李小杰，李淑君，李成軍，陳玉國，王海濤，邱 睿，胡亞靜

(河南省農業(yè)科學院 煙草研究所，河南 許昌 461000)

煙草青枯菌Tn5突變體庫的構建及突變位點分析

李小杰，李淑君*，李成軍，陳玉國，王海濤，邱 睿，胡亞靜

(河南省農業(yè)科學院 煙草研究所，河南 許昌 461000)

為了從煙草青枯菌全基因組范圍內發(fā)掘致病性相關基因，采用電轉化法構建了一個Ez-Tn5轉座子介導的煙草青枯菌TXLLJ14-3菌株插入突變體庫，該突變體庫包含1.2萬個突變子，經煙草上的致病性檢測，共得到216個無致病力或弱致病力突變菌株。利用TAIL-PCR擴增獲得其中15個無致病力煙草青枯菌的Tn5側翼序列，并對其插入位點進行了分析，結果表明，15個突變菌株的插入位點分別位于核苷酸水解酶、糖基轉移酶、轉座酶和合成酶等具有不同功能的基因上，這些基因受到干擾或破壞后，可能會抑制致病相關物質的表達或分泌，或者誘導煙草對病原菌產生抗性，從而表現出無致病力特征。

煙草青枯菌； Tn5插入突變； 無致病力菌株； TAIL-PCR； 突變位點

青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的煙草青枯病是危害世界煙草生產的主要根莖部細菌性病害，目前在河南省信陽、駐馬店等夏季高溫多雨地區(qū)已有發(fā)生，其中信陽羅山縣，駐馬店確山縣、遂平縣和泌陽縣煙區(qū)的個別地塊煙株發(fā)病率較高，達到80%左右，嚴重的地塊出現大面積死亡[1]。青枯雷爾氏菌侵染寄主范圍廣，可對多種經濟作物的生產造成嚴重危害，且具有明顯的生理分化現象和菌系多樣性[2-3]。

青枯雷爾氏菌基因組大小約為5.8 Mb，具有很高的G+C含量和約5 120個可能的編碼基因。它由3.7 Mb的染色體和2.1 Mb的大質粒組成，主要的致病因子有Ⅱ型蛋白分泌系統(tǒng)(T2SS)、Ⅲ型蛋白分泌系統(tǒng)(T3SS)、胞外多糖(extracellular polysaccharide,EPS)[4]、胞外蛋白(extracellular protein,EXP)[5]、脂 多 糖(lipopolysaccharides,LPS)和Ⅳ型鞭毛系統(tǒng)(type Ⅳ pilus system)等。其中，Ⅱ型和Ⅲ型蛋白分泌系統(tǒng)主要是將多種致病因子由胞內輸送到胞外，從而導致寄主植物感病[6-7]；Ⅳ型鞭毛系統(tǒng)對細菌在植物表面的附著起重要作用，直接影響青枯菌的致病性[8]。隨著基因組測序技術的不斷發(fā)展，目前已經完成基因組序列測定的雷爾氏菌越來越多，包括煙草青枯菌株系Y45 和FQY_4[9-11]，但許多基因的功能還有待于進一步研究，尤其是致病相關基因。

隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，挖掘功能基因的方法越來越多，其中制備突變體是最直接有效的方法。轉座子標簽(transposontagging)是一種常用的構建突變體庫的方法，也是發(fā)現新基因和進行基因功能分析的有效工具。20世紀90年代開始，許多研究者通過轉座子誘變技術獲得了多種類型的青枯菌突變體。康耀衛(wèi)等[12]利用轉座子Tn5在青枯雷爾氏菌基因組單一的eep位點中插入，獲得了國際上第1例青枯雷爾氏菌胞外蛋白輸出功能缺失突變株。程本亮等[13]利用EZ-Tn5轉座子隨機插入青枯雷爾氏菌Rs91，構建了青枯雷爾氏菌無致病力突變體庫，篩選獲得13株具有無致病力菌株形態(tài)的突變株。車建美等[14]利用Tn5插入強致病力青枯雷爾氏菌FJAT-91，獲得了無致病力突變株FJAT-t582和FJAT-t583，弱化指數均在0.8以上。

