侯姣姣，孫 濤，余仲東，康永祥，布芳芳，甘明旭

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100;2.陜西南宮山旅游發(fā)展有限公司，陜西 嵐皋725400）

鹽脅迫下內(nèi)生真菌對國槐幼苗生長及生理的影響

侯姣姣1，孫 濤2，余仲東1，康永祥1，布芳芳1，甘明旭1

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100;2.陜西南宮山旅游發(fā)展有限公司，陜西 嵐皋725400）

以盆栽國槐Sophora japonica幼苗為試材，進行200 mmol·L－1氯化鈉（NaCl）脅迫處理，采用菌液定量灌根法，通過測定國槐苗高增長量、根冠比、干質(zhì)量，丙二醛（MDA）質(zhì)量摩爾濃度，葉綠素、脯氨酸（Pro）質(zhì)量分?jǐn)?shù)，超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性等生理指標(biāo)，探討8株優(yōu)勢內(nèi)生真菌分別灌根對國槐幼苗生長及生理的影響。結(jié)果表明：200 mmol·L－1氯化鈉脅迫下，每種菌株處理下的國槐幼苗生物量與生理變化趨勢基本一致。菌株H-1，H-3，H-4和H-6灌根處理的國槐幼苗抗鹽能力提高，其中，菌株H-3的促進作用最明顯，幼苗高增長量、干質(zhì)量、根冠比和鮮質(zhì)量含水量顯著高于對照（ck），分別為對照的148%，117%，121%和104%，生理指標(biāo)丙二醛質(zhì)量摩爾濃度和脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為對照的88%和151%，差異分別達到顯著水平（P＜0.05）；H-5處理的國槐幼苗抗鹽能力降低，幼苗高增長量、干質(zhì)量和根冠比顯著低于對照，分別為對照的69%，83%和78%， 生理指標(biāo)脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和過氧化物酶活性為對照的81%和72%，差異分別達到顯著水平（P＜0.05）；其他菌株處理的國槐幼苗抗鹽能力不明顯。綜合各項指標(biāo)得出，H-1，H-3，H-4和H-6為促生能力優(yōu)勢菌，具有應(yīng)用潛力。圖6表1參22

植物學(xué)；內(nèi)生真菌；國槐；幼苗生長；鹽脅迫

Key words:botany;endophytic fungi;Sophora japonica;seedling growth;salt stress

內(nèi)生真菌是植物中廣泛存在的一類真菌，自BACON等［1］發(fā)現(xiàn)了高羊茅Festuca arundinacea內(nèi)生真菌與牛的中毒癥狀相關(guān)后，人們便對內(nèi)生真菌與宿主的共生關(guān)系展開了深入的研究，特別是內(nèi)生真菌能夠提高共生植物抗逆能力這一現(xiàn)象受到研究者們的關(guān)注和重視。內(nèi)生真菌與宿主在長期共處中可形成互利共生關(guān)系，除直接或誘導(dǎo)植物抗病蟲害外，可通過影響宿主植物體內(nèi)的物質(zhì)代謝、產(chǎn)生生理活性的物質(zhì)（如生長素、赤霉素以及其他活性物質(zhì)），進而改變植株的生理特性、提高植株的抗逆性和刺激植株生長［2－4］。鹽脅迫可使植物吸水困難而造成生理性干旱，引起一系列生長及生理過程的紊亂［5］，如植株生長受到抑制，葉綠素降低，丙二醛升高，保護酶活性降低等，植株細胞膜遭到嚴(yán)重破壞，葉片黃化甚至死亡。盡管國槐Sophora japonica能忍受一定程度的鹽脅迫，但在鹽脅迫下，其生長必然受到抑制。因此，本研究通過盆栽試驗，測定相同鹽脅迫條件下不同內(nèi)生真菌懸液灌根后，國槐幼苗生長和生理指標(biāo)的差異，以此來探究不同內(nèi)生真菌灌根對國槐苗適應(yīng)鹽脅迫的影響，從而了解內(nèi)生真菌對植物抗鹽脅迫的作用，為有效地利用內(nèi)生真菌資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 內(nèi)生真菌懸液的制備

