劉佳麗王維王子萌范芳梅馬毓蓉余林何於娟

1重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科（重慶400016）2重慶醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院,臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室（重慶400016）3重慶市第六人民醫(yī)院（重慶400080）

·基礎研究·

小鼠急性未分型流感嗜血桿菌中耳炎差異基因的互作網(wǎng)絡特征分析

劉佳麗1王維2，3王子萌2范芳梅2馬毓蓉2余林1何於娟2

1重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科（重慶400016）2重慶醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院,臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室（重慶400016）3重慶市第六人民醫(yī)院（重慶400080）

目的利用基因表達數(shù)據(jù)庫（GEO）查找小鼠中耳炎表達譜基因芯片原始數(shù)據(jù)，建立中耳炎基因互作網(wǎng)絡圖。方法從公共數(shù)據(jù)庫GEO中下載小鼠中耳炎相關數(shù)據(jù)集，采用Affymetrix Expression Console軟件和Tran?scriptome Analysis Console（TAC）軟件篩選差異表達基因，將差異基因導入STRING在線數(shù)據(jù)庫進行分析，繪制差異基因互作網(wǎng)絡圖，并將互作網(wǎng)絡數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.4.0軟件中，篩選網(wǎng)絡中心節(jié)點，并取其中相對獨立、作用較為集中且與炎癥基因相關子網(wǎng)絡，采用David在線工具對其進行功能注釋富集分析。結果共篩選出1166個差異表達基因，其中表達上調793個，表達下調373個，經(jīng)STRING在線工具篩選后共有459個小鼠中耳炎差異基因編碼的蛋白存在相互作用，并得到相應蛋白互作網(wǎng)絡，分析其中與炎癥相關子網(wǎng)絡。結論本研究利用生物信息學技術構建了中耳炎差異基因互作網(wǎng)絡，其中的網(wǎng)絡中心節(jié)點基因，對于中耳炎分子機制研究及靶向治療具有指導作用。

未分型流感嗜血桿菌；中耳炎；基因芯片；互作網(wǎng)絡

Funding:This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(csfc81373151),supported by the National Natural Science Foundation of China（cstc2012jjA10014）,supported by the Project Foundation of Chongqing Municipal Education Committee（KJ130313）,supported by National Key Clinical Specialties Construction Program of china.

Declaration of interest:The authors report no conflict of interest．

中耳炎（Otitis media,OM）是兒童時期最常見的感染性疾病之一[1]。在歐美國家，3歲以下兒童發(fā)病率高達80%[2,3]。大部分兒童在一般治療后痊愈，少數(shù)患兒發(fā)展為復發(fā)性或慢性中耳炎（Chronic otitis media），表現(xiàn)為中耳炎反復發(fā)作或遷延不愈，嚴重時造成進行性聽力下降，影響患兒生活質量[4,5,6]。但至今其機制仍不十分明確。已有研究證實中耳炎期間有大量的基因參與了疾病的發(fā)生發(fā)展過程，如Fbxo11或者Evil基因缺失會導致小鼠自發(fā)性中耳炎的發(fā)生[7,8]，TNF-ɑ、IL-6、IL-1等炎癥基因以及Toll樣受體也參與了中耳炎的發(fā)生[9,10]。目前GEO數(shù)據(jù)庫已有關于中耳炎小鼠的基因芯片研究，經(jīng)生物信息學分析后篩選出大量差異基因[9]。為進一步了解這些基因產(chǎn)物之間的相互作用及其在中耳炎發(fā)生中的作用，我們采用生物信息學方法繪制出差異基因互作網(wǎng)絡圖，并篩選出其主要網(wǎng)絡中心節(jié)點，將有助于拓展中耳炎致病機制的研究思路，并為中耳炎治療提供指導作用。

1 材料與方法

1.1材料

本研究所用數(shù)據(jù)是小鼠急性中耳炎基因芯片表達譜數(shù)據(jù)（GSE66141），來源于美國國立生物信息中心（National Center for Biotechnology Informa?tion,NCBI）基因表達數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omni?bus,GEO），在GEO數(shù)據(jù)庫中以Otitis Media為檢索詞進行搜索，獲得Nick Webster提交的GSE66141芯片數(shù)據(jù)。本研究中芯片數(shù)據(jù)采用Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Array平臺，并且文章中所用芯片數(shù)據(jù)共包含30個樣本（包含6個時間點的實驗組與對照組、以及未處理組均生物學重復兩次，小鼠第1天炎癥基因表達達到最高峰）[11]。本研究中小鼠急性中耳炎模型所用細菌為未分型流感嗜血桿菌，此細菌是急性中耳炎最常見的致病菌之一。

