沈俊濤，修志龍

大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024

在人類社會(huì)從石油經(jīng)濟(jì)向生物質(zhì)經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)型的過程中，以細(xì)菌為基礎(chǔ)的生物轉(zhuǎn)化過程必將扮演越來越重要的角色。噬菌體感染是生物轉(zhuǎn)化過程中一直存在的一個(gè)問題，至今仍無良策，其實(shí)質(zhì)是噬菌體與細(xì)菌之間復(fù)雜的共進(jìn)化關(guān)系。隨著對(duì)噬菌體與宿主相互作用關(guān)系認(rèn)識(shí)的深入，尤其是近年來CRISPR-Cas (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated proteins) 和群體感應(yīng)信號(hào)分子對(duì)細(xì)菌的噬菌體防御作用的發(fā)現(xiàn)，為這一問題的解決帶來了更多希望。因此，本文從噬菌體與宿主的相互作用關(guān)系入手，對(duì)工業(yè)微生物領(lǐng)域急需解決的噬菌體感染問題進(jìn)行了綜述。

1　噬菌體及其感染的危害

噬菌體是一類感染細(xì)菌并在細(xì)菌內(nèi)完成復(fù)制的病毒。病理學(xué)家 Twort和微生物學(xué)家D’Herelle在1915年和1917年分別獨(dú)立發(fā)現(xiàn)了噬菌體[1-2]。一個(gè)世紀(jì)以來，圍繞噬菌體的相關(guān)研究吸引了各領(lǐng)域大批研究者的關(guān)注，這些研究對(duì)生物學(xué)尤其是分子生物學(xué)的發(fā)展起到了舉足輕重的作用[3]。這其中包括近來引發(fā)基因編輯領(lǐng)域革命的 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)[4]?，F(xiàn)在的研究表明噬菌體是地球上最豐富的生命體，在地球的物質(zhì)循環(huán)、細(xì)菌的進(jìn)化和致病性等方面都扮演著重要的角色[5]。

然而，噬菌體感染一直是微生物發(fā)酵過程中最為常見的感染問題，會(huì)給發(fā)酵企業(yè)帶來災(zāi)難性損失，并且至今沒有良策[6-8]。噬菌體的幾個(gè)特征決定了噬菌體感染的普遍性和頑固性：1) 噬菌體在自然界中有著極高的豐富性和多樣性，數(shù)量在細(xì)菌的10倍之上[5]。2) 除了以游離態(tài)存在于環(huán)境的外源噬菌體外，內(nèi)源性噬菌體 (來源于細(xì)菌自身染色體上噬菌體序列的誘導(dǎo)) 也是常見的感染形式[9]。3) 噬菌體體積小，可以順利通過一般的膜過濾系統(tǒng) (如0.22 μm)，易于擴(kuò)散[7]。4) 噬菌體基因組具有高度的可塑性 (噬菌體基因組的典型特征是模塊化的組織結(jié)構(gòu)，不同模塊往往具有完全不同的來源[10]) 和較快的增殖速率 (噬菌體一次感染可以繁殖幾十個(gè)甚至幾百個(gè)子代噬菌體[11])，能夠通過突變和重組快速適應(yīng)多種不利因素。5) 在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過程中，噬菌體已經(jīng)形成了多種針對(duì)細(xì)菌抗性系統(tǒng)的逃逸機(jī)制[12]。