菌株由本課題組病理實驗室提供，于2014年8月分離自周公廟古國槐（1 700 a）的健康葉片。將內(nèi)生真菌（表1）按照H-1，H-2，H-3，H-4，H-5，H-6，H-7和H-8的順序統(tǒng)一編號后，分別接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板培養(yǎng)基，26℃恒溫培養(yǎng)箱擴繁培養(yǎng)7～10 d后，輕輕刮取菌絲、孢子，無菌水潤洗數(shù)次后，通過BTH-329PE小型攪拌機攪拌打碎、震蕩均勻，并按濃度梯度稀釋，在顯微鏡下對菌絲片段計數(shù)，用無菌水調(diào)節(jié)使菌絲片段懸液濃度為5×103菌落形成單位·L－1，制成菌劑。

1.2 供試國槐苗的培育

盆栽試驗在陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)南校區(qū)日光玻璃溫室中進行。國槐種子采自楊凌，選取顆粒飽滿均勻、具有光澤的國槐種子，75℃熱水浸泡，自然冷卻至室溫后，置于27℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，進行催芽。

將采自楊凌的農(nóng)耕土過2 mm篩后，V（農(nóng)耕土）∶V（腐殖質(zhì)土）=1∶1，121℃高壓滅菌2 h，混合土有機質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80.12 g·kg－1，全氮3.55 g·kg－1，速效磷166.53 mg·kg－1，速效鉀541.41 mg·kg－1。將催芽露白一致的國槐種子播種于盛有等體積混合土的塑料花盆中 （花盆尺寸為直徑18 cm，高 10 cm），待幼苗生長30 d開始間苗，保留壯苗1株·盆－1。

表1 供試8株內(nèi)生真菌Table 1 8 strains of endophytic fungi for experiment

1.3 菌懸液灌根

2015年4月24日，選擇長勢良好，苗高基本一致的國槐苗，并記錄初始高度（mm）后，澆灌25 mL·盆－1預(yù)先配制的菌株懸液，處理設(shè)重復(fù)10個·菌株－1，以澆灌等量的無菌水為對照（ck）。5月4日進行第2次灌根處理。

1.4 鹽脅迫處理

鹽脅迫試驗從2015年5月8日至6月1日共持續(xù)24 d，期間隔3～4 d，各個處理同時澆灌200 mmol·L－1氯化鈉溶液100 mL。

1.5 各項生長指標(biāo)的測定

6月2日，記錄國槐苗高（mm），并將幼苗自地徑處剪斷，根部用蒸餾水洗凈，濾紙吸干表面水分，稱量地上部和根鮮質(zhì)量（g），然后分別在105℃下殺青1 h，70℃烘干至恒量，測定地上部干質(zhì)量（g）和根干質(zhì)量（g），計算國槐鮮質(zhì)量含水量（%）和根冠比。計算公式：苗高增長量=處理后苗高－處理前苗高，根冠比=根干質(zhì)量/地上部干質(zhì)量；鮮質(zhì)量含水量（%）=［（Wf－Wd）/Wf］×100%，其中Wf為鮮質(zhì)量（g），Wd為干質(zhì)量（g）。

1.6 各項生理指標(biāo)的測定

分別采集國槐幼苗相同部位的幼嫩葉片，稱取約0.1 g，液氮研磨后，轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇定容10 mL，離心8 min（4 000 r·min－1，4℃），取上清液測定葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)［6］。游離脯氨酸的測定采用磺基水楊酸提取法［7］。

制備粗酶液：稱取鮮葉約0.3 g，pH 7.8的冷磷酸緩沖液研磨并沖洗，轉(zhuǎn)移至離心管中，定容8 mL，離心15 min（10 000 r·min－1，4℃），取上清液即為粗酶液，4℃保存，并進行生理指標(biāo)測定［7－9］：超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍四唑（NBT）光還原法；過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法；丙二醛（MDA）質(zhì)量摩爾濃度測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法。

1.7 統(tǒng)計分析

運用Excel 2003和SPSS 22軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，Duncan法進行多重比較，判斷差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌懸液灌根處理對國槐幼苗生長的影響

