王 攀，劉運超，魏 薔，柴書軍，陳玉梅，張改平,3*

(1.西北農(nóng)林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西 楊凌 712100； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學院 動物免疫學重點實驗室/河南省動物免疫學重點實驗室/農(nóng)業(yè)部動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002；3.河南農(nóng)業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院,河南 鄭州 450002)

狂犬病病毒G蛋白的原核表達及反應(yīng)原性分析

王 攀1,2，劉運超2，魏 薔2，柴書軍2，陳玉梅2，張改平1,2,3*

(1.西北農(nóng)林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西 楊凌 712100； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學院 動物免疫學重點實驗室/河南省動物免疫學重點實驗室/農(nóng)業(yè)部動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002；3.河南農(nóng)業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院,河南 鄭州 450002)

為優(yōu)化狂犬病病毒G蛋白的原核表達條件,探究其反應(yīng)原性，參照狂犬病病毒CTN-1V10株編碼G蛋白基因序列，采用生物工程合成的方法合成編碼G蛋白的基因片段，并將該片段命名為G5F。將該片段與pET-28a原核表達載體連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-G5F，并將重組質(zhì)粒進行誘導表達，在IPTG濃度為0.2 mmol/L、溫度為20 ℃、誘導12 h時，重組蛋白表達量最高。SDS-PAGE電泳及Western blot分析表明， G5F重組蛋白可溶性表達量高，且可以被抗狂犬病病毒單克隆抗體識別，反應(yīng)原性良好。

狂犬病病毒； G蛋白； 可溶性表達； 反應(yīng)原性

狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus,RABV)引起的，是最致命的傳染病之一，死亡率接近100%[1]。RABV是狂犬病毒屬(Lyssavirusgenus)彈狀病毒科(Rhabdoviridae family)的單股負鏈RNA病毒，可引起人類、家畜及野生動物急性腦膜炎而導致死亡，并可在大多數(shù)哺乳動物中廣泛傳播[2]?？袢≈饕ㄟ^被RABV感染動物的撕咬、抓撓受傷而感染。我國狂犬病的主要傳播源是被RABV感染的狗和貓等[3]。當前，尚無有效的狂犬病治療方法，及時接種相關(guān)的各類狂犬病疫苗可在很大程度上有效控制狂犬病[4]。狂犬病病毒基因組全長約12 kb，編碼核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、糖蛋白(G)、RNA依賴的RNA聚合酶(L)結(jié)構(gòu)蛋白[5]。其中，RABV G蛋白存在于病毒囊膜內(nèi)外兩側(cè)，形成跨膜結(jié)構(gòu)，在RABV表面形成一些纖突(spikes)[6-8]， G 蛋白是RABV唯一暴露在病毒表面的蛋白質(zhì)及唯一糖基化的蛋白質(zhì)，同時也是唯一誘導機體產(chǎn)生中和抗體的蛋白質(zhì)[9]。 研究表明，該蛋白質(zhì)的抗原區(qū)域有8 個抗原結(jié)合簇，這8個表位依次是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、a和 G1[10]。其中，除Ⅵ和 G1 抗原結(jié)合簇外，其他抗原結(jié)合簇在RABV滅活后仍然可被檢測到。G蛋白具有與細胞表面受體結(jié)合以及決定病毒親嗜神經(jīng)組織特性等的功能，G蛋白大約含 524 個aa，其N端是由19 個aa組成的信號肽段，這個序列在RABV轉(zhuǎn)錄過程中被切去。因此，成熟的G蛋白中不含該區(qū)域[11]。成熟的G蛋白含有 505 個aa，其分子質(zhì)量約為62 ku。G蛋白含3個中和抗原表位，在 RABV 吸附過程中起到重要作用，其通過與細胞表面受體的相互作用而促進快速吸附。G蛋白能激活特異性輔助性T細胞(helper T cells,Th)和細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxiclymphocyte,CTL)。研究證實，G蛋白上存在T細胞線性和空間依賴性表位[12]。綜上可知，G蛋白可有效誘發(fā)機體的免疫反應(yīng)，尤其是細胞免疫反應(yīng)。這個特性是后續(xù)針對該蛋白質(zhì)開展相關(guān)研究和新型亞單位疫苗研發(fā)的重要理論依據(jù)。

基因工程亞單位疫苗(subunit vaccine),又稱重組亞單位疫苗(recombinat subunit vaccine)，是利用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)和生物工程的方法，將某病毒特定的所需基因片段克隆重組到相應(yīng)的表達載體中，制備相應(yīng)的重組質(zhì)粒，并將其導入特定的所需細胞培養(yǎng)，使目的蛋白大量表達，可將佐劑加入優(yōu)化表達后的目的蛋白，經(jīng)乳化設(shè)備乳化，制得相應(yīng)的疫苗。由于此類疫苗只含有病毒的某種或某幾種特定抗原，不含其他遺傳物質(zhì)，理論上可以使動物獲得保護性免疫。且不含有病毒的感染性組分，無需滅活，致病性風險低，安全性很高[13]?？梢?，G蛋白既是RABV中最有效的保護性抗原，也是研究基因工程亞單位疫苗的首選抗原。

