趙建國(guó)，曲偉紅，余敬謀，呂 璐，張 磊，譚常麗（.九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江西九江 33005；.九江學(xué)院藥學(xué)本科008級(jí)，江西九江 33005）

·藥品監(jiān)督·

10批市售僵蠶商品藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)Δ

趙建國(guó)1＊，曲偉紅1，余敬謀1，呂 璐1，張 磊1，譚常麗2（1.九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江西九江 332005；2.九江學(xué)院藥學(xué)本科2008級(jí)，江西九江 332005）

目的：采用多指標(biāo)評(píng)價(jià)市售僵蠶藥材質(zhì)量狀況，為臨床合理用藥提供參考。方法：按照2015年版《中國(guó)藥典》（一部）對(duì)市售10批僵蠶藥材外觀性狀進(jìn)行觀察，對(duì)水分、總灰分含量進(jìn)行測(cè)定，采用傅里葉變換紅外光譜法對(duì)藥材進(jìn)行鑒別，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法和高錳酸鉀滴定法分別測(cè)定有效成分蛋白質(zhì)和草酸銨的含量。結(jié)果：10批僵蠶的水分含量在2.84%～4.07%之間（RSD＜5%，n＝3），總灰分含量在7.79%～34.32%之間（RSD＜5%，n＝3）；紫外和紅外光譜圖基本相似，均能反映出蛋白質(zhì)多肽類(lèi)物質(zhì)的特征峰；蛋白質(zhì)含量在29.87%～57.19%之間（RSD＜0.5%，n＝3），草酸銨含量在0.27%～4.77%之間（RSD＜5%，n＝3）。結(jié)論：10批市售僵蠶均為正品且為炮制品；水分含量符合2015年版《中國(guó)藥典》（一部）規(guī)定，但總灰分含量未達(dá)其要求；其主要成分為蛋白質(zhì)多肽類(lèi)物質(zhì)，但有效組分蛋白質(zhì)多肽與草酸銨含量差異較大。

僵蠶；傅里葉變換紅外光譜法；蛋白質(zhì)；草酸銨

僵蠶（Bombyx batryticatus）為蠶蛾科昆蟲(chóng)家蠶（Bombyx mori Linnaeus）4～5齡的幼蟲(chóng)感染（或人工接種）白僵菌[Beauveria bassiana（Bals.）Vuillant]而致死的干燥體，具有息風(fēng)止痙、祛風(fēng)止痛、化痰散結(jié)之功效，廣泛用于高溫驚厥、癲癇、抽搐、血管神經(jīng)性頭痛、咳嗽、哮喘等癥的治療[1]。現(xiàn)代研究表明，僵蠶具有抗凝、抗驚厥、抗癌、抗氧化等多種藥理作用[2-5]。僵蠶化學(xué)成分有蛋白質(zhì)多肽類(lèi)如白僵菌素、環(huán)（D-脯-D-纈）二肽、環(huán)（S-脯-R-亮）二肽、環(huán)（D-脯-D-異亮）二肽、環(huán)（D-脯-D-苯丙）二肽等[6]，黃酮類(lèi)[7]，多糖類(lèi)[8]，有機(jī)酸類(lèi)如草酸銨、枸櫞酸銨、脂肪酸、棕櫚酸、赤蘚酸等[1]，甾類(lèi)如豆甾醇-7，22-二烯-3β，5α，6α-三醇、β-谷甾醇和甾體-11α-羥基化合物等[9]，維生素及18種微量元素等。僵蠶中主要化學(xué)成分是蛋白質(zhì)，含量約為50%，用酸水解法測(cè)得僵蠶中含有17種氨基酸殘基，其中甘氨酸含量最高，其次為丙氨酸、絲氨酸、酪氨酸、谷氨酸等[10]。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[1]僅從性狀、鑒別、水分、總灰分與醇浸出物的含量等項(xiàng)目對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行分析，并未明確規(guī)定有效成分及其含量。

僵蠶為臨床常用的一味動(dòng)物類(lèi)中藥，其抗驚厥的主要成分是草酸銨[11]和白僵菌素[3]，其抗凝、抗血栓藥效組分主要為蛋白質(zhì)多肽類(lèi)和草酸銨[12-13]。本研究擬采用定性指標(biāo)（藥材的性狀與光譜特征）、雜質(zhì)的量（水分與總灰分）和定量指標(biāo)（蛋白質(zhì)多肽類(lèi)和草酸銨含量），對(duì)從九江市藥店購(gòu)買(mǎi)的10批僵蠶樣品進(jìn)行質(zhì)量分析與評(píng)價(jià)，為僵蠶的安全、有效應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