2.1.1 苗高增長量 200 mmol·L－1氯化鈉脅迫下，8株不同內(nèi)生真菌懸液灌根處理對國槐苗高產(chǎn)生不同程度的影響（圖1）。菌株H-3和H-4處理的幼苗生長最快，苗高增量分別為對照（ck）的148%和136%，顯著高于對照（P＜0.05），表明菌株H-3和H-4灌根可減弱鹽脅迫對國槐幼苗的影響；菌株H-5和H-7灌根處理的苗高增量分別為對照的69%和80%，顯著低于對照（P＜0.05），表明菌株H-5和H-7灌根減弱了國槐苗的抗鹽生長；其他菌株處理對國槐幼苗的抗鹽生長作用不明顯。

2.1.2 干質(zhì)量和根冠比 200 mmol·L－1氯化鈉脅迫下，內(nèi)生真菌H-3灌根處理的幼苗干質(zhì)量和根冠比均顯著高于對照（P＜0.05，圖2），分別為對照的117%和121%，表明H-3灌根促進了國槐幼苗干物質(zhì)的積累，同時將更多的能量分配于根部，增大根冠比，提高了國槐苗對鹽脅迫的適應(yīng)性；而H-5處理的幼苗干重和根冠比均顯著低于對照（P＜0.05，圖2），分別為對照的83%和78%，表明H-5灌根抑制了幼苗生物量的積累，同時降低根冠比，減弱了國槐苗的抗鹽性。

圖1 不同菌株灌根處理對國槐苗高增長量的影響Figure 1 Effect of the different endophytic fungi on the growth rate of Sophora japonica

圖2 不同菌株灌根處理對國槐幼苗干質(zhì)量和根冠比的影響Figure 2 Effect of the different endophytic fungi on the dry weight and root shoot radio of Sophora japonica

2.1.3 鮮質(zhì)量含水量 含水量的大小，可說明植物的生理活動是否旺盛。200 mmol·L－1氯化鈉脅迫下，8株內(nèi)生真菌灌根處理對國槐地上部分鮮質(zhì)量含水量的影響不明顯，但對地下部分鮮質(zhì)量含水量的影響顯著（P＜0.05，圖3）。H-1，H-3，H-4和H-6灌根處理的幼苗地下部分鮮質(zhì)量含水量均顯著高于對照（P＜0.05），分別為對照的111%，104%，104%和106%，其他菌株處理與對照比較均無顯著差異，表明菌株H-1，H-3，H-4和H-6灌根可減少國槐幼苗水分的散失或增加根系對水分的吸收，緩解了國槐在鹽環(huán)境的生理干旱，從而增強國槐的耐受性。

2.2 不同菌懸液灌根處理對國槐幼苗葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

葉綠素（Chl）是植物光合作用最主要的色素，影響植物的光合速率，且其質(zhì)量分?jǐn)?shù)與葉色呈正相關(guān)，能大致反映出植物的營養(yǎng)狀況［10］。200 mmol·L－1氯化鈉脅迫下，8株內(nèi)生真菌灌根處理對國槐苗葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響差異明顯（圖4）：菌株H-1，H-4和H-6灌根處理的國槐葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著高于對照（P＜0.05），分別為3.86，3.99和4.03 mg·g－1；而H-5和H-7灌根處理的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于對照，其他菌株處理與對照無明顯差異（P＜0.05）。8株內(nèi)生真菌灌根處理對國槐苗的葉綠素a/b比值的作用效果不明顯。內(nèi)生真菌可能通過提高或降低國槐幼苗的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，來增強或降低國槐幼苗的光合作用。

圖4 不同菌株灌根處理對國槐幼苗葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和葉綠素a/b的影響Figure 4 Effect of the different endophytic fungi on the Chl content and Chla/Chlb of Sophora japonica

2.3 不同菌懸液灌根處理對國槐幼苗生理指標(biāo)的影響

2.3.1 丙二醛質(zhì)量摩爾濃度和脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù) 200 mmol·L－1氯化鈉脅迫下，菌株H-1，H-3，H-4和H-6灌根處理的國槐幼苗丙二醛（MDA）質(zhì)量摩爾濃度顯著低于對照（P＜0.05，圖5），分別為對照的88%，88%，86%和83%，表明菌株H-1，H-3，H-4和H-6灌根后抑制了丙二醛的產(chǎn)生，降低鹽分對植物的傷害；菌株H-5灌根處理的國槐幼苗丙二醛質(zhì)量摩爾濃度顯著高于對照，國槐抵抗鹽脅迫的能力最差，受到的傷害最大。就脯氨酸（Pro）質(zhì)量分?jǐn)?shù)而言，H-1和H-3處理的國槐質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為對照的140%和151%，顯著高于對照，H-5灌根處理的國槐脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為對照的81%，顯著低于對照（P＜0.05，圖5）。

