以觀察到cANCA和pANCA等熒光表現(xiàn)。前者表現(xiàn)為細(xì)胞胞質(zhì)顆粒陽(yáng)性且在核小葉部位明顯增強(qiáng)，而后者則表現(xiàn)為細(xì)胞核周邊連續(xù)線性的熒光。ANCA常規(guī)檢測(cè)中除了開(kāi)展IFA篩查實(shí)驗(yàn)之外，由于抗PR3抗體和抗MPO抗體對(duì)系統(tǒng)性血管炎具有良好的診斷特異性，而且抗體的滴度與疾病的活動(dòng)度具有明確相關(guān)性[12]。因此，在臨床實(shí)踐中作為重要的ANCA靶抗原確認(rèn)實(shí)驗(yàn)而廣泛開(kāi)展定量檢測(cè)。

自1990年，F(xiàn)alk和Jennette等發(fā)現(xiàn)PR3和MPO等靶抗原后，ELISA方法一直以來(lái)都被作為抗MPO抗體和抗PR3抗體檢測(cè)的主要方法。ELISA作為20世紀(jì)70年代的傳統(tǒng)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，存在明顯的方法學(xué)局限性，包括特異性較低、檢測(cè)線性范圍有限和僅能實(shí)現(xiàn)半定量檢測(cè)等。近年來(lái)，新的免疫學(xué)技術(shù)已經(jīng)逐步應(yīng)用到臨床自身抗體檢測(cè)實(shí)踐中。CLIA檢測(cè)技術(shù)作為目前臨床免疫檢測(cè)的主流技術(shù)，由于具有全自動(dòng)、全定量、隨機(jī)上樣、靈活組合和質(zhì)控更嚴(yán)等顯著優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)，已經(jīng)在包括腫瘤標(biāo)記物、傳染病、性激素和甲狀腺功能等免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮重要的臨床價(jià)值。

本研究采用CLIA檢測(cè)技術(shù)對(duì)臨床申請(qǐng)ANCA檢測(cè)的常規(guī)樣本開(kāi)展抗MPO抗體和抗PR3抗體檢測(cè)，同時(shí)將檢測(cè)結(jié)果與IFA及ELISA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。在所有入組242例樣本中，無(wú)論是CLIA還是ELISA與IFA方法學(xué)相比較，陽(yáng)性符合率均低于75%(CLIA為60.7%，ELISA為73.6%)。IFA作為篩查實(shí)驗(yàn)由于所包含的抗原譜更廣泛，因此與CLIA和ELISA等靶抗原確認(rèn)實(shí)驗(yàn)相比較具有更好的檢測(cè)敏感性。在臨床實(shí)踐中，針對(duì)ANCA相關(guān)抗體檢測(cè)時(shí)，IFA方法應(yīng)始終作為首選篩查實(shí)驗(yàn)開(kāi)展。但基于IFA而檢測(cè)出的cANCA和pANCA，在臨床應(yīng)用方面由于均不具備明確的疾病特異性，因此需要應(yīng)用CLIA或ELISA等方法進(jìn)行抗MPO抗體和抗PR3抗體的定量或半定量的確認(rèn)，從而提高ANCA在臨床中的疾病特異性。與此同時(shí)，采用CLIA及ELISA等定量及半定量的檢測(cè)方法，還可以獲得抗體濃度的數(shù)值，為臨床針對(duì)系統(tǒng)性血管炎患者的疾病診斷、病情監(jiān)測(cè)、預(yù)后及復(fù)發(fā)判斷提供更加重要的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

應(yīng)用CLIA與ELISA對(duì)抗MPO抗體和抗PR3抗體檢測(cè)時(shí)，兩種方法在抗MPO抗體的檢測(cè)結(jié)果上均保持良好的一致性(陽(yáng)性符合率81.9%，陰性符合率98.8%，總符合率93.8%)和相同的檢測(cè)敏感度(62.2%)。但在抗PR3抗體的檢測(cè)結(jié)果顯示兩種方法學(xué)的陽(yáng)性符合率偏低(僅為35.1%)，而且CLIA的檢測(cè)敏感度(21.3%)略低于ELISA(29.8%)。上述差異可能是由于下列幾個(gè)原因?qū)е拢?1)不同反應(yīng)體系和不同反應(yīng)原理所引起的結(jié)果差異。與ELISA相比較，CLIA以納米級(jí)的磁微粒作為抗原和抗體反應(yīng)的液相載體，因此具備更良好的反應(yīng)效率、更完整的抗原抗體結(jié)合及更徹底的清洗步驟，從而確保整體反應(yīng)體系的特異性。由于抗PR3抗體和抗MPO抗體的檢測(cè)為ANCA中最常見(jiàn)的靶抗原確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，因此在方法學(xué)選擇上應(yīng)該更加注重特異性的考量。(2)不同方法學(xué)中所使用的檢測(cè)抗原不同而導(dǎo)致結(jié)果差異。本研究中ELISA檢測(cè)法為了提高檢測(cè)的敏感度采用的是重組PR3及天然PR3抗原混合包被的方式。而CLIA所采用的抗原為天然的PR3抗原[13]。抗原之間的差異可能是導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果之間差異的原因之一。從本研究的結(jié)果來(lái)看，盡管ELISA在檢測(cè)抗PR3抗體的敏感度略優(yōu)于CLIA，但特異性卻顯著下降。(3)在CLIA反應(yīng)體系中，借助生物素和親和素作為載體實(shí)現(xiàn)PR3抗原在納米磁性微球的間接包被，因此能夠更好地確?？乖Y(jié)構(gòu)不會(huì)由于ELISA在微孔板中的直接包被而導(dǎo)致的抗原構(gòu)想改變。上述兩種方法學(xué)在檢測(cè)抗PR3抗體時(shí)的檢測(cè)差異樣本應(yīng)用第三方驗(yàn)證試劑進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明第三方驗(yàn)證試劑的檢測(cè)結(jié)果與CLIA檢測(cè)更加符合。

綜上所述，由于抗MPO抗體和抗PR3抗體缺乏公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)參考方法，因此不同檢測(cè)方法之間的結(jié)果可能存在差異?？紤]到抗MPO抗體和抗PR3抗體對(duì)于SSV患者疾病診斷、病情進(jìn)展及預(yù)后判斷等具有至關(guān)重要的作用和價(jià)值，因此建議在實(shí)驗(yàn)室針對(duì)上述兩種抗體的檢測(cè)方法學(xué)選擇之前，應(yīng)同時(shí)結(jié)合IFA抗體篩查實(shí)驗(yàn)結(jié)果、樣本的臨床診斷信息以及方法學(xué)的具體特點(diǎn)(包括自動(dòng)化、線性范圍、隨機(jī)上樣等)因素進(jìn)行嚴(yán)格的判斷和評(píng)價(jià)。

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