福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 蔡文欣 朱碧云 陳曉峰 曹丹 廖藝楠 郭楠楠

高效殺滅松材線蟲藥物配制*

福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 蔡文欣 朱碧云 陳曉峰 曹丹 廖藝楠 郭楠楠

為了尋找高效、安全殺線蟲藥物，本研究通過實(shí)驗(yàn)考察茶皂素（TS）、甲維鹽等對松材線蟲（Bursaphelenchus xyloplilus）的毒性作用，分離、培育松材線蟲作為室內(nèi)實(shí)驗(yàn)對象，測定不同濃度TS溶液、甲維鹽溶液、TS和甲維鹽混合溶液的殺線蟲活性。結(jié)果表明，TS溶液、甲維鹽溶液、TS和甲維鹽混合溶液均具有較強(qiáng)的殺線蟲活性，10mg/mL TS和1.2mg/L甲維鹽混合溶液處理8h能100%殺滅實(shí)驗(yàn)松材線蟲。

茶皂素 甲維鹽 松材線蟲病

松材線蟲?。ㄓ址Q松樹萎蔫?。┦且环N毀滅性病害，具有發(fā)病速度快、難以防治等特點(diǎn)，對我國豐富的松材資源構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。松褐天牛(Monochamus alternatus Hope)是它的主要傳媒昆蟲，松材線蟲通過松褐天牛補(bǔ)充營養(yǎng)的傷口進(jìn)入木質(zhì)部，寄生在樹脂道中，大量繁殖最終造成松材枯萎死亡。

茶皂素（Tea sponion，TS）是從山茶科植物種子或茶籽餅粕中提取的一種五環(huán)三萜類化合物，具有表面活性、生理活性和溶血性等特點(diǎn)，可作為農(nóng)藥制備助劑和增效劑[1]。吳慧平等人的研究表明，茶皂素對松材線蟲具有選擇性致死活性和環(huán)境友好性，可用于制備殺滅松材線蟲的植物源農(nóng)藥[2]。來燕學(xué)等人的研究表明，甲維鹽能快速、高效殺滅松材線蟲，1h半致死濃度僅為0.3mg/L，具有良好的應(yīng)用前景[3]。本研究測定不同濃度茶皂素和甲維鹽混合溶液對松材線蟲的毒性作用，為開發(fā)樹干注射劑防治松材線蟲病提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 松材線蟲的分離和培養(yǎng)

供試松材從福州市閩侯縣采集，采用貝爾曼漏斗法分離松材線蟲，在鋪滿盤多毛菌（Pestalotia sp.）PDA培養(yǎng)基上28℃進(jìn)行培養(yǎng)和繁殖[4]。

1.2 供試藥劑

茶皂素粉（98%茶皂素，西安文竹生物科技有限公司），吐溫80（上海生物工程有限公司），1%甲胺基阿維菌素苯甲酸鹽（Emamectin benzoate，簡稱甲維鹽），乳油（京博農(nóng)化科技股份有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 配制實(shí)驗(yàn)試劑

（1）TS溶液配制。將含茶皂素98%的茶皂素粉溶解于無菌水中，以0.2%吐溫80為助溶劑，配置成0.5、2.5、5、7.5、10mg/ml溶液。

（2）甲維鹽溶液配制。將1%甲維鹽乳液以無菌水進(jìn)行稀釋，配置成0.3、0.6、0.9、1.2mg/L溶液。

（3）TS和甲維鹽混合溶液配制。將含茶皂素98%的茶皂素粉溶解于已配置合適濃度的甲維鹽溶液中，以0.2%吐溫80為助溶劑，配置成10mg/mL TS和0.3mg/L甲維鹽溶液、10mg/mL TS和0.6mg/L甲維鹽溶液、10mg/mL TS和0.9mg/L甲維鹽溶液、10mg/mL TS和1.2mg/L甲維鹽溶液。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法

利用浸漬法測定試劑的離體殺線活性，用尖細(xì)吸管將60條供試松材線蟲挑入1.5mL離心管，加入200μL各濃度試劑，混合均勻置于28℃恒溫箱中靜置。分別處理一定時(shí)間，2000 r/min離心5min后移去上清液，用無菌水清洗線蟲2次，加50μL無菌水復(fù)蘇4 h，在雙目解剖鏡下鏡檢，檢測線蟲的死亡數(shù)，各處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。以0.2%吐溫溶液或無菌水為對照，當(dāng)對照死亡率低于5%時(shí)，不作校正計(jì)算，殺線蟲活性強(qiáng)度分級(jí)方法[5]。

校正死亡率=（處理死亡率-對照死亡率）/（1-對照死亡率）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 TS溶液殺線蟲活力測定與分析

