李小霞　肖仲久　姜仕敏

【摘 要】為了初步探明藥劑百菌清對山茶枯斑病菌的抑菌機制，本論文進行了百菌清對病原菌相關(guān)酶活性的測定，實驗結(jié)果顯示：百菌清對山茶枯斑病菌體可溶性蛋白，還原糖，幾丁質(zhì)酶，幾丁糖含量的活性均有一定程度的影響。

【關(guān)鍵詞】山茶；枯斑病病菌；酶活性

山茶花（Camellia japonica L.）是山茶花科的常綠灌木，又名曼陽羅樹、紅茶花等，是常見的觀賞植物和藥用植物，具有涼血，止血，散瘀，消腫等功效[1]。本課題組前期鑒定了山茶枯斑病由交鏈格孢菌（Alternaria alternata）侵染引起。2016年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病害在貴州遵義發(fā)生嚴(yán)重，發(fā)病高的盆景園發(fā)病率高達33%，常引起植株大落葉，嚴(yán)重影響植株的觀賞價值和藥用價值。

本試驗前期通過室內(nèi)毒力測定發(fā)現(xiàn)，供試幾種藥劑中，75%百菌清對山茶枯斑病病菌的抑菌效果最佳，因此，為明確該藥劑抑菌機制，對75%百菌清處理后的病菌菌絲相關(guān)酶活性進行了測定，以求為抑菌機制的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

山茶枯斑病樣本分別采自遵義桐梓縣松坎鎮(zhèn)、正安縣土坪鎮(zhèn)及遵義市區(qū)鳳凰山、三閣公園，樣本經(jīng)分離、純化后置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 供試藥劑

75%百菌清（WP），購自廣東中訊農(nóng)科股份有限公司。供試藥劑其它主要包括：Tris-HCl（0.05mol/L，pH=7.5），考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，3，5-二硝基水楊酸（DNS）溶液；對二甲氨基苯甲醛試劑（DMAB試劑），0.8mol/L四硼酸鉀緩沖液（pH=9.1）；1%膠狀幾丁質(zhì)懸浮液（Rodriguex-Kabana）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌絲粗體液制備

供試菌株在PDA平板培養(yǎng)48小時（25℃），用直徑為5mm打孔器取菌蝶接入50ml PD培養(yǎng)液中，搖床中培養(yǎng)5天（120r/min，25℃），然后用75%百菌清藥劑（終濃度為25ug/ml）進行處理，以不加藥劑為對照，每個組重復(fù)處理3次。并分別在處理后1h、3h、6h、12h和24h收集菌絲，蒸餾水沖洗干凈后濾紙吸干，-20℃保存?zhèn)溆?。然后參照肖仲久等[2]的方法，進行菌絲粗提液制備。

1.3.2 可溶性蛋白質(zhì)含量的測定

參照肖仲久等[2]的方法，采用考馬斯亮藍(lán)G-250溶液測定蛋白質(zhì)含量，波長595nm處測定OD值，并繪圖。

1.3.3 還原性糖含量的測定

采用3，5二硝基水楊酸（DNS）比色法進行還原性糖的含量，于波長540nm波長處測定OD值，并繪圖。

1.3.4 幾丁糖含量的測定

取1.3.1制備的菌絲粗提液0.2ml，加入0.1ml硼酸鉀（0.8mol/L），沸水中煮沸3min，冷卻后加入3ml 1%的DMAB，36℃保溫20min，冷卻，于波長544nm處測定其OD值，并繪圖。

1.3.5 幾丁質(zhì)酶活性的測定

1%膠狀幾丁質(zhì)懸浮液參照Rodriguex-Kabana 的方法[3]，幾丁質(zhì)酶活性的測定參照顧向陽[4]等的方法，以O(shè)D值（波長544nm）為縱坐標(biāo)，藥劑處理時間為橫坐標(biāo)，繪圖。

2 結(jié)果

2.1 可溶性蛋白質(zhì)含量的測定

實驗結(jié)果顯示（圖3），75%百菌清處理山茶枯斑病病菌后，菌體內(nèi)可溶性蛋白含量在處理后1-6h呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，藥劑處理6h后菌體內(nèi)可溶性蛋白含量最高，比對照組高了26%，在處理6h后酶活性逐漸降低，并在處理24h后菌體內(nèi)可溶性蛋白含量與對照組的變化趨勢相接近。