1.2方法

1.2.1 數(shù)據(jù)處理及差異基因分析采用Affymetrix Expression Console software和Transcriptome Analy? sis Console（http://www.affymetrix.com/estore/index. jsp）對芯片數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。將GSE66141原始數(shù)據(jù)導入Affymetrix Expression Console軟件，采用單因素方差分析（one-way Between-Subject ANO?VA），將樣本數(shù)據(jù)（GSE66141芯片數(shù)據(jù)取第1天時間點）按照中耳炎組、生理鹽水組進行差異比較，對數(shù)據(jù)信息進行有效過濾，從而篩選差異基因，篩選條件為：Fold Change＜-2 or Fold Change＞2,P＜0.05。

1.2.2中耳炎差異基因互作網(wǎng)絡分析STRING蛋白質相互作用關系數(shù)據(jù)庫能通過基因間的基因組相關性來預測其編碼蛋白質之間的相互關系，是目前最大的且應用最廣泛的蛋白質數(shù)據(jù)庫之一。將篩選出的1166個中耳炎差異基因（上調基因793個，下調基因373個）導入STRING（http://string-db.org）生物信息在線工具，分析差異基因所編碼蛋白之間相互作用，并在線繪制差異基因所編碼蛋白互作網(wǎng)絡圖。

1.2.3 挖掘互作網(wǎng)絡中心節(jié)點Cytoscape軟件是一個開放源碼的生物信息分析軟件，可用于構建可視化的分子交互作用網(wǎng)絡，并可將已有基因表達信息整合進此網(wǎng)絡中，觀察分子之間如蛋白質與蛋白質間的關聯(lián)性。將上述STRING在線工具所分析差異基因互作網(wǎng)絡數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.4.0軟件，進一步對互作網(wǎng)絡進行可視化分析，尋找網(wǎng)絡中心節(jié)點，并選取其中相對獨立、作用較為集中且與炎癥相關的子網(wǎng)絡繪圖，同時將子網(wǎng)絡所包含蛋白在pubmed中進行文獻檢索來驗證分析中耳炎發(fā)展過程中可能涉及的分子基礎。

1.2.4 炎癥相關子網(wǎng)絡功能注釋富集分析和通路分析DAVID生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫可為大量基因或蛋白提供詳細的生物學注釋信息。將所篩選炎癥相關子網(wǎng)絡所涉及基因上傳DAVID（https://da?vid.ncifcrf.gov/）在線分析軟件，對這些差異基因進行GO功能注釋富集分析以及生物學信號通路和京都基因與基因組百科全書分析，以便闡述子網(wǎng)絡中基因所包含生物學意義。

2 結果

2.1中耳炎差異基因互作網(wǎng)絡將從GEO數(shù)據(jù)庫獲取的中耳炎基因芯片原始數(shù)據(jù)用生物信息

學方法分析后得到1166個差異基因，經(jīng)STRING在線工具分析蛋白網(wǎng)絡后，共有459個基因編碼蛋白存在相互作用，并構成復雜基因互作網(wǎng)絡（圖1），并且由圖可以觀察到網(wǎng)絡中心節(jié)點不僅與周邊節(jié)點之間存在相互作用，還與其他中心節(jié)點之間存在相互作用。

圖1 急性中耳炎差異基因互作網(wǎng)絡圖Fig.1 Interaction network of the diffetentially expressed genes in acute otitis media

2.2炎癥相關蛋白互作子網(wǎng)絡經(jīng)Cytoscape對網(wǎng)絡進行可視化分析，并選取相互作用較為集中且與炎癥相關子網(wǎng)絡進行分析，選取子網(wǎng)絡中心節(jié)點蛋白在pubmed中進行文獻檢索驗證后，得到以fpr1（甲酰肽受體1）、cxcr2（趨化因子C-X-C基序受體2）、Irg1（炎癥反應基因1）、cxcl5（趨化因子C-X-C基序配體）等為重要節(jié)點的子網(wǎng)絡（圖2），其中包含40個表達異常的蛋白質（表1）。