事實(shí)上，噬菌體可以感染任何利用細(xì)菌或以細(xì)菌為產(chǎn)品的微生物發(fā)酵過程[8]。在乳制品行業(yè)，對(duì)這一問題的認(rèn)識(shí)和研究是最為詳細(xì)的，如 1935年研究者就發(fā)現(xiàn)了噬菌體感染現(xiàn)象，然而，80多年過去了，時(shí)至今日這一問題并沒有得到有效解決，噬菌體感染仍然是乳制品行業(yè)發(fā)酵失敗的主要原因[13]。在丙酮丁醇的工業(yè)化發(fā)酵過程中，噬菌體感染也在全球多個(gè)地方 (包括美國(guó)、日本、南非等) 有過不同程度的暴發(fā)，結(jié)果往往導(dǎo)致一個(gè)工廠長(zhǎng)時(shí)間停產(chǎn)甚至是徹底關(guān)閉[14]。據(jù)國(guó)內(nèi)相關(guān)研究團(tuán)隊(duì)報(bào)告，噬菌體感染在蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵過程中的發(fā)生率曾高達(dá)15%–30%，即使后來采取了相應(yīng)的防范措施 (包括合理的工廠設(shè)計(jì)和抗性菌株篩選)，噬菌體感染的發(fā)生率仍在 1%左右[15-17]。本課題組曾在和某公司合作進(jìn)行的克雷伯桿菌千噸級(jí)規(guī)模的中試發(fā)酵產(chǎn)1,3-丙二醇的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了噬菌體感染現(xiàn)象[18]，結(jié)果往往導(dǎo)致發(fā)酵過程中菌體大量死亡，發(fā)酵長(zhǎng)時(shí)間停滯甚至是徹底失敗，大大降低了克雷伯桿菌發(fā)酵產(chǎn)1,3-丙二醇過程的經(jīng)濟(jì)性[19]。在這些噬菌體感染的案例中，來源于環(huán)境的噬菌體和來源于宿主自身染色體上的噬菌體誘導(dǎo)共同導(dǎo)致了噬菌體感染的普遍性和頑固性[8-9]。關(guān)于噬菌體感染的報(bào)道較少的主要原因是噬菌體感染是一個(gè)陰性結(jié)果，一般的學(xué)術(shù)期刊并不支持這樣的結(jié)果發(fā)表，并且企業(yè)也不愿意將失敗的結(jié)果公布于眾。但在實(shí)際的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，噬菌體感染經(jīng)常發(fā)生，難以控制。雖然合理的工廠設(shè)計(jì)可以減少噬菌體感染，但是并不能徹底清除。更糟糕的是，一旦噬菌體感染在工廠中暴發(fā)就會(huì)迅速擴(kuò)散，從而給發(fā)酵工廠帶來巨大的損失，因?yàn)椴粌H要對(duì)所有設(shè)備進(jìn)行徹底的消毒，還要對(duì)菌種進(jìn)行重新選育，這往往會(huì)導(dǎo)致工廠長(zhǎng)時(shí)間停產(chǎn)甚至破產(chǎn)。而且微生物發(fā)酵尤其是大宗化學(xué)品的發(fā)酵每一批次的規(guī)模都達(dá)成百上千立方米，因此每一次的感染倒罐都會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[20-21]。

2　噬菌體感染及其與宿主的共進(jìn)化機(jī)制

2.1　噬菌體的感染、繁殖機(jī)制

噬菌體感染一般包括6個(gè)階段：噬菌體吸附、DNA注入、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯、噬菌體組裝和釋放[22]。所有噬菌體都需要依賴宿主完成自己的生活史。根據(jù)生活史的不同，可以將這些噬菌體分為幾類，其中大部分屬于烈性噬菌體或溫和噬菌體[23]。烈性噬菌體感染一般都會(huì)經(jīng)歷上述六個(gè)階段；而溫和噬菌體感染后還可以將其基因組整合在宿主染色體上，并隨著宿主的繁殖而復(fù)制、傳代，在某些因素的刺激下也可以從染色體上解離并導(dǎo)致宿主裂解。另外，也有少部分噬菌體處于假溶原狀態(tài)或噬菌體攜帶狀態(tài)，這是一種噬菌體和宿主共存的狀態(tài)[24]，在這種狀態(tài)下噬菌體既不會(huì)整合到宿主的染色體上也不會(huì)導(dǎo)致宿主裂解。區(qū)別在于，假溶原狀態(tài)只會(huì)在宿主處于饑餓的環(huán)境時(shí)出現(xiàn)；而噬菌體攜帶狀態(tài)則可以出現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)豐富的條件下[25]。