本研究擬利用Ez-Tn5轉座子標簽技術構建煙草青枯菌菌株TXLLJ14-3的插入突變體庫，以期獲得大量無致病力突變菌株，為煙草青枯菌致病相關基因的挖掘及其與寄主互作機制的研究奠定基礎，同時為河南省煙草青枯病的防治提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 煙草青枯菌菌株TXLLJ14-3分離自河南省信陽市羅山縣煙區(qū)，由煙草行業(yè)黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點實驗室長期保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基：多聚蛋白胨5 g、酵母提取物1 g、牛肉浸膏3 g、蔗糖10 g、瓊脂18 g，加水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

NB培養(yǎng)基：即不加瓊脂的NA培養(yǎng)基。

LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、氯化鈉5 g、瓊脂18 g，加水定容至1 000 mL，調pH值至7.0，121 ℃滅菌20 min。

TB甘油培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、瓊脂15 g、氯化鈉5 g、甘油250 mL、七水硫酸鎂2.46 g，加水定容至1 000 mL，調pH值至7.0，121 ℃滅菌20 min。

TTC培養(yǎng)基：即在NA培養(yǎng)基滅菌后加入0.05%的氯化三苯基四氮唑(TTC)。

1.1.3 主要試劑和儀器 Ez-Tn5TMTnp TransposomeTMKit購自Epicentre公司；PCR擴增所用的ExTaq酶和連接反應所用的pMD19-T Simple載體均購于TaKaRa公司；引物合成和序列測定均由生工生物(上海)公司完成；所用電轉化儀為寧波新芝SCIENTZ-2C。

1.2 方法

1.2.1 煙草青枯病菌感受態(tài)細胞制備及電轉化 從新鮮活化的NA平板上挑取單菌落，接種于50 mL NB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r /min 振蕩培養(yǎng)48 h，按1% 轉接到200 mL NB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r /min振蕩培養(yǎng)一定時間至菌液濃度OD600≈0.7；將菌液置于冰上冷卻 10～15 min，隨后轉移至預冷的50 mL離心管中，4 ℃、6 000 r /min 離心10 min，棄上清，將細胞重懸于預冷的去離子水中，4 ℃、6 000 r/min 離心10 min，重復清洗3 次；再將細胞重懸于預冷的10%甘油溶液中，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，重復清洗3 次；最后沉淀用1/1 000 初始菌液體積的預冷10%甘油溶液重懸，以100 μL分裝至1.5 mL離心管中，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

將1 μL Ez-Tn5轉座子和50 μL煙草青枯菌感受態(tài)細胞混合，置于預冷的1 mm電擊杯中，立即用于轉化。電轉儀參數設置為：1.8 kV、25 μF、200 Ω。電擊后立即加950 μL NB培養(yǎng)液在28 ℃下振蕩復蘇培養(yǎng)4～6 h。

1.2.2 轉化子的篩選與PCR鑒定 將復蘇培養(yǎng)的細胞液稀釋100倍，取稀釋液100 μL涂到含有卡那霉素(Kan，25 μg/mL)的NA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，篩選具有卡那霉素抗性(Kanr)的轉化子，并計算電轉化率，計算公式為：轉化率(cfu/μg)=克隆數(cfu)/DNA質量(ng)×103。根據Ez-Tn5的Kanr基因設計特異性引物對Kan-F(5′-AAGGTAGCGTTGCCAATGAT-3′)和Kan-R(5′-GCCGTTTCTGTAATGAAGGA-3′)，對轉化子進行PCR驗證。PCR擴增體系為25 μL，擴增條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s、53 ℃ 40 s、72 ℃ 45 s，28個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 突變菌株的致病性測定 將保存的突變體菌株在NA平板上活化培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，將菌苔刮下，用無菌水配成108cfu/mL 的菌懸液，采用無針頭注射法接種煙草活體葉片進行致病性測定，以煙草青枯病菌野生型菌株為陽性對照，水為空白對照。

