彭 凌，劉博婷，楊旭夫

(韶關(guān)學(xué)院 英東生命科學(xué)學(xué)院/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所-韶關(guān)學(xué)院動(dòng)物疫病診斷中心聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，廣東 韶關(guān) 512005)

豬鼻支原體套式 PCR 診斷方法的建立及應(yīng)用

彭 凌，劉博婷，楊旭夫

(韶關(guān)學(xué)院 英東生命科學(xué)學(xué)院/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所-韶關(guān)學(xué)院動(dòng)物疫病診斷中心聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，廣東 韶關(guān) 512005)

為建立豬鼻支原體快速診斷方法，根據(jù)豬鼻支原體P69基因序列設(shè)計(jì)2 對(duì)引物，建立了豬鼻支原體套式 PCR 診斷方法，對(duì)建立的方法進(jìn)行特異性、敏感性檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行臨床檢測(cè)。結(jié)果表明，應(yīng)用建立的套式PCR方法對(duì)豬鼻支原體DNA的檢出限為 1.4×10-5ng/μL，與常見感染豬的細(xì)菌、病毒均無交叉反應(yīng)。利用建立的套式PCR方法對(duì) 23 份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，陽性檢出率為73.9%。本研究建立的豬鼻支原體套式PCR具有特異性強(qiáng)、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，可用于豬鼻支原體的臨床診斷。

豬鼻支原體； 套式PCR； 診斷

豬鼻支原體(Mycoplamsahyorhinis)是寄居在豬上呼吸道中的正常菌群，在豬免疫力下降時(shí)，能夠引起豬關(guān)節(jié)炎、胸膜炎、腹膜炎、咽鼓管炎等多發(fā)性漿膜炎，甚至能夠引起豬的肺炎，是引起豬地方性肺炎的重要病原[1-2]。豬鼻支原體一般由大豬或母豬傳染給小豬，該病原引起的多發(fā)性漿膜炎一般多發(fā)生在3～10 周齡小豬，一旦豬群中有感染病例,會(huì)很快在豬群中傳播。目前，豬鼻支原體的感染在國內(nèi)外豬群中已經(jīng)相當(dāng)普遍[3-5]。越來越多的研究表明，人的一些癌癥的發(fā)生與體內(nèi)的豬鼻支原體存在相關(guān)性[6-8]，這更加引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

豬鼻支原體引起多發(fā)性漿膜炎和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎[9-11]，臨床上易與副豬嗜血桿菌病等多種疾病混淆，使鑒別診斷難度增大，一般以分離到病原體作為確診依據(jù)。但豬鼻支原體的分離培養(yǎng)程序復(fù)雜,花費(fèi)時(shí)間長,分離率較低,容易耽誤治療時(shí)機(jī)，且易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此，急需建立一種敏感、快速的分子生物學(xué)診斷方法。鑒于此，本研究探索了豬鼻支原體套式PCR檢測(cè)技術(shù)，以期為快速診斷與預(yù)防豬鼻支原體的感染提供重要的技術(shù)手段。

1 材料和方法

1.1 菌株

豬鼻支原體 CVCC361 標(biāo)準(zhǔn)菌株購自北京豫鼎鑫捷科技有限公司，副豬嗜血桿菌(Hps)、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(App)、豬鏈球菌(SS)、豬肺炎支原體(Mhp)、豬瘟病毒(CSFV)、豬流感病毒(SIV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)由韶關(guān)學(xué)院動(dòng)物疫病診斷中心聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑

DNA提取試劑盒、TaqDNA酶、dNTP、DL5000 DNA Marker購自北京艾德萊生物科技有限公司。

1.3 引物

根據(jù) GenBank 公布的豬鼻支原體P69基因序列，采用引物設(shè)計(jì)軟件(Oligo 7)設(shè)計(jì) 2 對(duì)引物，其中，外套引物 P1、P2的擴(kuò)增長度為 1 295 bp,內(nèi)套引物 P3、P4 的擴(kuò)增長度為 871 bp。引物序列如下， P1：5′-CTATTCGTTATTGTGCCTTGGG-3′、P2：5′-TTCTGTTCTTTCTCCTGCTTGG-3′;P3：5′-AGAAAGCAACATTCGCTGAACCAC-3′、P4：5′-TAATAAAGACCCGCCAACTGAACCT-3′，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 DNA提取

