陳 平, 王 翔, 支三軍, 韋長梅

(淮陰師范學院 化學化工學院 江蘇省低維材料化學重點建設實驗室, 江蘇 淮安 223300)

新型兩親性二肽分子的合成與表征

陳 平, 王 翔, 支三軍, 韋長梅

(淮陰師范學院 化學化工學院 江蘇省低維材料化學重點建設實驗室, 江蘇 淮安 223300)

通過多肽液相合成的方法,利用氨基與活化酯在水與四氫呋喃混合溶劑中進行反應,高產率地合成出谷氨酸二肽分子衍生物．同時基于該二肽結構中棕櫚酸分子端位疏水性的烴基鏈與谷氨酸側基二聚乙二醇單甲醚鏈段的親水性,制備得到了一種新型的具有兩親性的二肽分子,并對其結構與性質進行了研究．

多肽液相合成; 兩親性二肽分子; 谷氨酸

0 引言

多肽類藥物及基于多肽的生物醫(yī)用材料,在各類疾病的治療過程中具有非常廣泛的應用[1]．但是由離子型氨基酸形成的多肽藥物分子,其溶解性往往會受到環(huán)境pH、鹽濃度等因素的影響,并且這些由離子型氨基酸組成的完全親水性的多肽藥物及載體,往往很難透過疏水性的細胞膜被機體所吸收[2]．而兩親性分子可以在親水性與親油性之間找到一個平衡點,類似于表面活性劑或脂質體的性質,使具有兩親性結構的多肽分子可以在水溶液中自組裝形成多樣性的結構,從而提高多肽類藥物的生物利用度[3-4]．同時,離子型多肽分子往往還會導致生物體內帶相反電荷生物分子的聚沉,引起生物毒性效應,從而限制了該類多肽分子的應用．利用合成得到的側鏈為寡聚乙二醇功能化的谷氨酸衍生物,這種側基為非離子型結構的氨基酸,由于其寡聚乙二醇側鏈的溶解性具有溫度響應性,因此該新型氨基酸單體也被用于制備溫度響應性的聚多肽[5]和構建多肽水凝膠體系[6]的研究中．但是這些通過開環(huán)聚合方法得到的聚多肽結構,通常不具有確定的、單一的分子量,其分子量分布在某一范圍內,并且聚多肽合成過程的條件一般較為苛刻,需要在無水、無氧且聚合單體純度較高的條件下,才能合成出分子量分布較窄的聚多肽結構．

本文基于多肽液相合成的方法,不需要對氨基酸單體進行化學修飾保護,在四氫呋喃與水的混合溶劑中,能夠高產率地合成出谷氨酸二肽分子衍生物．并且在該二肽分子的端位上引入了一段疏水性的烴基鏈段,同時利用氨基酸側鏈寡聚乙二醇鏈段的溫度響應性,合成出了一種新型的具有兩親性的二肽分子．

1 實驗部分

1.1 材料與主要試劑

L-谷氨酸(上海吉爾生化,99%),N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC,上海吉爾生化,99%),N-羥基丁二酰亞胺(阿拉丁試劑,NHS,99%),4-二甲氨基吡啶(阿拉丁,DMAP,99%),棕櫚酸(阿法埃莎試劑,Pal,99%)購買后未經進一步純化直接使用．四氫呋喃(THF)經高純氮鼓泡除氧再利用活性氧化鋁柱干燥后使用．去離子水(電阻率>18 MΩ·cm-1)通過Millipore Milli-Q純化系統(tǒng)獲得．1H-NMR使用Bruker AV400 FT-NMR核磁共振儀測定．

1.2 γ-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)酯-左旋-谷氨酸(L-EG2-Glu)的合成

在燒瓶中加入25 mL二乙二醇單甲醚,攪拌下加入5 g谷氨酸,形成白色懸濁液,于0℃冰水浴中緩慢滴加3 mL濃硫酸,滴加完畢后緩慢升溫至室溫,在室溫下攪拌過夜．反應結束后溶液變澄清,將其緩慢滴加到三乙胺(12 mL)的異丙醇(48 mL)溶液中產生白色沉淀,經離心分離得到白色固體,用過量的異丙醇洗滌2次,經真空干燥后最終得到L-EG2-Glu,產率為48%．1H-NMR(400 MHz,D2O):δ4.31-4.22(t,2H),3.82-3.72(m,3H),3.72-3.64(m,2H),3.63-3.56(m,2H),3.39-3.32(s,3H),2.66-2.49(m,2H),2.25-2.07(m,2H);ESI-MS(m/z)[M+H]+Calcd C10H19NO6,250.1;found 250.1.