圖2 急性中耳炎炎癥相關蛋白互作子網(wǎng)絡Fig.2 Interaction subnetwork of inflammation-related protein in acute otitis media

表1 中耳炎炎癥相關子網(wǎng)絡涉及基因及其在基因芯片中差異倍數(shù)Table.1 The genes in infalmmation-related interaction subnetwork and their fold changes by microarray

2.3 子網(wǎng)絡功能注釋富集分析將上述子網(wǎng)絡涉及基因數(shù)據(jù)導入DAVID在線分析工具，并對GO分類p值取0.05過濾后發(fā)現(xiàn)，子網(wǎng)絡共涉及16種GO生物學過程（biological process，BP）分類（表2），這些基因主要參與炎癥應答、創(chuàng)傷反應、趨化、免疫反應等生物學過程。

表2 子網(wǎng)絡功能注釋富集分析（生物學過程）Table.2 The function annotation of the interaction subnetwork(biological process)

3 討論

中耳炎是兒童時期最常見的感染性疾病之一，多種基因均參與其發(fā)病過程。但目前對中耳炎研究主要傾向于傳統(tǒng)單基因方面，顯然已不能滿足當前系統(tǒng)生物學研究的需要。而對中耳炎采用高通量表達譜基因芯片檢測分析后將獲得大量關于中耳炎數(shù)據(jù)信息，包含大量差異表達基因，此時采用生物信息學方法對獲得的大量數(shù)據(jù)進行過濾，篩選在中耳炎發(fā)生過程中起關鍵作用的基因，對于后續(xù)中耳炎研究方向的拓展，以及對闡述中耳炎發(fā)生的分子機制具有重要作用。

本研究從GEO數(shù)據(jù)庫獲得小鼠中耳炎高通量表達譜芯片原始數(shù)據(jù)，通過生物信息學方法對芯片數(shù)據(jù)進行深入挖掘篩選后發(fā)現(xiàn)有459個差異基因所編碼蛋白存在相互作用，其中與炎癥相關子網(wǎng)絡包含40種異常表達蛋白質，并廣泛參與炎癥相關的多種生物學過程。其中在中耳炎中差異顯著的三個基因cxcl5、fpr1、Irg1在炎癥進程中均發(fā)揮著重要作用。提示中耳炎發(fā)生發(fā)展進程中涉及多種基因的相互作用。

cxcl5基因編碼趨化因子C-X-C基序配體5，是一種來源于上皮細胞的中性粒細胞活化肽，由致炎因子刺激產(chǎn)生，可誘導中性粒細胞黏附活性，能在脂多糖誘導的小鼠肺部炎癥中誘導中性粒細胞的轉運[12,13]。目前已有研究證實cxcl5在流感嗜血桿菌誘導的中耳炎小鼠中耳中表達上調，并且流感嗜血桿菌通過調節(jié)NF-kB的核轉運來激活Ikkβ和p38 MAPK信號通路，從而使cxcl5在中耳上皮細胞表達上調[14]，表明cxcl5確實在中耳炎發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。在本研究構建的炎癥相關子網(wǎng)絡中，我們發(fā)現(xiàn)cxcl5基因與saa3、ccl6、ccl28、cxcl3、cx?cr2、fpr1、p2ry13、gpr18、cnr1、cnr2、kng1、ppbp基因存在相互作用，并經(jīng)趨化因子信號通路、細胞因子-細胞因子受體信號通路等參與小鼠中耳炎的發(fā)生。

fpr1編碼甲酰肽受體1，是一種趨化炎癥細胞的功能受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體，在炎癥刺激下能促進中性粒細胞對細菌的清除[15,16]。研究顯示fpr1可促進中性粒細胞的趨化、產(chǎn)生活性氧、脫顆粒、表達細胞因子并誘導吞噬作用、改變細胞表面標志物的表達[17]。在肺炎鏈球菌腦膜炎小鼠模型中fpr1的缺乏將導致小鼠炎癥加重并增加患病小鼠的死亡率[18]。芯片結果顯示fpr1在小鼠中耳炎中呈高表達，提示fpr1可能參與了中耳炎的發(fā)病過程。在本研究的子網(wǎng)絡中，fpr1基因與cxcl5、cx?cl3、ccl6、ccl28、cxcr2、cnr1、cnr2、ppbp、kng1、p2ry13、Igsf6、pilra基因存在相互作用，并經(jīng)趨化因子信號通路、細胞因子-細胞因子受體信號通路參與小鼠中耳炎發(fā)生。