分別用細(xì)菌和病毒基因組 DNA 提取試劑盒提取豬鼻支原體和其他菌株或毒株的基因組。待檢病料經(jīng)研磨、煮沸10 min 后離心，上清作為模板。

1.5 套式 PCR 反應(yīng)方法

第 1 次PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer(Mg2+Free)2.5 μL,25 mmol/L MgCl22.0 μL,2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL,TaqDNA聚合酶0.2 μL,10 μmol/L上、下游引物各 0.5 μL，豬鼻支原體DNA模板提取液 1 μL，滅菌超純水補(bǔ)至總體積 25 μL。反應(yīng)程序經(jīng)優(yōu)化確定為：95 ℃ 預(yù)變性2 min；94 ℃ 變性30 s，56 ℃ 退火30 s， 72 ℃ 延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 10 min。再以第 1 次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板(生理鹽水為空白對(duì)照)，采用同樣條件用內(nèi)套引物進(jìn)行第 2 次 PCR 擴(kuò)增[12]。擴(kuò)增產(chǎn)物采用 1%瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.6 特異性試驗(yàn)

以豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、豬鏈球菌、豬瘟病毒、豬流感病毒、豬圓環(huán)病毒的基因組 DNA 或 cDNA 為模板，采用相同的引物和反應(yīng)條件進(jìn)行套式 PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)方法的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn)

測(cè)定前述方法提取的豬鼻支原體的基因組DNA含量，用滅菌蒸餾水進(jìn)行101—1010倍倍比稀釋，分別以這10 個(gè)梯度稀釋的DNA作為模板，按上述的套式PCR方法進(jìn)行 2 次擴(kuò)增，采用 1%瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測(cè)2 次擴(kuò)增產(chǎn)物，從而確定反應(yīng)的敏感性。

1.8 套式 PCR 方法對(duì)臨床樣品的檢測(cè)

應(yīng)用建立的套式 PCR 方法對(duì)粵北地區(qū)采集的 23 份豬肺組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，以檢驗(yàn)建立的套式PCR診斷方法的臨床應(yīng)用效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性試驗(yàn)結(jié)果

特異性試驗(yàn)結(jié)果(圖1、圖2)顯示，第1次和第2次 PCR分別只能擴(kuò)增出豬鼻支原體大小為 1 295 bp和 871 bp 的片段，與預(yù)期大小相符。而其他對(duì)照細(xì)菌、毒株均未擴(kuò)增出目的片段，表明建立的套式 PCR 診斷方法特異性好。

M:DL5000 DNA Marker； 1：豬鼻支原體； 2：豬肺炎支原體； 3：副豬嗜血桿菌； 4：豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌； 5：豬鏈球菌； 6：豬瘟病毒； 7：豬流感病毒； 8：豬圓環(huán)病毒； 9：空白對(duì)照。圖2同圖1 第1次PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

圖2 第2次PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

從豬鼻支原體菌液中提取DNA，質(zhì)量濃度為14 ng/μL。 敏感性試驗(yàn)結(jié)果如圖3、圖4所示，第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)極限為 0.14 ng/μL，而第2次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)極限為1.4×10-5ng/μL。套式 PCR 檢測(cè)的敏感性是普通PCR 的104倍，表明該套式 PCR 檢測(cè)方法具有很高的敏感性。

M:DL5000 DNA Marker； 1—10分別表示豬鼻支原體DNA 稀釋倍數(shù)依次為101—1010。圖4同圖3 第1次PCR 的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