1.2.4 TAIL-PCR獲取突變體插入位點側翼序列 根據Ez-Tn5轉座子的兩端臂結構分別設計3對特異性引物，根據細菌基因組DNA 特點設計4條簡并引物(表1)，組合后，以新鮮的突變體菌液為模板進行TAIL-PCR。第1輪TAIL-PCR的反應體系是：10 × ExTaqbuffer 2.5 μL、25 mmol/L MgCl22 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、20 μmol/L特異性引物SP1 1 μL、20 μmol/L簡并引物AD混合物4 μL、ExTaqDNA 聚合酶0.5 μL，加入相應的模板，用去離子水補至25 μL。在第2輪TAIL-PCR中，以第1輪的產物稀釋50倍為模板，特異性引物采用SP2，用去離子水補至30 μL，其他與第1輪相同。第3輪以第2輪產物稀釋20 倍為模板，特異性引物采用SP3，加入20 μmol/L簡并引物AD混合物2 μL，用去離子水補至50 μL，其他與第1輪相同。PCR的條件見表2。對TAIL-PCR第2 輪和第3 輪產物進行電泳檢測，然后回收第3 輪與第2 輪TAIL-PCR 大小接近、條帶清晰的產物，連接T-載體后，轉化大腸桿菌DH5α，在含氨芐青霉素(Amp，100 μg/mL)的LB平板上篩選轉化子。

表1 TAIL-PCR所用引物

表2 TAIL-PCR反應條件

1.2.5 側翼序列測定及比對分析 TAIL-PCR擴增獲得的側翼序列由生工生物(上海)公司測序。通過Blastn程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)與青枯病菌基因組進行比對，分析側翼序列與目的基因的同源性和相關生物學信息。

2 結果與分析

2.1 煙草青枯病菌Tn5插入突變體庫的構建

利用Ez-Tn5轉座子插入突變技術構建了煙草青枯菌菌株TXLLJ14-3的突變體庫，分3次轉化共得到了約1.2萬個轉化子，轉化率約為3.8×103cfu/μg。將轉化子分別點接于表面鋪有滅菌濾膜(孔徑為0.22 μm)的TB甘油培養(yǎng)基平板上，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 Tn5插入突變體的分子驗證

根據Ez-Tn5的Kanr基因設計特異性引物對Kan-F/Kan-R，對插入突變體進行PCR擴增，均能得到567 bp的目的片段，而野生型菌株中未擴出相應的條帶(圖1)。將突變體菌株進行劃線繼代培養(yǎng)4～5代后，PCR檢測仍然能夠得到相應的目的片段，說明轉座子已穩(wěn)定地插入到突變體基因組中。

M：DL2000 DNA Marker； 1：野生型； 2—16：隨機挑選的插入突變體圖1 Kanr基因的PCR擴增

2.3 無致病力突變菌株的篩選

通過注射接種煙草葉片，對突變體菌株進行了致病性測定，篩選到無致病力或弱致病力菌株216個。從TTC培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)(圖2)看，野生型菌株菌落表面較濕潤，中間呈粉紅色，白邊較寬，且流動性強，為典型的強致病力青枯菌；無致病力突變體菌株菌落表面較干燥，中間呈暗紅色，白邊較窄，無流動性。

左圖為野生型，右圖為部分無致病力突變菌株圖2 煙草青枯菌在TTC平板上的菌落形態(tài)

2.4 無致病力突變菌株Tn5側翼序列的獲得

根據Ez-Tn5轉座子的兩側序列設計了6條特異性引物，其中LSP1—LSP3引物和RSP1—RSP3 引物分別位于轉座子的左端和右端臂上，隨機與簡并引物AD1—AD4進行組合，以篩選出的部分無致病力突變體菌株的菌液為模板，按照表2條件進行TAIL-PCR。電泳結果顯示，TAIL-PCR 可有效擴增轉座子的側翼序列，第2輪和第3輪TAIL-PCR 產物大小基本接近(圖3)。將第3輪PCR產量較高且與第2輪產物大小接近的TAIL-PCR 產物進行切膠回收，連接T-載體后進行序列測定。測序結果表明，TAIL-PCR 產物序列中均存在Tn5的2個臂端序列和Tn5 插入的青枯菌基因組序列。由此說明，TAIL-PCR可有效鑒別Tn5的插入位點和擴增Tn5轉座子的側翼序列。