圖1 γ-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)酯-左旋-谷氨酸(L-EG2-Glu)的合成

1.3 棕櫚酸活化酯(Pal-NHS)的合成

如圖2所示,取棕櫚酸(4.0 g),1.1倍當量的N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(3.540 g),1.05倍當量的N-羥基丁二酰亞胺(1.885 g),0.01倍當量的DMAP(0.019 g),無水四氫呋喃約30 mL,冰水浴中反應5 min后,溶液變成乳白色,有大量不溶物N,N′-二環(huán)乙基脲(DCU)產生．反應過夜后,置于4℃冰箱約1 h后,過濾除去大部分的DCU．再將濾液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至原體積的2/3后,再于4℃放置約4 h,過濾除去析出的DCU．繼續(xù)濃縮至原體積的1/3, 于4℃放置后,進一步過濾除去殘留的DCU．最后旋蒸濃縮后得到產物Pal-NHS,產率為90%．

圖2 Pal-NHS的合成

1.4 棕櫚酸-γ-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)酯-L-谷氨酸(Pal-EG2-Glu)的合成

首先取1.0 g Pal-NHS,溶解于10 mL THF中,然后取1.2倍當量的L-EG2-Glu(0.846 g),2.4倍當量的NaHCO3(0.570 g),加10 mL水,調節(jié)溶液pH至10左右,使L-EG2-Glu完全溶解．在冰水浴中,將谷氨酸的水溶液緩慢滴加至上述THF溶液中,反應約5 h后,用旋轉蒸發(fā)儀除去反應體系中大部分的THF,再用乙酸乙酯/鹽酸(1:1v/v)水溶液反復萃取3次．有機相用無水硫酸鎂干燥后,過濾蒸干得到Pal-EG2-Glu,產率為86%．1H-NMR(400 MHz,CDCl3):δ4.64-4.50(m,1H),4.36-4.16(m,2H),3.70-3.67(t,2H),3.66-3.62(m,2H),3.60-3.57(m,2H),3.40(s,3H),2.57-2.38(m,2H),2.28-1.69(m,4H),1.63-1.58(m,2H),1.28-1.24(m,24H),0.89-0.86(t,3H);ESI-MS(m/z)[M+Na]+Calcd C26H49NO7Na,510.4;found 510.4.

圖3 Pal-EG2-Glu的合成

1.5 棕櫚酸-(γ-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)酯-L-谷氨酸)2二肽(Pal-(EG2-Glu)2)的合成

取0.8 g Pal-EG2-Glu溶解于15 mL四氫呋喃中,然后如前述方法,依次加入相應量的DCC、NHS和DMAP,在冰水浴中反應30 min后,再于常溫下反應3 h,過濾除去產生的DCU,后經多次濃縮,并于4℃冷卻進一步除去殘留的DCU,得到連接有活化酯的谷氨酸Pal-EG2-Glu-NHS．將該產物溶解于10 mL THF,按前述方法,將相應摩爾比例的L-EG2-Glu溶解于NaHCO3水溶液中,然后在冰水浴中緩慢滴加到Pal-EG2-Glu-NHS的THF溶液中,反應過夜后,經萃取、干燥、旋蒸后得到最終的產物,產率為83%．1H-NMR(400 MHz,CDCl3):δ4.62-4.53(m,2H),4.31-4.20(m,4H),3.72-3.69(t,4H),3.66-3.64(m,4H),3.61-3.57(m,4H),3.40-3.39(d,6H),2.48-2.39(m,4H),2.27-1.70(m,6H),1.62-1.60(m,2H),1.28-1.25(m,24H),0.90-0.86(t,3H);ESI-MS(m/z)[M+H]+Calcd C36H67N2O12,719.5;found 719.5.

圖4 Pal-(EG2-Glu)2的合成

2 結果與討論

根據(jù)文獻報道的方法[5],將二聚乙二醇單甲醚與谷氨酸在濃硫酸催化的條件下發(fā)生酯化反應,制備得到γ-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)酯-左旋-谷氨酸(L-EG2-Glu)．由于寡聚乙二醇鏈段在水溶液中的溶解性具有溫度依賴性,從而在谷氨酸的側鏈上引入了具有溫度響應性的功能基團．

棕櫚酸是一種天然的飽和脂肪酸,常以甘油酯的形式普遍存在于動植物的油脂中,棕櫚酸中含有的十六個碳的烴基鏈是具有良好疏水性能的鏈段. 選擇將棕櫚酸作為兩親性多肽結構中的疏水性端基的合成策略具有原料易得且生物相容性較好等優(yōu)點．

基于多肽液相合成方法利用棕櫚酸端位羧基與N-羥基丁二酰亞胺反應制備活化酯的方法將其端位活化,具有操作簡單、易于純化并能在偶聯(lián)過程中保持氨基酸原有手性中心活性等特點．該酯化過程中,以DCC為脫水試劑、DMAP作為堿性催化劑,反應后經多次濃縮、冷卻過濾除去副產物DCU,從而高產率地制備出棕櫚酸端基連接有活化酯的結構(Pal-NHS)．