圖4 第2次PCR 的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

利用建立的豬鼻支原體套式 PCR 診斷方法共檢測(cè)了 23 份臨床疑似豬鼻支原體感染的病料，檢出陽性病料樣品 17 份，陽性檢出率為73.9%。

3 結(jié)論與討論

鑒于豬鼻支原體對(duì)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)具有極大危害，為防控該病，有必要加強(qiáng)對(duì)該病原的快速、準(zhǔn)確診斷。由于豬鼻支原體的分離培養(yǎng)程序復(fù)雜,花費(fèi)時(shí)間長,分離率較低,且易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此，通過分離鑒定來確診豬鼻支原體存在弊端，常規(guī)分離鑒定方法并不適合該病的快速準(zhǔn)確診斷。免疫學(xué)檢測(cè)及分子生物學(xué)檢測(cè)常用于豬鼻支原體的診斷，如陳冬杰等[13]建立的豬鼻支原體抗體間接ELISA檢測(cè)方法，可以檢測(cè)血清中豬鼻支原體的抗體水平，具有較高的特異性和敏感性。 PCR 方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，常被應(yīng)用于豬鼻支原體早期感染的檢測(cè)，具有常規(guī)分離診斷方法無法比擬的優(yōu)勢(shì)。但Makhanon 等[14]研究表明，豬鼻支原體普通單套 PCR 的敏感性較低，不能滿足臨床樣品檢測(cè)的要求。本研究根據(jù)GenBank上已收錄的豬鼻支原體P69基因序列，設(shè)計(jì)合成2 對(duì)引物，經(jīng)過 PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了豬鼻支原體的套式 PCR快速診斷方法。檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照菌株的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；第1次 PCR 檢測(cè)的靈敏度為0.14 ng/μL，而第2次PCR 檢測(cè)的靈敏度達(dá)到1.4×10-5ng/μL，表明該套式 PCR 診斷方法具有很高的敏感性。由于套式 PCR 方法檢測(cè)的敏感性遠(yuǎn)高于普通 PCR，甚至可與熒光定量 PCR 方法相當(dāng)，而所用設(shè)備、試劑與普通 PCR一樣，不需要熒光定量 PCR 檢測(cè)方法所要求的特殊設(shè)備與試劑，更適合基層使用。

本研究建立的套式 PCR 診斷方法具有良好的準(zhǔn)確性、特異性、敏感性，并且待檢病料不需繁雜的DNA提取過程，只需研磨、煮沸后直接檢測(cè)，可以在短時(shí)間內(nèi)快速檢測(cè)出低含量的豬鼻支原體，為豬鼻支原體的快速檢測(cè)及早期發(fā)現(xiàn)和治療奠定了基礎(chǔ)。

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Establishment and Application of Nested PCR Assay for Detection ofMycoplamsahyorhinis

PENG Ling,LIU Boting,YANG Xufu

(Yingdong College of Life Science,Shaoguan University/Joint Laboratory of Animal Infectious Diseases Diagnostic Center-Harbin Veterinary research Institute of Chinese Academy of Agriculture Science,Shaoguan 512005,China)

In order to develop a rapid detection mehthod forMycoplamsahyorhinis,two pairs of primers were designed according to theP69 gene sequence ofMycoplamsahyorhinisin the study,and the nested PCR method forMycoplamsahyorhinisdetection was established.And then the specifity,sensitivity and clinical tests were carried out.The results showed that the sensitivity of the assay was reached to 1.4×10-5ng/μL,and the detection method had no cross reaction with common bacterium and virus DNA from pig.In addition,twenty-three clinical specimens were detected by the nested PCR assay and the results demonstrated the positive rate was 73.9%.The nested PCR assay established in this study had the advantages of high specificity and high sensitivity,and could be used in clinical diagnosis ofMycoplamsahyorhinis.

Mycoplamsahyorhinis； nested PCR； detection

2016-11-10

韶關(guān)市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(2014CX/K294)；粵北生豬生產(chǎn)及疫病防控協(xié)同創(chuàng)新發(fā)展中心資助項(xiàng)目；廣東省公益研究與能力建設(shè)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(2014A020208140)

彭 凌(1975-)，男，江西奉新人，副教授，碩士，主要從事動(dòng)物疫病防控、病原學(xué)及分子流行病學(xué)研究。 E-mail:penglingfx@126.com

S852.62

A

1004-3268(2017)04-0121-03