上圖為第2輪TAIL-PCR電泳結果，下圖為第3輪TAIL-PCR電泳 結果。M：DL2000 DNA Marker； 1—19：無致病力突變體菌株圖3 部分無致病力突變體菌株的TAIL-PCR電泳結果

2.5 無致病力突變菌株Tn5 插入位點分析

將TAIL-PCR 擴增獲得的15個無致病力煙草青枯菌菌株的Tn5側翼序列進行TA克隆后測序，測序結果在NCBI數據庫中進行比對，結果(表3)表明，15個突變菌株的插入位點分別位于核苷酸水解酶、糖基轉移酶、轉座酶和合成酶等具有不同功能的基因上，這些基因受到干擾或破壞后，可能會抑制致病相關物質的表達或分泌，或者是誘導煙草對病原菌產生抗性，從而表現出無致病力特征。

表3 TAIL-PCR 法獲得的Tn5 插入位點及相應的功能基因

3 結論與討論

與常規(guī)的轉座子技術相比， Ez-Tn5TMTnp TransposomeTM轉座系統(tǒng)是一種轉化細菌的新技術[15]，其介導的DNA轉化穩(wěn)定性和重復性較好，操作簡便且轉化效率高，可以直接通過電轉化將轉座子導入活細胞中，實現突變體庫的構建。

本研究利用Ez-Tn5TMTnp TransposomeTM轉座子試劑盒，構建了煙草青枯菌菌株TXLLJ14-3的突變體庫，電轉化率為3.8×103cfu/μg，共得到約1.2萬個轉化子。隨機挑選具有Kanr的轉化子，采用Kanr基因引物進行特異性PCR擴增，均獲得567 bp的目標片段，初步表明轉座子已成功插入到煙草青枯菌基因組中。通過對煙草的致病性測定，篩選到無致病力或弱致病力突變菌株216個，為煙草青枯菌致病相關基因的挖掘提供了基礎材料。進一步通過TAIL-PCR法分析了其中15個無致病力突變體轉座子插入位點的側翼序列，所測得的序列包括轉座子的2個臂端序列，證明轉座子已成功插入到煙草青枯菌的基因組中。序列測定結果比對分析表明，轉座子插入具有隨機性，各個類型的基因都有插入，如編碼水解酶、轉移酶和合成酶等的基因。由于Tn5也可能多位點插入，所以對突變體還需進行Southern雜交以測定Tn5插入的拷貝數。

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Construction of Tn5 Mutant Library ofRalstoniasolanacearumand Analysis of Mutation Sites

LI Xiaojie,LI Shujun*,LI Chengjun,CHEN Yuguo,WANG Haitao,QIU Rui,HU Yajing

(Tobacco Research Institute of Henan Academy of Agricultural Sciences,Xuchang 461000,China)

In order to explore the pathogenic genes from the whole genome range ofRalstoniasolanacearum,this study constructed a Ez-Tn5 transposon insertion mutant library ofR.solanacearumTXLLJ14-3 by electroporation method.The library contained 12 000 mutants.There were 216 non or weak pathogenic mutant strains by the pathogenic detection on tobacco.Tn5 flanking sequences of 15 non pathogenic mutant strains were amplified by TAIL-PCR,and simultaneously,the insertion sites were analyzed.The results showed that the insertion sites of the 15 mutant strains were located at genes with different functions such as nucleotide hydrolases,glycosyltransferases,transposase and synthase.When they were disrupted or destroyed,the expression or secretion of virulence related substances might be inhibited,or tobacco resistance to pathogen be induced,thus showing no pathogenic characteristics.

Ralstoniasolanacearum; Tn5 insertion mutation; non pathogenic strain; TAIL-PCR; mutation site

2016-11-01

河南省基礎與前沿技術研究計劃項目(152300410142)；河南省煙草公司科技項目(HYKJ201407)

李小杰(1983-)，女，河南許昌人，助理研究員，博士，主要從事煙草病理研究。E-mail：lixiaojie000631@sina.com

*通訊作者：李淑君(1966-)，女，河南焦作人，研究員，碩士，主要從事煙草植保研究及技術推廣工作。 E-mail：13603749396@126.com

S435.72

A

1004-3268(2017)04-0080-05