2.2　噬菌體和宿主的共進(jìn)化關(guān)系

在自然界中，噬菌體和宿主總是共同存在和進(jìn)化的[24]。噬菌體抗性菌株可以幫助宿主逃過噬菌體的捕食，而新的噬菌體突變體又會(huì)繼續(xù)威脅著宿主的安全[23]。在這一過程中，宿主的噬菌體抗性機(jī)制和噬菌體的適應(yīng)機(jī)制扮演著重要的角色 (圖1)[26]。

2.2.1　宿主的噬菌體抗性機(jī)制

從免疫學(xué)的角度看，細(xì)菌的噬菌體抗性機(jī)制可以分為兩大類：固有免疫和獲得性免疫[22]。前者出現(xiàn)在噬菌體生活史的各個(gè)階段，包括阻止噬菌體吸附，阻止DNA注入、剪切噬菌體核酸和流產(chǎn)感染系統(tǒng)[27]。后者主要針對(duì)噬菌體的核酸，目前，在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了 CRISPR-Cas和 pAgo(Prokaryotic Argonaute family proteins) 兩種獲得性免疫系統(tǒng)[26,28]。

噬菌體吸附是其感染的第一個(gè)階段，細(xì)菌可以通過幾種方式來阻止噬菌體吸附[22]，包括吸附受體的丟失或表達(dá)下調(diào)、受體的突變和受體的空間阻遏。阻止噬菌體DNA注入一般是通過超感染排斥蛋白來完成的[29]，這類蛋白常常由前噬菌體編碼。而當(dāng)噬菌體的核酸注入細(xì)胞后，限制性修飾系統(tǒng)會(huì)對(duì)其進(jìn)行剪切，從而破壞噬菌體感染[30]。另外，也有些細(xì)菌在感染噬菌體后會(huì)啟動(dòng)程序性死亡[31]，從而避免噬菌體的繁殖和擴(kuò)散，俗稱流產(chǎn)感染系統(tǒng)。流產(chǎn)感染系統(tǒng)主要是通過宿主中的一對(duì)毒性和抗毒性蛋白來實(shí)現(xiàn)的，正常情況下這兩種蛋白結(jié)合在一起不表現(xiàn)毒性，當(dāng)噬菌體入侵時(shí)會(huì)導(dǎo)致不穩(wěn)定的抗毒性蛋白失活，在毒性蛋白的作用下引發(fā)宿主死亡，從而終止噬菌體的繁殖和復(fù)制[32]。CRISPRCas和pAgo兩種獲得性免疫系統(tǒng)都是針對(duì)入侵的核酸的，都會(huì)在第一次入侵時(shí)獲得一小段核酸片段，并利用Cas或Ago蛋白在DNA或RNA的引導(dǎo)下對(duì)二次入侵的核酸進(jìn)行定向切割[33-34]，從而導(dǎo)致噬菌體或質(zhì)粒的感染失敗。區(qū)別在于前者僅以RNA為向?qū)35]，后者既可以利用DNA也可以利用RNA作為向?qū)36]。

另外，最近的研究也顯示，細(xì)菌的噬菌體抗性機(jī)制并不只是單個(gè)細(xì)胞的孤立行為，而是會(huì)受到群體信號(hào)分子的調(diào)控[37]。在自然界中，群體信號(hào)分子和噬菌體都對(duì)菌群密度的調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵的作用[38]。研究表明Ⅰ類群體信號(hào)分子AHL (高絲氨酰酯類群體信號(hào)分子) 可以減少大腸桿菌表面噬菌體受體的表達(dá)，從而減小 λ和 χ的吸附[39]。在鰻弧菌的研究中，兩種噬菌體抗性策略的選擇 (噬菌體受體表達(dá)降低和生物膜形成增加) 也是由Ⅰ類群體信號(hào)分子 AHL所決定的[40]。Patterson和 H?yland-Kroghsbo等最新的研究則顯示群體信號(hào)分子還可以通過調(diào)控CRISPR-Cas系統(tǒng)的活性增強(qiáng)細(xì)菌在高密度時(shí)的噬菌體抗性[41-42]。

