游玟娟,溫擁軍

(湖南化工職業(yè)技術(shù)學院,湖南株洲 412004)

游玟娟,溫擁軍

(湖南化工職業(yè)技術(shù)學院,湖南株洲 412004)

為了進一步提高洛伐他汀產(chǎn)量,對實驗組前期獲得的洛伐他汀高突變株Monascussp.UV-D-9的發(fā)酵條件進行了響應(yīng)曲面優(yōu)化。獲得最佳發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度30.4 ℃,裝液量134 mL,轉(zhuǎn)速187 r·min-1,其他條件為發(fā)酵時間10 d,接種量 8%。在此條件下,洛伐他汀的產(chǎn)量為(0.32±0.014) mg·mL-1(n=3),比原始條件的產(chǎn)量提高了10.1%。

洛伐他汀,紅曲霉UV-D-9,響應(yīng)曲面法,發(fā)酵條件,優(yōu)化

洛伐他汀(Lovastatin)是一種重要的降血脂、降膽固醇藥物,目前在臨床上應(yīng)用十分廣泛。洛伐他汀的開環(huán)羥基酸部分與體內(nèi)的羥甲戊二酰輔酶A(HMG-CoA)的化學結(jié)構(gòu)十分相似,作為底物結(jié)構(gòu)類似物,洛伐他汀會對HMG-CoA的代謝過程中的關(guān)鍵酶產(chǎn)生競爭性抑制作用導致體內(nèi)膽固醇合成量減少,從而對高膽固醇血癥、動脈粥樣硬化、高血壓等因膽固醇升高引起的疾病起到防治作用[1-5]。伴隨著生活水平的提高,近年來我國民眾飲食結(jié)構(gòu)和習慣都發(fā)生了很大改變,過多攝入高熱量、高脂質(zhì)、高膽固醇的食物導致動脈粥樣硬化、高血脂、冠心病等“富貴病”的發(fā)病率不斷提高,使得洛伐他汀等他汀類藥物的市場需求日益增大。

洛伐他汀是真菌的次級代謝產(chǎn)物,主要生產(chǎn)菌種有青霉菌、紅曲霉和土曲霉等[6-8]。微生物發(fā)酵工業(yè)中,影響產(chǎn)量的兩個關(guān)鍵因素是生產(chǎn)菌種和發(fā)酵條件。在紅曲霉發(fā)酵生產(chǎn)洛伐他汀的研究方面,對菌種改良或發(fā)酵條件優(yōu)化單獨研究的報道很多。如李盡哲[9]等利用超高壓對紅曲霉進行誘變處理,選育出一株洛伐他汀高產(chǎn)突變株HQ2,其洛伐他汀產(chǎn)量達到3.43 mg/g,相對于出發(fā)菌株提高了52.4%;李晶[10]等人研究了紅曲霉M7固態(tài)發(fā)酵工藝條件,確定固態(tài)發(fā)酵最佳工藝為發(fā)酵溫度26～28 ℃,發(fā)酵時間18～20 d,發(fā)酵基質(zhì)初始含水量50%,發(fā)酵基質(zhì)初始pH自然。但對應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化技術(shù)對發(fā)酵條件進行系統(tǒng)性研究鮮見報道。為系統(tǒng)地研究洛伐他汀生產(chǎn)的關(guān)鍵影響因素,進一步提高洛伐他汀產(chǎn)量,本課題組采用響應(yīng)曲面法對前期獲得的高產(chǎn)洛伐他汀紅曲霉突變株Monascussp.UV-D-9[11]的發(fā)酵條件進行優(yōu)化,旨在為洛伐他汀工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種:紅曲霉Monascussp.UV-D-9,為課題組通過UV與DES復合誘變處理所獲得的高產(chǎn)突變株,其在溫度為32 ℃、轉(zhuǎn)速為160 r/min的條件下發(fā)酵10 d,其洛伐他汀產(chǎn)量達到0.289 mg·mL-1,保藏于本院生物制藥國家重點實訓基地;斜面培養(yǎng)基(PDA) 馬鈴薯20%(煮爛后取汁),蔗糖2%,瓊脂2%;種子及發(fā)酵培養(yǎng)基均為PD液體培養(yǎng)基 馬鈴薯20%(煮爛后取汁),蔗糖2%;洛伐他汀標準品 純度≥98%,上海永葉生物科技有限公司。