為了探究G蛋白的相關(guān)特性，本研究擬采用大腸桿菌表達系統(tǒng)對狂犬病病毒G蛋白進行優(yōu)化表達。大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)，具有培養(yǎng)操作簡單、轉(zhuǎn)化效率高、價格相對經(jīng)濟、生長培養(yǎng)速度快、可大量生產(chǎn)所需蛋白質(zhì)等優(yōu)點[14]， 一般狀況下，其針對外源基因的表達產(chǎn)物水平遠遠高于其他生物表達系統(tǒng)[15]。本研究中選用的大腸桿菌pET-28a載體，自帶6×His標簽。His標簽基本不改變蛋白質(zhì)的生物結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)的溶解性，同時可以簡化蛋白質(zhì)純化步驟[16]。鑒于此，本研究在大腸桿菌中表達RABV G蛋白，以期獲得具有活性的重組G蛋白，旨在為RABV基因工程亞單位疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 載體和目的片段的合成

表達重組載體pET-28a購自Life Seneors公司；大腸桿菌感受態(tài)細胞JM109和BL21 (DE3) 購自大連寶生物公司?？袢〔《綠蛋白基因序列參照大腸桿菌密碼子偏愛性進行優(yōu)化，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并將該片段命名為G5F。

1.2 主要試劑

NdeⅠ和XholⅠ DNA限制性內(nèi)切酶購自美國新英格蘭生物公司；抗His標簽單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗、RABV單克隆抗體均購自美國Abcam公司；AEC(3-Amino-9ethylcar-bazole)顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司；IPTG購自INALCO公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自O(shè)mega公司；T4 DNA連接酶、DNA純化回收試劑盒、Primestar Max DNA聚合酶均購自TaKaRa公司；標準分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker購自索萊寶公司。

1.3 RABV G蛋白基因序列的優(yōu)化及其表達引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中公布的狂犬病病毒G蛋白基因序列(AEV43285)，按照大腸桿菌密碼子偏愛性及mRNA結(jié)構(gòu)等信息優(yōu)化RABV病毒G蛋白的基因序列，設(shè)計表達用引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成。

表1 G5F片段的PCR擴增引物

注：下劃線為酶切位點。

1.4 原核表達載體的構(gòu)建

以合成的G5F片段為模板、G5F-F/G5F-R為引物進行PCR擴增，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min； 95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環(huán)；72 ℃充分延伸10 min，取PCR產(chǎn)物10 μL進行核酸電泳，并觀察結(jié)果。紫外燈下切膠回收目的片段，用DNA限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XholⅠ 酶切消化G5F片段和pET-28a載體。將消化后的載體和基因片段按照1︰5的比例用T4 DNA連接酶連接，16 ℃水浴6 h進行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞DH5α，挑取單克隆菌落接種于含卡那霉素(Kan+)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取菌液PCR結(jié)果為陽性的重組質(zhì)粒，送生工生物(上海)股份有限公司進行測序鑒定。將測序正確的陽性菌株命名為pET-G5F，然后將該陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞BL21(DE3)中，經(jīng)菌液PCR鑒定成功后用于后續(xù)的蛋白質(zhì)表達試驗。

1.5 重組蛋白G5F的誘導表達與Western blot鑒定

將pET-G5F重組質(zhì)粒按照1︰1 000比例接種于含有100 μg/mL Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、220 r/min培養(yǎng)過夜。第2天以1︰100比例將此菌液再接種于含有100 g/mL Kan+的100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD450值約為0.6時，加入誘導劑IPTG使誘導菌液終濃度為1.0 mmol/L，繼續(xù)誘導12 h。收集菌液，10 000 r/min離心10 min，倒去上層液體培養(yǎng)基，加入10 mL PBS Buffer重懸瓶底菌體沉淀。將重懸后的菌體用超聲破碎儀進行超聲破碎：φ2變幅桿，工作3 s，間歇5 s，工作時間20 min。破碎后將液體分裝，10 000 r/min離心15 min，分離上清和沉淀，進行SDS-PAGE電泳檢測。電泳結(jié)束后取出凝膠，將分離膠轉(zhuǎn)移到用甲醇和轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡好的硝酸纖維膜上，將膜置于5%脫脂奶中，4 ℃封閉過夜。一抗為1︰5 000稀釋的抗His標簽單克隆抗體，37 ℃孵育1 h，然后用PBST洗膜3次，每次5 min；二抗為1︰1 000稀釋的羊抗鼠二抗，37 ℃孵育45 min，PBST洗膜3次，每次5 min，雙蒸水洗凈后再用AEC顯色試劑盒進行顯色。