2.2.2　噬菌體的適應(yīng)機(jī)制

盡管細(xì)菌有多種噬菌體抗性策略，在自然界中，噬菌體仍然可以以10倍于細(xì)菌的數(shù)量存在[5]。這說明噬菌體可以成功地避開細(xì)菌的多種抗病毒系統(tǒng)[12]。而這主要是由于噬菌體基因組的高度可塑性和較快的增殖速率。

噬菌體的吸附過程主要是由噬菌體的受體結(jié)合蛋白和宿主表面的受體分子 (主要是多糖和脂多糖) 的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)的[43]。噬菌體可以分泌一些水解酶去破壞覆蓋在細(xì)胞表面的莢膜或多聚糖類物質(zhì)等，而挖掘出受空間阻遏的受體，也可以通過修飾受體結(jié)合蛋白 (包括蛋白酶的剪切，基因的突變、重組和多拷貝等) 而適應(yīng)全新的受體[12]。針對(duì)細(xì)菌中廣泛存在的限制性修飾系統(tǒng)，噬菌體主要有 3種應(yīng)對(duì)方式[44]：一是限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的突變、低表達(dá)和空間阻遏；二是利用宿主的或自身攜帶的甲基化修飾酶對(duì)限制性酶切位點(diǎn)進(jìn)行修飾；三是抑制宿主限制性修飾系統(tǒng)的活性。針對(duì)一些細(xì)菌中存在的流產(chǎn)感染系統(tǒng)，噬菌體可以通過某些特定基因的突變來避免激活該系統(tǒng)，也可以分泌抗毒性蛋白類似物，從而中和毒性蛋白的作用[45]。

圖1　細(xì)菌的抗性機(jī)制和噬菌體的逃逸機(jī)制[6,12,22,26]Fig. 1 The bacterial antiviral systems and the escape of bacteriophages[6,12,22,26]. Short-dash line and question mark indicate that they have not been proved.

針對(duì)細(xì)菌的CRISPR-Cas系統(tǒng)，目前發(fā)現(xiàn)了3種不同的噬菌體逃逸機(jī)制[12]。第一類是通過噬菌體前間隔序列或前間隔區(qū)鄰接基序 (PAM) 的突變使CRISPR RNA (crRNA) 與噬菌體DNA無法配對(duì)，從而使CRISPR干擾失敗[46-47]。這是一種廣泛存在的、可針對(duì)各種CRISPR-Cas系統(tǒng)的噬菌體逃逸機(jī)制[48]。不過，即使原來的間隔序列失效了，CRISPR-Cas系統(tǒng)仍然可以繼續(xù)從噬菌體DNA上獲得新的間隔序列，從而重新對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性[8]。事實(shí)上，CRISPR-Cas系統(tǒng)可以從同一個(gè)噬菌體上獲得多個(gè)間隔序列，從而對(duì)噬菌體產(chǎn)生更強(qiáng)的抗性。正是這種可疊加性賦予了CRISPR-Cas系統(tǒng)獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。最新的研究也表明，當(dāng)一個(gè)種群內(nèi)存在足夠多的針對(duì)一個(gè)噬菌體的間隔序列時(shí)，噬菌體并不能通過突變來逃逸[49]。此時(shí)，噬菌體或許可以利用第二類逃逸機(jī)制，即通過噬菌體編碼的蛋白 (Anti-CRISPR蛋白) 干擾CRISPR-Cas系統(tǒng)的活性[50-52]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了針對(duì)I-E、I-F和II-C型CRISPR-Cas系統(tǒng)的多個(gè)Anti-CRISPR蛋白[50,53-54]。其中針對(duì)I-F型的3類Anti-CRISPR蛋白有不同的作用機(jī)制[55-56]，AcrF1和AcrF2干擾CRISPR-Cas復(fù)合物的形成，AcrF3干擾 Cas3的剪切活性，針對(duì)II-C型的Anti-CRISPR蛋白可以干擾Cas9的剪切活性[54]。第3種情況是有一些噬菌體可以劫持宿主的CRISPR-Cas系統(tǒng)以完成自身的繁殖[57]。如在霍亂弧菌噬菌體中發(fā)現(xiàn)的一個(gè) CRISPR-Cas系統(tǒng)，其可以失活一個(gè)由噬菌體誘導(dǎo)的染色體島元件編碼的抗噬菌體系統(tǒng)，從而幫助噬菌體完成自身增殖[58]。