DZ4-0.8A離心機 北京醫(yī)用離心機廠;HPS-250生化培養(yǎng)箱 哈爾濱東明醫(yī)療儀器設(shè)備廠;CBV-1500A超凈工作臺 上海瑞仰凈化裝備有限公司;QYC.210搖床 上海福瑪實驗設(shè)備有限公司;P1201高效液相色譜儀 戴安中國有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液的制備 在超凈工作臺上,取2環(huán)紅曲霉孢子至250 mL搖瓶(內(nèi)裝150 mL種子培養(yǎng)基)中,將搖瓶置于32 ℃恒溫搖床上,于160 r·min-1的轉(zhuǎn)速條件下進行培養(yǎng),直至溶液出現(xiàn)淺紅色。

1.2.2 單因素實驗方法

1.2.2.1 發(fā)酵時間對洛伐他汀產(chǎn)量的影響 取250 mL搖瓶6個(內(nèi)裝100 mL PD培養(yǎng)基),按8%比例接入種子液,置于轉(zhuǎn)速為160 r·min-1、溫度為32 ℃的搖床分別發(fā)酵2、4、6、8、10、12 d(以接種時間計,下同),測定洛伐他汀的產(chǎn)量,確定最佳發(fā)酵時間。

1.2.2.2 發(fā)酵溫度對洛伐他汀產(chǎn)量的影響 取250 mL搖瓶6個(內(nèi)裝100 mL PD培養(yǎng)基),按8%比例接入種子液,分別置于溫度分別為26、28、30、32、34、36 ℃,轉(zhuǎn)速160 r·min-1的搖床發(fā)酵10 d。

1.2.2.3 搖床轉(zhuǎn)速對洛伐他汀產(chǎn)量的影響 取250 mL搖瓶6個(內(nèi)裝100 mL PD培養(yǎng)基),按8%比例接入種子液,分別置于轉(zhuǎn)速為140、160、180、200、220、240 r·min-1,溫度為32 ℃的搖床發(fā)酵10 d。

1.2.2.4 接種量對洛伐他汀產(chǎn)量的影響 取250 mL搖瓶6個(內(nèi)裝100 mL PD培養(yǎng)基),分別接入2%、4%、6%、8%、10%、12%的種子液,于溫度為32 ℃、轉(zhuǎn)速為160 r·min-1的搖床發(fā)酵10 d。

1.2.2.5 裝液量對洛伐他汀產(chǎn)量的影響 取250 mL搖瓶6個(內(nèi)裝100 mL PD培養(yǎng)基),按8%比例接入種子液,置于轉(zhuǎn)速為160 r·min-1,溫度為32 ℃的搖床發(fā)酵10 d。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化方法 在分析單因素實驗結(jié)果基礎(chǔ)上,選取對洛伐他汀產(chǎn)量影響最為顯著的3個關(guān)鍵因素,按照Box-Behnken設(shè)計對發(fā)酵條件進行3因素3水平優(yōu)化。

1.2.4 洛伐他汀樣品液的制備 用離心試管取一定量的發(fā)酵液置于4000 r·min-1的離心機上離心15 min,取上清液經(jīng)12層紗布過濾所得澄清液體,再過0.22 μm微孔濾膜即得洛伐他汀樣品液。

1.2.5 洛伐他汀含量測定 根據(jù)文獻[12],測定條件為:色譜柱:XDB C18柱,檢測波長237 nm,流動相:甲醇∶水(體積比為70∶30),柱溫26 ℃,體積流量1.0 mL/min,進樣量20 μL。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析與處理 采用mintab15.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1 發(fā)酵時間對洛伐他汀產(chǎn)量的影響 從圖1可知,發(fā)酵時間在2～10 d內(nèi),洛伐他汀產(chǎn)量隨時間的增加而增加,在10 d時達到量高值0.281 mg·mL-1。繼續(xù)延長發(fā)酵時間,洛伐他汀產(chǎn)量基本保持穩(wěn)定。其原因是洛伐他汀是紅曲霉的次級代謝產(chǎn)物,其積累速度與菌體生長不一致,有明顯的“滯后性”,當菌體開始衰退時產(chǎn)量達到最高,之后會隨菌體的衰退而下降。因此,從時間與效益綜合考慮,發(fā)酵時間選10 d為佳。

圖1 不同發(fā)酵時間洛伐他汀生成量的變化曲線Fig.1 Change curve of fermentation time on lovastatin yield