1.6 重組蛋白的誘導表達條件優(yōu)化

取pET-G5F陽性菌液加入含Kan+的液體LB培養(yǎng)基中，置于37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6時，加入IPTG進行誘導表達。分別對IPTG誘導溫度、誘導時長、IPTG誘導濃度進行優(yōu)化。在誘導時長優(yōu)化試驗中，分別選擇誘導4、8、12、16、20 h收集菌液(IPTG終濃度為1.0 mmol/L、溫度37 ℃)；在IPTG誘導濃度優(yōu)化試驗中，分別選擇0.1～1.0 mmol/L共10個濃度梯度(溫度37 ℃、誘導時長12 h)；誘導溫度的優(yōu)化試驗分別選擇15、20、25、37 ℃溫度梯度(IPTG終濃度為0.2 mmol/L、誘導時長12 h)。收集菌液，表達產(chǎn)物分別用SDS-PAGE電泳檢測，以確定重組蛋白的最佳誘導條件。

1.7 Western blot檢測重組蛋白G5F的反應(yīng)原性

將含有目的蛋白的SDS-PAGE膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶封閉，洗膜后加入1︰2 500稀釋的RABV單克隆抗體為一抗，37 ℃孵育1 h，洗膜3次，再加入1︰5 000稀釋的羊抗鼠二抗，37 ℃孵育45 min，PBST洗膜3次，雙蒸水洗凈后用AEC顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 G5F片段的擴增與原核表達質(zhì)粒鑒定

從圖1可以看出，擴增得到約1 884 bp的條帶，與預(yù)期目的條帶大小相符。經(jīng)NdeⅠ和XholⅠ雙酶切的G5F片段和載體pET-28a用T4 DNA連接酶連接，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109。隨機挑取單克隆菌落，用菌液PCR方法進行驗證，結(jié)果顯示，在1 884 bp處出現(xiàn)條帶(圖2)。經(jīng)PCR鑒定為陽性的菌液，提取其質(zhì)粒DNA后，進行測序鑒定。測序結(jié)果與合成的序列一致，表明重組質(zhì)粒pET-G5F構(gòu)建成功。

M.DL2000 DNA Marker； 1.G5F 擴增產(chǎn)物圖1 G5F片段的PCR擴增結(jié)果

M.DL2000 DNA Marker； 1.pET-G5F重組質(zhì)粒圖2 重組質(zhì)粒pET-G5F的菌液PCR鑒定

2.2 G5F重組蛋白的誘導表達及可溶性分析結(jié)果

SDS-PAGE結(jié)果(圖3)表明，經(jīng)IPTG誘導后，分子質(zhì)量約為65 ku的蛋白質(zhì)大量表達，且大部分以可溶性形式存在，大小與G5F重組蛋白的理論分子質(zhì)量相符。表明目的蛋白G5F能夠在大腸桿菌中表達，且大部分以可溶性形式存在。

Western blot結(jié)果(圖4)顯示，65 ku處條帶能夠與His單抗特異性結(jié)合。進一步表明，G5F重組蛋白成功表達。

2.3 重組蛋白G5F的誘導表達條件優(yōu)化結(jié)果

分別對pET-G5F菌液的誘導溫度、誘導時間、IPTG濃度進行優(yōu)化，結(jié)果(圖5)顯示，誘導12 h和16 h時，目的蛋白表達量并無太大差異，16 h以后，無關(guān)蛋白質(zhì)表達量開始增加，故選擇12 h作為誘導時長。

M.蛋白質(zhì)Marker； 1、2分別為pET-G5F在20 ℃未誘導時的超聲上清、沉淀； 3、4分別為pET-G5F在20 ℃誘導表達時的超聲上清、沉淀圖3 重組蛋白G5F的SDS-PAGE分析

M.蛋白質(zhì)Marker； 1、2分別為pET-G5F在20 ℃ 未誘導時的超聲上清、沉淀； 3、4分別為 pET-G5F在20 ℃誘導表達時的超聲上清、沉淀圖4 重組蛋白G5F誘導表達的Western blot分析

M.蛋白質(zhì)Marker； 1—5分別為經(jīng)4、8、12、16、20、24 h 誘導表達的pET-G5F圖5 pET-G5F經(jīng)不同時間誘導的表達結(jié)果

通過對IPTG誘導濃度進行優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，當IPTG濃度為0.1 mmol/L時，目的蛋白表達量較低，明顯低于0.2 mmol/L IPTG時的誘導表達量；同時，當IPTG濃度高于0.2 mmol/L時，目的蛋白表達量并無顯著提高(圖6)。因此，選擇0.2 mmol/L作為IPTG誘導濃度。