Irg1編碼免疫應答基因1，由巨噬細胞產(chǎn)生，是重要的免疫調控因子，脂多糖可誘導其產(chǎn)生，并通過酪氨酸激酶磷酸化及PKC激酶途徑發(fā)揮作用。有研究證實Irg1的存在可增強巨噬細胞的活性，通過抑制Irg1的轉錄后可在細菌感染過程中通過降低衣康酸在巨噬細胞的水平來降低其抗菌活性[19]。有研究發(fā)現(xiàn)阻斷巨噬細胞移動抑制因子后，可減輕小鼠急性中耳炎炎癥，并改善小鼠聽力[20]，表明巨噬細胞的功能可能與中耳炎病程相關。因此，Irg1作為巨噬細胞的產(chǎn)物，并參與調節(jié)其吞噬活性，我們推測其可能參與了中耳炎疾病進程，值得進一步深入研究。本研究構建的蛋白質網(wǎng)絡中，Irg1基因與saa3、clec5a、rnf149、marcks1、gpr84、nfkbiz、ccrl2、cxcl3、slc15a3基因存在相互作用，經(jīng)趨化因子信號通路，細胞因子-細胞因子信號通路參與小鼠中耳炎發(fā)病過程。

綜上，我們認為中耳炎的發(fā)生是涉及多種基因水平變化并相互作用的一個復雜過程，并構成了復雜基因網(wǎng)絡，其中與炎癥相關子網(wǎng)絡主要涉及cx?cl5、fpr1、Irg1等基因的作用，并廣泛參與如炎癥應答、趨化、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路等多種炎癥相關生物學進程。本研究獲得的中耳炎差異基因互作網(wǎng)絡圖不僅為中耳炎研究方向的擴展提供新思路，對于中耳炎發(fā)病機制的闡述以及分子靶向治療的研究也具有較好的提示作用。

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Interaction network analysis of differentially expressed genes in mice with unclassified haemophilus influenzae induced otitis media

Liu Jiali1,Wang Wei2,3,Wang Zimeng2,Jin Chunfang2,Fan Fangmei2,Ma Yurong2,Yu Lin1,He Yujuan2
1 Department of Otorhinolaryngology,The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016 2 College of Laboratory Medicine,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China 3 College The Sxith People’s Hospital of Chongqing City,Chongqing 400080,China Corresponding author:He Yujuan Email:yjhemail@126.com

Objective Using bioinformatics methods to analyze gene expression microarray of otitis media in order to establish a protein interaction network.Methods The microarray data sets of otitis media from the mouse were downloaded from the public gene expression database Gene Expression Ombibus(GEO).The differentially expressed genes were screened by Affymetrix Expression Console software and Transcriptome Analysis Console(TAC)software.Then the differentially expressed genes were introduced into the STRING online database for analysis,and the interaction network was established.The interaction data was subsequently introduced into the Cytoscape 3.4.0 software,and the network center nodes were screened,and those relatively independent sub-networks associated with the inflammation genes were selected.David online tools were used for functional annotation enrichment analysis of these sub-networks. Results A total of 1166 differentially expressed genes were screened out,including 793 up-regulated and 373 down-regulated.Screened by STRING,interactions of protein products from 459 differentially expressed genes were found,andthe corresponding protein interaction network was obtained.Conclusion In this study,bioinformatics techniques were used to construct the interaction network of the differentially expressed genes for otitis media.The network,especially the center node gene could provide new clues of the molecular mechanism of otitis media,and guide the targeted therapy.

Nontypeable Haemophilus influenzae;Otitis media;Microarray;Interaction network

R764.21

A

1672-2922（2017）01-94-5

2016-09-05審核人：翟所強）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.01.018

國家自然科學基金（csfc81373151）、重慶市自然科學基金（cstc2012jjA10014）、重慶市教委科學技術研究項目（KJ130313）、國家臨床重點?？平ㄔO項目經(jīng)費基金資助衛(wèi)辦醫(yī)政函[2012]649號

劉佳麗，碩士，研究方向:中耳炎發(fā)病機制

何於娟，Email:yjhemail@126.com