2.3.2 超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物物酶（POD）活性 200 mmol·L－1氯化鈉脅迫下，H-1灌根處理的國槐葉片超氧化物歧化酶活性為對照的134%，H-4灌根處理的國槐葉片過氧化物物酶活性為對照的135%，均顯著高于對照；H-5處理的國槐葉片過氧化物物酶活性顯著低于對照，為對照的72%，可見菌株H-1和H-4灌根處理可顯著提高植物的抗逆性，有效抵御鹽脅迫對國槐幼苗的傷害，H-5灌根處理降低了國槐自身對鹽脅迫的忍受能力，而其他菌株灌根處理對國槐葉片超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性的影響不明顯（P＞0.05，圖6）。

圖5 不同菌株處理對國槐葉片脯氨酸、丙二醛的影響Figure 5 Effect of the different endophytic fungi on Pro and MDA content of Sophora japonica leaf

圖6 不同菌株灌根處理對國槐葉片超氧化物歧化酶和過氧化物物酶活性的影響Figure 6 Effect of the different endophytic fungi on SOD and POD activities of Sophora japonica leaf

3 結(jié)論與討論

200 mmol·L－1氯化鈉脅迫下，8株內(nèi)生真菌灌根處理對國槐幼苗生長表現(xiàn)出促進、抑制或無明顯作用。菌株H-3的促進作用最明顯，幼苗高增長量、干質(zhì)量、根冠比和鮮質(zhì)量含水量顯著高于對照，表明H-3灌根處理可增加國槐苗高、干物質(zhì)積累，H-4的促進作用次之；菌株H-5則抑制其生長，國槐幼苗生長勢減弱，吸收水分的能力差，地上部分的生物量積累受到抑制，其他菌株作用不明顯。葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的大小直接影響植物的光合強弱［10］，菌株H-1，H-4和H-6處理的國槐葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著高于對照，而H-5和H-7處理的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于對照，內(nèi)生真菌可能通過提高或降低國槐幼苗的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，來增強或降低國槐幼苗的光合作用。

隨著研究的深入，在植物抗逆（抗鹽）中，活性氧代謝的作用非常重要，受到越來越多人的關(guān)注，當(dāng)遇到逆境時，植物體內(nèi)的代謝會受到影響，有利于自由基的產(chǎn)生，而當(dāng)自由基積累到一定程度時，便會損傷植物的細胞膜［11］。丙二醛是植物逆境時積累的有害物質(zhì)，含量越高，說明細胞膜受到的傷害越大［12］。超氧化物歧化酶、過氧化物酶等能有效地清除自由基，是酶促防御系統(tǒng)的重要組成成分，因此，在鹽脅迫條件下,植物體內(nèi)超氧化物歧化酶等活性的增加可以提高植物的抗鹽能力。脯氨酸的積累作為植物耐鹽性評價生理指標(biāo)具有不確定性。有研究表明植物體內(nèi)游離脯氨酸的含量與植物的抗逆性成正相關(guān)性［13］，也有報道認為，脯氨酸的積累與耐鹽程度無相關(guān)性［14］，更有報道認為脯氨酸的積累是脅迫對植物傷害的結(jié)果［15］。本研究試驗結(jié)果表明：200 mmol·L－1氯化鈉脅迫下，8株內(nèi)生真菌灌根處理對國槐幼苗的生長和生理作用表現(xiàn)為正效應(yīng)、負效應(yīng)和無顯著效應(yīng)；菌株H-1，H-3，H-4和H-6灌根處理的國槐幼苗丙二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于對照，其中H-6處理的國槐葉片丙二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，表明H-6在鹽脅迫過程中較大程度抑制了丙二醛的產(chǎn)生，降低鹽分對國槐的傷害，提高了國槐幼苗的抗性；H-1處理的國槐葉片超氯化物歧化酶活性和H-4處理的國槐葉片過氧化物物酶活性顯著高于對照，H-1和H-3處理的國槐幼苗的脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于對照，從而緩解了鹽脅迫對國槐苗的傷害；而菌株H-5灌根處理的國槐幼苗丙二醛顯著高于對照，脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、過氧化物酶活性顯著低于對照，說明本處理下國槐抵抗鹽脅迫的能力最差，H-5可能是國槐的 “機會病原菌”，間接或直接降低了國槐自身對鹽脅迫的忍受能力。另外，本研究結(jié)果認為：脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化與植物的抗逆性成正相關(guān)性，與賀道耀等［13］的觀點一致。