將合成得到的谷氨酸L-EG2-Glu溶解于NaHCO3的水溶液中,從而使谷氨酸中的羧基保持離子化的水溶性狀態(tài)、游離的氨基保持較強的親核性能．然后在冰水浴中,將上述谷氨酸的水溶液緩慢滴加至溶解有Pal-NHS的THF溶液中,利用氨基與活化酯的特異性反應,經洗滌、干燥后,成功合成得到了以疏水性棕櫚酸烷基為端基、溫敏性二聚乙二醇單甲醚為側鏈的谷氨酸Pal-EG2-Glu．該產物的1H-NMR(圖5-A)表征結果表明,在化學位移1～2的范圍內出現(xiàn)棕櫚酸亞甲基的特征峰,同時氨基酸側鏈中二聚乙二醇單甲醚的亞甲基的吸收峰出現(xiàn)在化學位移3～4區(qū)域內,證明通過氨基與活化酯的反應,可以高效地制備以棕櫚酸為端基、二聚乙二醇單甲醚為側鏈的谷氨酸衍生物．通過類似的方法,我們進一步利用Pal-EG2-Glu端位的羧基,也是先將其制備成活化酯的結構,然后與Pal-EG2-Glu在THF/NaHCO3的混合溶劑中反應后,最終高產率地制備得到二肽Pal-(EG2-Glu)2．該二肽分子的核磁表征的結果如圖5-B所示,可以看到,在核磁氫譜的相應化學位移處具有端位棕櫚酸與側基中乙二醇的亞甲基的相應吸收峰,并且相應的積分面積也與該分子結構中氫的數(shù)目相對應,質譜的表征結果也進一步確認了該二肽分子的結構．

圖5 Pal-EG2-Glu(A)和Pal-(EG2-Glu)2(B)的核磁氫譜

在成功合成得到了側鏈為二聚乙二醇單甲醚、端基為棕櫚酸烴基鏈的二肽結構以后,對該兩親性分子的溶解行為進行了研究．在室溫20℃左右的溫度條件下,二肽分子側鏈中的二聚乙二醇單甲醚結構具有很好的水溶性,將該二肽分子溶于水后可以形成澄清的透明溶液．通過芘熒光探針方法的研究，表明該兩親性二肽分子在20℃的水溶液中可能是以類似膠束的聚集狀態(tài)存在,其中聚集形貌與聚集機理將在后續(xù)研究中進行．由于谷氨酸側鏈上的二聚乙二醇單甲醚鏈段的溶解性具有溫度響應性,當將該二肽水溶液加熱到40℃以上時,氨基酸側鏈轉變成疏水性的結構,從而使該二肽分子由原來具有疏水性端基與親水性側鏈的兩親性結構,轉變成完全疏水性的分子結構,這也使其從水溶液中沉淀出來．因此，基于該二肽分子的溶解性質與溶液自組裝行為,有望將其應用于藥物的負載與溫控釋放的研究中．

3 結論

通過液相合成的方法,利用氨基與活化酯的反應,合成得到了以棕櫚酸為端基、二聚乙二醇單甲醚為側鏈的谷氨酸二肽分子,并對其結構和性質進行了研究．由于該二肽分子中棕櫚酸烴基具有疏水性、二聚乙二醇單甲醚的溶解行為具有溫度響應性. 該新型兩親性二肽分子在水溶液中溶解性質,對于多肽藥物的結構設計和負載釋放等方面的研究具有一定的借鑒意義．

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[責任編輯：蔣海龍]

Synthesis and Characterization of a New Type of Amphiphilic Dipeptide

CHEN Ping, WANG Xiang, ZHI San-jun, WEI Chang-mei

(Jiangsu Key Laboratory for Chemistry of Low-dimensional Materials,School of Chemistry and Chemical Engineering, Huaiyin Normal University, Huaian Jiangsu 223300, China)

Herein, we describe the synthesis and characterization of a new type of amphiphilic dipeptide. The pegylated-L-glutamic acids were prepared by coupling between diethylene glycol monomethyl ether and L-glutamic acid. The N-terminal of the peptide was modified with palmitate via the reaction of amino and active ester. The obtained dipeptide displayed amphiphilic behaviors in water due to the different solubility of terminal alkyl chain and the side methylated ethyleneglycols.

peptide synthesis in liquid phase; amphiphilic dipeptide; glutamic acid

2016-10-09

國家自然科學基金資助項目(51403073)

陳平(1983-),男,講師,博士,主要從事功能高分子材料的合成與性能研究． E-mail: chenping@iccas.ac.cn

O629.7

A

1671-6876(2017)01-0023-05