2.2 還原性糖含量的測定

實驗結(jié)果顯示（圖4），菌體內(nèi)還原糖含量在處理后直到3h前是先升高的，3h后才開始呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，75%百菌清處理菌絲3h后還原糖含量與對照組比，差距最大，比對照組高了24.1%。在藥劑處理12h后，還原糖含量的變化趨勢與對照組水平相當(dāng)，24h后比對照低14.4%。

2.3 幾丁糖含量的測定

百菌清處理山茶枯斑病病菌后，24h內(nèi)菌體內(nèi)幾丁糖含量的變化趨勢與對照組相類似，但總體看處理組含量高于對照，處理24h后幾丁糖含量與對照組差距最大，較對照組高63%。

2.4 幾丁質(zhì)酶活性的測定

百菌清處理山茶枯斑病病原菌體后，在24h內(nèi)表現(xiàn)出起伏不定的趨勢，但總體來看，處理組較對照組高，處理24h后幾丁質(zhì)酶活性與對照組基本趨于同一水平，處理3h后處理組較對照組高39.2%。說明藥劑百菌清能提高幾丁質(zhì)酶活性，從而使菌絲無法正常生長。

3 討論與結(jié)論

研究表明，百菌清防治山茶枯斑病具有非常好的效果，為進一步完善其作用機制，明確其抑菌機理。故用可溶性蛋白，還原糖，幾丁糖變化，幾丁質(zhì)酶來測其活性。

可溶性蛋白測定結(jié)果表明：75%百菌清處理山茶枯斑病菌后的變化趨勢表明，百菌清在短時間內(nèi)誘導(dǎo)了菌體產(chǎn)生了相當(dāng)量的抗藥性基因的表達，隨著時間的延長，該類蛋白的產(chǎn)生受到了抑制，也即是藥物對該菌的抑制作用方式之一。

還原糖測定結(jié)果表明：百菌清處理組的山茶枯斑病菌體內(nèi)還原糖含量比對照組高，但效果不是很明顯，藥劑處理12h后，還原糖含量的變化趨勢與對照組相似，24h后處理組比對照低14.4%。表明百菌清處理菌絲一段時間后（12h），可阻礙山茶枯斑病菌絲從環(huán)境中吸收還原糖，從而抑制山茶枯斑病菌絲正常生長。

幾丁糖測定結(jié)果表明：百菌清處理山茶枯斑病病原菌3h，幾丁糖含量與對照組相比達最大值，24h后幾丁糖含量與對照組差距越來越大，說明在一定時間內(nèi)，百菌清對山茶枯斑病菌的生長有抑制作用，隨著時間延長，抑制作用會逐漸減弱。

幾丁質(zhì)酶測定結(jié)果表明：百菌清處理1h后，菌體內(nèi)幾丁質(zhì)酶活性顯著升高，到3h達最大值，而后逐漸降低，但仍高于對照，這表明，百菌清可能誘導(dǎo)山茶枯斑病病菌細(xì)胞壁水解酶基因的表達，進而細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性受到破壞，使病原菌生長受到抑制甚至死亡[5-7]。

【參考文獻】

[1]張艷芳，屈愛桃.山茶花的研究進展[J].中國名族醫(yī)藥雜志，2012，10（10）：41-44.

[2]肖仲久，李小霞，鄒欽.氟硅唑?qū)Π仔g(shù)白絹病菌抑制機制的初步探究[J].農(nóng)藥，2013，52（6）：439-441.

[3]Rodriguex-Kabana R et al.The determination of soil chitinase actibity： Conditions for assay and ecological studies[J].Plant and Soil，1983，75：95-103.

[4]顧向陽，胡正嘉.一種測定土壤幾丁質(zhì)酶活性的方法[J].土壤通報，1994，25（6）：284-285.

[5]管原潔，[日]副島正美.蛋白質(zhì)的定量法[M].2版.張旭，譯.北京：農(nóng)藥出版社，1981：186-188.

[6]RICHARD P，TOM M，ISABELLE G，et al.Sensitivity distribution of Septoria tritici isolates to flusilazole for consecutive years 1993，1994 and 1995 in France，Germany and the United Kingdom[J].Pestic Sci，199，54（3）：258-260.

[7]齊永志，張小風(fēng)，趙衛(wèi)松，等.梨黑星病菌對氟硅唑的敏感性及與不同殺菌劑之間的交互抗性[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2012，14（2）：165-169.

[責(zé)任編輯：田吉捷]