M.蛋白質(zhì)Marker； 1.未誘導菌液； 2—11分別為用終濃度0.1、0.2、 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mmol/L 的IPTG誘導表達的G5F重組蛋白圖6 pET-G5F經(jīng)不同IPTG濃度誘導的表達結(jié)果

通過對誘導表達溫度進行優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，37 ℃誘導時，上清中重組蛋白含量不高；當溫度降至15 ℃時，目的蛋白表達量較20 ℃時低(圖7)。因此，選擇20 ℃作為誘導溫度。

M.蛋白質(zhì)Marker； 1.未誘導菌液上清； 2—5分別為在15、20、25、 37 ℃時表達的G5F重組蛋白圖7 pET-G5F經(jīng)不同溫度誘導的表達結(jié)果

2.4 Western blot鑒定重組蛋白的反應(yīng)原性

從圖8可以看出，在65 ku處出現(xiàn)相應(yīng)的特異條帶，與預(yù)期的G5F重組蛋白大小一致?？梢姡磉_的G5F重組蛋白能被抗RABV單克隆抗體識別，具有良好的反應(yīng)原性。

M.蛋白質(zhì)Marker； 1.pET-G5F在20 ℃誘導表達時的超聲上清； 2.pET-G5F在20 ℃誘導表達時的超聲沉淀圖8 重組蛋白G5F的反應(yīng)原性分析

3 結(jié)論與討論

RABV G蛋白是多年來針對狂犬病研究的熱點，同時也是新型基因工程亞單位疫苗的研究熱點。His標簽帶有6個組氨酸殘基(咪唑基)，有利于重組蛋白誘導表達后的進一步純化。由于His標簽是若干個AA殘基的多肽，一般對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)不會改變過多[17]。目前，His標簽已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種表達系統(tǒng)重組蛋白的表達和純化，如大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞等。其純化條件有時可以跨越很大的pH值范圍，甚至可以在如尿素、鹽酸胍、非離子型變性劑等嚴苛環(huán)境中正常進行[18]。此外，有研究結(jié)果表明，帶有His標簽的融合蛋白在進行SDS-PAGE分析時會出現(xiàn)分子質(zhì)量比實際值偏大的情況，這種情況可能是由于His融合標簽中的His為堿性氨基酸，含較多的正電荷，導致目的重組蛋白在電泳過程中速度降低[19]。在本研究中，SDS-PAGE 電泳結(jié)果表明，重組G蛋白分子質(zhì)量比理論值略大，試驗結(jié)果符合預(yù)期。G5F重組蛋白具有較好的水溶性。

本研究利用pET-28a表達載體在大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21 (DE3)中成功表達了 RABV G蛋白，通過優(yōu)化表達條件，重組蛋白可溶性表達效果較好，且該重組蛋白與RABV單克隆抗體有良好的反應(yīng)原性，為進一步研究RABV G蛋白的功能及進行新型基因工程亞單位疫苗的制備奠定了基礎(chǔ)。

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Prokaryoticexpression and Immunoreactivity Analysis of Rabies G Protein

WANG Pan1,2，LIU Yunchao2，WEI Qiang2，CHAI Shujun2，CHEN Yumei2，ZHANG Gaiping1,2,3*

(1.College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling 712100,China; 2.Key Laboratory of Animal Immunology，Henan Academy of Agricultural Sciences/Henan Provincial Key Laboratory of Animal Immunology/Key Laboratory of Animal Immunology of Ministry of Agriculture,Zhengzhou 450002,China;3.College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

To optimize the prokaryotic expression condition and the immunoreactivity of the rabies virus G protein(RABV G protein).Herein G protein coding genes section G5F was successfully synthesized with biological engineering synthesis method,using the rabies virus CTN-1V10 strain as a template.The recombinant plasmid was constructed by cloning the G5F gene into pET-28a,and then the plasmid was transformed intoE.coliBL21(DE3)competent cells.Highest protein expression level was achieved when induced with 0.2 mmol/L IPTG at 20 ℃ for 12 h.The results of SDS-PAGE and Western blot showed that RABV G protein was expressed as a soluble recombinant protein,and it could be recognized by anti-RABV monoclonal antibody，which revealed a good immunoreactivity of this protein.

RABV； G protein； soluble protein expression； immunoreactivity

2016-11-06

河南省重大科技專項(141100110100)

王 攀(1988-)，男，河南鄭州人，在讀碩士研究生，研究方向：獸醫(yī)免疫學。E-mail：dennis1999@126.com

*通訊作者：張改平(1960-)，男，河南內(nèi)黃人，研究員，博士，主要從事動物免疫學及重大疫病快速檢測技術(shù)研究。 E-mail：zhanggaiping2003@163.com

S855.3

A

1004-3268(2017)04-0108-05