2.1.2 發(fā)酵溫度對洛伐他汀產(chǎn)量的影響 一般來講,微生物在一定條件下發(fā)酵,均存在一個最利于發(fā)酵產(chǎn)物積累的溫度,真菌的最適發(fā)酵溫度一般在28～32 ℃左右[13]。從圖2結(jié)果來看,洛伐他汀生成量隨發(fā)酵溫度的變化曲線圖呈“鐘罩形”。單因素方差分析結(jié)果表明,溫度對紅曲霉發(fā)酵生產(chǎn)洛伐他汀存在顯著影響(p<0.05)。當發(fā)酵溫度在26～30 ℃范圍內(nèi),洛伐他汀產(chǎn)量隨溫度增加而增加,在30 ℃時達到最大值0.278 mg·mL-1。當發(fā)酵溫度超過30 ℃時,洛伐他汀產(chǎn)量隨溫度增加而下降十分明顯。其原因在于溫度過低,菌體生長緩慢而影響產(chǎn)物的生成,而溫度過高則菌體生長代謝旺盛,消耗營養(yǎng)物質(zhì)和能量較多,不利于產(chǎn)物的積累,因此,最適發(fā)酵溫度為30 ℃。

圖2 不同發(fā)酵溫度洛伐他汀生成量的變化曲線Fig.2 Change curve of fermentation temperature on lovastatin yield

圖3 不同轉(zhuǎn)速下洛伐他汀的生成量Fig.3 Production of lovastatin under different revolution

2.1.3 轉(zhuǎn)速對洛伐他汀產(chǎn)量的影響 由圖3可以看出,洛伐他汀生成量隨轉(zhuǎn)速變化的曲線圖也呈“鐘罩形”,經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)速對洛伐他汀產(chǎn)量有顯著影響(p<0.05)。當轉(zhuǎn)速為180 r·min-1時,洛伐他汀產(chǎn)量最高,達到0.294 mg·mL-1,降低或升高轉(zhuǎn)速,洛伐他汀產(chǎn)量均明顯下降。轉(zhuǎn)速對發(fā)酵結(jié)果的影響具有“兩面性”,一方面保持一定的搖床轉(zhuǎn)速能促進氣液間傳質(zhì),增加溶氧量有利于發(fā)酵,進而能提高洛伐他汀產(chǎn)量;另一方面當轉(zhuǎn)速過快時,會產(chǎn)生過大的剪切力,損傷紅曲霉菌絲體而導致產(chǎn)量下降，故最佳轉(zhuǎn)速為180 r·min-1。

2.1.4 接種量對洛伐他汀產(chǎn)量的影響 從圖4可知,接種量2%～8%范圍內(nèi),洛伐他汀產(chǎn)量隨接種量的增加而增加;但當接種量>8%后增速不明顯,當接種量>10%后反而有所下降。原因是接種細胞密度越大,則達到生長飽和的時間越短,因此適當增加接種量,能節(jié)約生產(chǎn)時間,但接種量太大則會增加制備種子液的成本。綜合考慮,應(yīng)選擇8%的接種量為最佳。

圖4 不同接種量下洛伐他汀生成量Fig.4 Production of lovastatin under different inoculum concentration

2.1.5 裝液量對洛伐他汀產(chǎn)量的影響 由圖5可知,洛伐他汀濃度隨裝液量的增加而逐漸減少,而每個搖瓶中洛伐他汀的總產(chǎn)量則隨裝液量的增加而呈先升后降的趨勢。經(jīng)單因素方差結(jié)果表明,裝液量對洛伐他汀產(chǎn)量有顯著影響(p<0.05)。原因是裝液量對液體發(fā)酵溶氧量影響較大,裝液量少時溶氧高,裝液量多時因搖瓶中的液面較高而限制了氣液間的傳質(zhì),導致溶氧低。當裝液量為120 mL時,單個搖瓶中洛伐他汀的總產(chǎn)量達到最大值為31.32 mg,此時洛伐他汀濃度也處于較高水平,為0.261 mg·mL-1。綜合考慮,裝液量宜選120 mL為佳。

圖5 不同裝液量下洛伐他汀生成量Fig.5 Production of lovastatin under different medium volume

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析

根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取對洛伐他汀產(chǎn)量有顯著影響的3個因素(即溫度(X1)、裝液量(X2)、轉(zhuǎn)速(X3)),按Box-Behnken設(shè)計進行響應(yīng)面優(yōu)化分析,其它因素控制在最佳水平,共進行15次實驗,其中中心點重復3次,用來估算誤差。

表1 Box-Behnken設(shè)計及實驗結(jié)果Table 1 Box-Behnken design and experimental results

2.2.1 模型的擬合與回歸分析 利用mintab15.0軟件對表1所得的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合,得到回歸模型:

表2 模型的方差分析Table 2 Variance analysis of model

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化的直觀分析 響應(yīng)面圖能直觀反映各因素對響應(yīng)值的影響,等高線圖則反映因素間的交互作用[14]。采用mintab15.0軟件繪制響應(yīng)面圖和等高線圖(如圖6～圖8),從圖6可以看出,當轉(zhuǎn)速固定在X3=0時,等高線呈橢圓形,說明溫度與裝液量交互作用顯著,當溫度為30.1 ℃時,裝液量在100～134.6 mL范圍內(nèi),洛伐他汀產(chǎn)量隨裝液量增加而增加,當裝液量>134.6 mL后,則隨裝液量增加洛伐他汀產(chǎn)量反而下降,當裝液量為134.6 mL時,洛伐他汀產(chǎn)量存在最大值0.3197 mg·mL-1。從圖7可以看出,當裝液量固定在X2=0時,等高線呈橢圓形,說明溫度與轉(zhuǎn)速也存在顯著的交互作用。當溫度為30.5 ℃時,轉(zhuǎn)速在160～187 r·min-1范圍內(nèi),洛伐他汀產(chǎn)量隨轉(zhuǎn)速增加而增加,而當轉(zhuǎn)速在187～200 r·min-1范圍內(nèi),洛伐他汀產(chǎn)量隨轉(zhuǎn)速增加反而下降,當轉(zhuǎn)速為187 r·min-1時,洛伐他汀產(chǎn)量存在最大值0.3175 mg·mL-1。而圖8的等高線呈圓形,說明裝液量與轉(zhuǎn)速的交互作用不顯著。

圖6 Y=f(X1,X2)響應(yīng)面立體分析和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots of y=f(X1,X2)

圖7 Y=f(X1,X3)響應(yīng)面立體分析和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of y=f(X1,X3)

圖8 Y=f(X2,X3)響應(yīng)面立體分析和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots of y=f(X2,X3)

30.4 ℃,裝液量為134 mL,轉(zhuǎn)速187 r·min-1,該優(yōu)化條件下模型預測值為0.319 mg·mL-1。驗證實驗結(jié)果為(0.32±0.014) mg·mL-1(n=3),與模型預測值基本接近,說明該擬合模型可以較好地用于結(jié)果預測。

3 結(jié)論

本實驗采用Box-Behnken設(shè)計對紅曲霉高產(chǎn)突變株Monascussp.UV-D-9發(fā)酵生產(chǎn)洛伐他汀條件進行了響應(yīng)面優(yōu)化研究。通過單因素實驗確定了對洛伐他汀產(chǎn)量影響顯著的因素及進行Box-Behnken實驗水平,即發(fā)酵溫度28～32 ℃,裝液量100～140 mL,轉(zhuǎn)速160～200 r·min-1。在此基礎(chǔ)上,運用Box-Behnken實驗設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化技術(shù)對發(fā)酵條件進行了進一步的優(yōu)化,得到最佳發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度30.4 ℃,裝液量為134 mL,轉(zhuǎn)速187 r·min-1,其他條件為發(fā)酵時間10 d,接種量8%。在此條件下,洛伐他汀的產(chǎn)量為(0.32±0.014) mg·mL-1(n=3),與模型預測結(jié)果0.319 mg·mL-1基本接近。優(yōu)化后的洛伐他汀產(chǎn)量相對于原始條件提高了10.1%。

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2.2.3 最優(yōu)條件的求解與驗證實驗 通過對模型求偏導,解逆矩陣得到回歸方程最優(yōu)解,即x1=0.21、x2=0.71、x3=0.35,轉(zhuǎn)化為實際水平可得:發(fā)酵溫度

Optimization of fermentation conditions on lovastatin yield byMonascussp.UV-D-9

YOU Wen-juan,WEN Yong-jun

(Hunan Chemical Industry Vocational Technology Institute,Zhuzhou 412004,China)

The fermentation conditions ofMonascussp. UV-D-9,which was a high-yield mutant obtained by complex mutagenesis,were optimized by Response Surface Methodology(RSM)to further improve lovastatin yield.The optimum fermentation conditions were received as follows:the fermentation temperature(X1)was 30.4 ℃,the medium volume(X2)was 134 mL,the rotation speed(X3)was 187 r·min-1,fermentation time was 10 d and inoculation amount was 8%. The lovastatin yield ofMonascussp.UV-D-9 under the optimum conditions was(0.32±0.014)mg·mL-1(n=3),which was increased by 10.1% in comparison with the original condition.

lovastatin;Monascussp.UV-D-9.;RSM;fermentation condition;optimization

2016-09-14

游玟娟(1981-),女,本科,講師,研究方向:微生物育種技術(shù),E-mail:55073160@qq.com。

湖南省教育廳科學研究項目(15C0466)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)07-0141-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.019