2.3　噬菌體的專一性

噬菌體吸附是其成功感染的第一步，噬菌體的專一性一般認(rèn)為是由其吸附特異性決定的，而噬菌體尾部蛋白在這一過程中起著決定性作用[43,59]。有研究顯示僅通過替換尾部蛋白基因就可以實(shí)現(xiàn)大腸桿菌、克雷伯桿菌、耶爾森氏桿菌噬菌體專一性的相互替換[60]。

傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為噬菌體具有高度的專一性，即一個(gè)噬菌體一般只能夠感染某個(gè)特定種類的細(xì)菌甚至是某些特定的菌株[3]。但越來越多的研究顯示噬菌體的敏感性和抗性不是絕對(duì)的，不是一個(gè)非此即彼的概念[61]。尤其是在自然環(huán)境中，更多的時(shí)候可能是通過噬菌體抗性水平的差異而不是抗性的有無來實(shí)現(xiàn)菌群的動(dòng)態(tài)平衡[62]。宿主中存在的多種噬菌體的抗性機(jī)制可能是造成這種認(rèn)識(shí)差異的原因[63]，例如一個(gè)能夠正常吸附的噬菌體可能由于其他抗性機(jī)制的存在而并不能正常繁殖，而在實(shí)驗(yàn)室中這種情況往往被誤認(rèn)為是噬菌體的宿主專一性導(dǎo)致的。

3　工業(yè)發(fā)酵中噬菌體感染防治策略

3.1　控制感染源

感染源的控制是預(yù)防噬菌體感染的第一步[21]。為了控制噬菌體的來源，首先要保證環(huán)境的清潔。工廠最好選在實(shí)驗(yàn)菌種豐度較低的環(huán)境，并對(duì)所有發(fā)酵相關(guān)設(shè)備和管道等進(jìn)行滅菌處理，尤其要注意空氣系統(tǒng)的滅菌處理，因?yàn)槭删w體積小，常用的膜過濾系統(tǒng)并不能有效去除噬菌體。其次要建立噬菌體的日常檢查制度，及時(shí)發(fā)現(xiàn)噬菌體感染，避免大規(guī)模暴發(fā)。內(nèi)源性感染可能是在對(duì)工廠環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格控制后仍然無法避免噬菌體感染的一個(gè)重要原因。盡管人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到內(nèi)源性感染 (來源于細(xì)菌自身染色體上噬菌體的誘導(dǎo)) 是工業(yè)發(fā)酵過程中噬菌體感染的重要因素，但在實(shí)際生產(chǎn)過程中對(duì)發(fā)酵起始菌種中的內(nèi)源性噬菌體仍然缺少關(guān)注。

3.2　菌株輪換

菌株輪換即通過不同噬菌體敏感類型菌株的輪換使用來降低噬菌體感染的風(fēng)險(xiǎn)和噬菌體感染帶來的損失[6]。這是一種工業(yè)中常用的策略。不過，這一過程隨機(jī)性很大，選育的抗噬菌體菌株的生產(chǎn)能力可能會(huì)降低或丟失。而且噬菌體很容易通過變異來適應(yīng)之前的抗性菌。一個(gè)經(jīng)典的例子是，在一個(gè)的丙酮丁醇工廠中，一年之內(nèi)連續(xù)換了 12個(gè)菌株最終仍沒能逃過噬菌體感染的命運(yùn)[64]。