TS溶液作用4h后，線蟲開始出現(xiàn)死亡，死亡率隨TS溶度上升和作用時(shí)間延長而增加，10mg/mL TS溶液、處理36h時(shí)達(dá)到最高致死率（90.56%）；0.5mg/mL、2.5mg/mL低濃度TS溶液對線蟲無活性，5mg/mL TS溶液對線蟲為中強(qiáng)活性，7.5mg/mL、10mg/mL TS溶液對線蟲為強(qiáng)活性。結(jié)果表明，10mg/mL TS溶液對于線蟲具有良好的殺滅活性，線蟲死亡率和死亡速度明顯高于其他濃度，但作用36h后，死亡率未達(dá)到100%，說明單一TS溶液殺滅線蟲效果不足。

圖1 不同濃度TS溶液處理松材線蟲的死亡率

2.2 甲維鹽溶液殺線蟲活力測定與分析

甲維鹽溶液對松材線蟲具有明顯的殺滅特性，在不同濃度和時(shí)間下都具有很高的死亡率，能快速、高效地殺滅松材線蟲。1.2mg/L甲維鹽溶液、處理4h死亡率高達(dá)87.22%，處理8h達(dá)到最高致死率（93.33%），對松材線蟲為強(qiáng)活性。結(jié)果表明，1.2mg/L甲維鹽溶液能高效、快速殺滅線蟲，但作用8h后死亡率未達(dá)到100%，說明單一甲維鹽溶液殺滅松材線蟲的效果仍然有所不足。

圖2 不同濃度甲維鹽溶液處理松材線蟲的死亡率

2.3 TS和甲維鹽混合溶液殺線蟲活力測定與分析

TS和甲維鹽混合溶液具有明顯的殺滅活性，在不同濃度下處理8h線蟲死亡率均有明顯提升，0.9mg/L、1.2mg/L混合溶液處理線蟲8h死亡率均達(dá)到100%，具有良好的應(yīng)用前景。TS具有良好的農(nóng)藥增效性，10mg/mL TS和0.3mg/L甲維鹽混合溶液處理8h線蟲死亡率達(dá)92.22%，達(dá)到強(qiáng)活性，提升效果顯著，線蟲死亡率比單一采用TS或甲維鹽溶液處理有明顯提升。

圖3 不同濃度TS和甲維鹽混合溶液處理松材線蟲死亡率

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TS和甲維鹽對松材線蟲都具有良好的殺滅活性，但單一試劑殺滅效果仍有不足，TS和甲維鹽混合試劑具有更佳的殺滅特性，10mg/mL TS和1.2mg/L甲維鹽混合溶液處理8h能100%殺滅實(shí)驗(yàn)松材線蟲，具有良好的應(yīng)用前景。松材線蟲神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)達(dá)，可成為高效神經(jīng)毒劑的靶標(biāo)，甲維鹽能干擾松材線蟲的神經(jīng)生理活性，造成神經(jīng)膜電位極化，阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)，導(dǎo)致線蟲死亡[6-8]。茶皂素具有良好的農(nóng)藥生物活性和表面活性，可提升農(nóng)藥作用效果、降低農(nóng)藥使用量，可作為一種良好的植物源農(nóng)藥及環(huán)保性農(nóng)藥增效劑。我國是油茶產(chǎn)量最高、栽培面積最大的國家，每年可生產(chǎn)大量茶皂素，對于資源利用有積極意義，將帶來明顯經(jīng)濟(jì)效益。

[1]郝衛(wèi)寧，曾勇，胡美英,等.茶皂素在農(nóng)藥領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].農(nóng)藥，2010，49（2）：90-93.

[2]吳慧平，宛曉春，侯如燕,等.茶皂素殺線蟲活性測定分析[J].植物病理學(xué)報(bào)，2007，37（5）：553-555.

[3]來燕學(xué)，池樹友，王亞紅,等.殺滅松材線蟲的高效藥物篩選與毒性測定[J].浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，28（3）：479-485.

[4]方中達(dá).植病研究法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[5]王龍平，宛曉春，侯如燕,等.油茶等植物提取物及制劑抑線效果[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，40（4）：642-648.

[6]張紹生.植物線蟲病害的診斷和防治[M].福州：福建科學(xué)技術(shù)出版社，1991.

[7]閆淑萍，趙健.阿維菌素及其衍生物的合成[J].河北化工，2004(6)：6-9.

[8]耿群美，李蘭城，賈曉英.苦參堿、氧化苦參堿對小鼠腦中遞質(zhì)γ-氨基丁酸和甘氨酸含量的影響[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1992，14(1)：8-9，12.

福建師范大學(xué)2016年國家（?。┘?jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：201610394069）。通訊作者：陳曉峰，E-mail：14858095@qq.com。