部分植物根際微生物可以促進植物生長和養(yǎng)分吸收，提高宿主植物抗逆性，如AM真菌可顯著提高植物耐鹽性［16］，玉米Zea mays接種丁香假單胞菌Pseudomonas syringae后，可忍受對一定濃度的鹽脅迫［17］，深色有隔內(nèi)生真菌D575對鹽脅迫具有較強的耐受性［18］。本研究中，200 mmol·L－1氯化鈉脅迫下，H-1，H-3，H-4和H-6灌根處理的國槐幼苗抗鹽能力提高，且每種菌株處理下的國槐生物量與生理變化趨勢基本一致，具有應(yīng)用潛力。值得一提的是，內(nèi)生真菌侵染對宿主植物的作用具有不確定性，例如一些內(nèi)生真菌在一種植物中表現(xiàn)致病，而在另一宿主中可表現(xiàn)互惠共生，甚至在不同條件下同一種植物中，也可表現(xiàn)出不同的作用關(guān)系［19－21］，這與內(nèi)生真菌和宿主的遺傳物質(zhì)、植物營養(yǎng)供應(yīng)、溫度、土壤濕度和水分條件等均有關(guān)系，其作用機制尚需深入研究［22］。

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Effect of endophytic fungi on growth and physiology of saline stressed Sophora japonica seedlings

HOU Jiaojiao1,SUN Tao2,YU Zhongdong1,KANG Yongxiang1,BU Fangfang1,GAN Mingxu1
（1.College of Forestry,Northwest A&F University,Yangling 712100,Shaanxi,China;2.Shaanxi Nangong Mountain Tourism Development Co.,Ltd.,Langao 725400,Shaanxi,China）

To explore salt tolerance of Sophora japonica with functional endophytic fungi,eight strains of fungi（H-1 through H-8）were used to inoculate S.japonica seedlings along with 200 mmol·L－1NaCl stress added by root-irrigation.Seedling height,root/shoot ratio,dry weight,water content,chlorophyll content,proline content, malondialdehyde（MDA）content,superoxide dismutase（SOD）and peroxidase（POD）activities were detected. Results showed that with 200 mmol·L－1NaCl stress,the changes of seedling biomass were basically the same as the tendency of physiological index varied.The H-1,H-3,H-4,and H-6 strains improved salt resistance of S. japonica seedlings.Strain H-3 was significantly higher than the control（P＜0.05）for seedling height（148%）, dry weight（117%）,root/shoot ratio（121%）,and water content（104%）.Compared to the control,MDA was 88%and Pro was 151%,the difference reached significant level（P＜0.05）.Strain H-5 had the opposite affect with seedling height（69%）,dry weight（83%）,and root/shoot ratio（78%）,which were all significantly lower than the control（P＜0.05）;also proline was 81%and POD activity was 72%of the control,and the difference reached significant level（P＜0.05）.Over all,H-1,H-3,H-4,and H-6,the dominant strains among the tested endophytes,would have great potential for application.［Ch,6 fig,1 tab.22 ref.］

S718.81

A

2095-0756（2017）02-0294-07

10.11833/j.issn.2095-0756.2017.02.013

2016-03-19；

2016-05-18

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（201404302）；西北農(nóng)林科技大學(xué)重點科研專項（Z109021310）

侯姣姣，從事古樹名木保護相關(guān)研究。E-mail:985755362@qq.com。通信作者：康永祥，教授，博士，從事樹木學(xué)及古樹名木保護技術(shù)等研究。E-mail:yxkang@nwsuaf.edu.cn