3.3　傳統(tǒng)的基因工程策略

在噬菌體感染的各個(gè)階段都可以采取相應(yīng)的基因工程方法阻止噬菌體增殖[6]。例如，可以通過對(duì)宿主菌噬菌體受體的修飾來干擾吸附過程，也可以通過人工表達(dá)一些超感染排斥蛋白來阻止噬菌體DNA注入，還可以通過人工構(gòu)建的流產(chǎn)感染系統(tǒng)去破壞噬菌體的增殖。在嗜熱鏈球菌中利用高拷貝質(zhì)粒表達(dá)一個(gè)超感染排斥蛋白 orf203可以使菌株的抗性水平顯著增強(qiáng)(EOP≤10–3)[65]。在乳酸鏈球菌中表達(dá)一個(gè)自殺性的流產(chǎn)感染系統(tǒng)[66]，當(dāng)噬菌體感染時(shí)會(huì)激活該系統(tǒng)，從而使噬菌體感染失敗，菌株抗性水平達(dá)到EOP≤10–4。在嗜熱鏈球菌中也有研究采用反義RNA技術(shù)干擾噬菌體的翻譯過程[67-68]，依賴于所針對(duì)的基因，宿主的抗性水平提高到EOP=5×10–1到 2×10–3不等。不過以上這些策略都需要對(duì)噬菌體和宿主的相互作用關(guān)系有深入的認(rèn)識(shí)，而目前人們僅對(duì)幾種常見的噬菌體和宿主有一定的了解。另外，由于噬菌體基因組的高度可塑性和快速增殖的能力，噬菌體可以通過突變快速適應(yīng)這些噬菌體抗性系統(tǒng)，這就給傳統(tǒng)的噬菌體抗性菌株構(gòu)建帶來了巨大的 困難。

3.4　基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的噬菌體防治策略

CRISPR-Cas系統(tǒng)是RNA引導(dǎo)的細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)，可用來對(duì)抗外來遺傳物質(zhì)的入侵[4]。僅需改變 20 bp左右的核酸序列就可以實(shí)現(xiàn)CRISPR-Cas系統(tǒng)的特異性切割，因此該系統(tǒng)可以方便地用來進(jìn)行核酸修飾，目前基于這一系統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)已在動(dòng)物、植物、微生物和病毒等多種生命體中有了應(yīng)用[69-70]。基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的噬菌體抗性系統(tǒng)也有著極大的優(yōu)勢(shì)[33]。在大腸桿菌[71]和枯草芽孢桿菌[72]中，成功地利用外源CRISPR-Cas9的系統(tǒng)構(gòu)建了噬菌體抗性菌株，它們的抗性水平分別提高到了 EOP=5×10–2和2×10–6。在嗜熱鏈球菌中，利用天然的CRISPR-Cas系統(tǒng)，宿主的噬菌體抗性達(dá)到了EOP=10–4和10–5的水平，并且通過兩個(gè)靶向gRNA序列的聯(lián)用，抗性水平可進(jìn)一步提高到 EOP=10–6到 10–7的水平[4]。另外，對(duì)獲得的基于 CRISPR-Cas系統(tǒng)的抗性菌株的全基因組分析也表明，在噬菌體感染前后宿主基因組僅有幾個(gè)單核苷酸突變和小片段缺失[73]，這說明基于CRISPR-Cas的免疫對(duì)宿主基因組不會(huì)產(chǎn)生明顯的影響。這對(duì)于構(gòu)建基于CRISPR-Cas的噬菌體抗性菌株至關(guān)重要。正如對(duì)抗其他噬菌體抗性機(jī)制一樣，噬菌體也可以通過快速的突變來逃避CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫作用[46-47]。不過最近的研究表明，只要靶向的gRNA序列多樣性足夠多，噬菌體就無法通過突變來逃避CRISPR-Cas系統(tǒng)的剪切作用[49]。

綜上所述，基于CRISPR-Cas的噬菌體抗性系統(tǒng)有以下優(yōu)點(diǎn) (表1)：1) 可理性設(shè)計(jì)，僅需要得到噬菌體的序列信息就可以理性設(shè)計(jì)噬菌體抗性菌；2) 操作簡(jiǎn)便，僅需改變20 bp的核酸序列就可以對(duì)特定序列實(shí)現(xiàn)特異性的剪切；3) 易開發(fā)廣譜性的噬菌體抗性菌株，僅需對(duì)不同噬菌體的保守基因進(jìn)行靶標(biāo)設(shè)計(jì)就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)噬菌體的免疫；4) 具有可疊加效應(yīng)，噬菌體抗性水平可以通過靶向序列多樣性的增加來增強(qiáng)；5) 基于 CRISPR-Cas的免疫對(duì)宿主基因組幾乎沒有影響，有利于保持菌株的發(fā)酵性能。

表1　不同噬菌體防治策略的比較Table 1 Different strategies to prevent phage infection

4　展望

在自然界中，噬菌體與宿主總是共同存在和進(jìn)化的，兩者之間存在著復(fù)雜的抗性和逃逸機(jī)制[28,31]。噬菌體感染是以細(xì)菌為基礎(chǔ)的生物技術(shù)發(fā)展過程中的一個(gè)棘手的問題。深入理解噬菌體與宿主之間的相互作用關(guān)系是解決這一問題的關(guān)鍵。

近來，噬菌體基因組編輯技術(shù)的快速發(fā)展或許能幫助我們更好地認(rèn)識(shí)噬菌體[74-75]。這些技術(shù)包括：1) 基于電穿孔 DNA的噬菌體重組工程(Bacteriophage recombineering of electroporated DNA，BRED)[76]，其主要原理是將噬菌體 DNA和模板 DNA同時(shí)通過電穿孔技術(shù)導(dǎo)入宿主的感受態(tài)細(xì)胞，然后通過PCR等技術(shù)鑒定突變體；2) 基于酵母或細(xì)菌人工染色體的同源重組技術(shù)[60]，其主要原理是將噬菌體基因組DNA插入到酵母人工染色體上，利用酵母的同源重組功能完成對(duì)噬菌體基因組的修飾，最后將含有噬菌體完整基因組的酵母人工染色體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞完成噬菌體的繁殖；3) 基于CRISPR-Cas的基因組編輯技術(shù)[77-78]，其主要原理是先構(gòu)建一個(gè)基于CRISPR-Cas的噬菌體抗性菌株，并導(dǎo)入同源重組模板，噬菌體感染后會(huì)在CRISPR-Cas系統(tǒng)的作用下發(fā)生重組。最近，有研究者通過基于酵母人工染色體的同源重組技術(shù)對(duì)多個(gè)腸道菌屬噬菌體 (包括大腸桿菌、克雷伯桿菌和耶爾森氏桿菌) 的尾部蛋白進(jìn)行替換[60]，成功實(shí)現(xiàn)了噬菌體特異性的替換。可以預(yù)見，噬菌體基因組編輯技術(shù)的快速發(fā)展必將極大地促進(jìn)我們對(duì)噬菌體的理解，從而更好地防治噬菌體。

合成生物學(xué)是另一個(gè)可能極大改變我們對(duì)噬菌體認(rèn)識(shí)的領(lǐng)域[79-80]。由于噬菌體的繁殖依賴于宿主的蛋白合成系統(tǒng)，一旦宿主的密碼子和噬菌體的不匹配，噬菌體或?qū)⒉荒軌虺晒υ鲋砙81]。已有研究發(fā)現(xiàn)將大腸桿菌的所有終止密碼子UAG替換成UAA可以增強(qiáng)宿主對(duì)T7噬菌體的抗性[82]。如果更大范圍地改變宿主的密碼子或許能從根本上避免噬菌體的感染[80,83]。合成生物學(xué)的快速發(fā)展使得成本越來越低[84]，或許在不久的將來，人們就能夠獲得人工合成的免受噬菌體感染的全新細(xì)胞。

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