TENSOR27傅里葉變換紅外分光光度計(jì)，包括DTGS檢測(cè)器、OPUS 5.5紅外分析軟件（德國(guó)布魯克公司）；UV-1901紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；BA300電子顯微鏡[麥克奧迪（廈門(mén)）電氣股份有限公司]；BT423S電子天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）。

1.2 藥材與試劑

僵蠶樣品（購(gòu)于九江市10家藥店，樣品批號(hào)和產(chǎn)地詳見(jiàn)表1）；溴化鉀為光譜純，高錳酸鉀、草酸鈉、濃硫酸、氯化鈣等均為分析純。

表1 僵蠶樣品的批號(hào)與產(chǎn)地Tab 1 Batch numbers and origins of B.batryticatus samples

2 方法

2.1 樣品粉末與提取液的制備

僵蠶樣品粉碎成粗粉，過(guò)二號(hào)篩，備用。分別稱(chēng)取樣品粉末約10 g，精密稱(chēng)定，用8倍量的蒸餾水在常溫下超聲（功率：1 000 W）提取2次，每次30 min，合并濾液后用蒸餾水定容至250 mL量瓶中，即得僵蠶提取液，備用。

2.2 性狀觀察

根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》（一部）規(guī)定，直接取僵蠶樣品進(jìn)行性狀鑒別。

2.3 水分測(cè)定

按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）中0832水分測(cè)定法中的第二法（烘干法）測(cè)定。具體操作如下：取僵蠶粉末2～5 g，共3份，平鋪于干燥至恒質(zhì)量的扁形稱(chēng)量瓶中，厚度不超過(guò)5 mm，精密稱(chēng)定，開(kāi)啟瓶蓋在100～105℃干燥5 h，將瓶蓋蓋好，移至干燥器中，放冷30 min，精密稱(chēng)定；再在上述溫度干燥1 h，放冷，稱(chēng)取質(zhì)量，至連續(xù)2次稱(chēng)取的質(zhì)量差異不超過(guò)5 mg為止。根據(jù)減失的質(zhì)量計(jì)算含水量（%）。含水量（%）＝（干燥前質(zhì)量－干燥后質(zhì)量）/干燥前質(zhì)量×100%。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）規(guī)定含水量不超過(guò)14%為合格。

2.4 總灰分測(cè)定

按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）中2302灰分測(cè)定法測(cè)定。具體操作如下：取僵蠶粉末3 g，共3份，置熾灼至恒質(zhì)量的坩堝中，稱(chēng)定質(zhì)量（準(zhǔn)確至0.001 g），于電爐上進(jìn)行炭化，至炭化完全隨即冷卻后，轉(zhuǎn)移至馬弗爐中，逐漸升溫至600℃，使完全灰化，降溫至200℃后從爐中取出放入干燥器中冷卻至恒質(zhì)量，稱(chēng)定并計(jì)算其總灰分含量（%）?？偦曳趾浚?）＝（灼燒前質(zhì)量－灼燒后質(zhì)量）/灼燒前質(zhì)量×100%。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）規(guī)定灰分不超過(guò)6%為合格。

2.5 紅外光譜測(cè)定

采用溴化鉀壓片的傅里葉變換紅外光譜法測(cè)定。稱(chēng)取適量經(jīng)105℃恒溫干燥的樣品粉末，與溴化鉀粉末按比例（1∶150，m/m）充分混勻，于瑪瑙研缽中研磨，用粉末壓片機(jī)壓制成半透明溴化鉀晶片，在4 000～400 cm－1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描（分辨率為2 cm－1，掃描次數(shù)32次），得到紅外光譜圖。采用OPUS 5.5紅外分析軟件對(duì)光譜圖進(jìn)行基線校正和歸一化疊加處理。

2.6 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定。精密量取“2.1”項(xiàng)下僵蠶提取液1 mL，共3份，置于50 mL量瓶中，加蒸餾水定容，于200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，記錄光譜圖和260 nm、280 nm波長(zhǎng)處的吸光度值（記為A260、A280）。其中，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/mL）＝1.45A280－0.74A260；蛋白質(zhì)質(zhì)量含量（%）＝（蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度×溶液體積×稀釋倍數(shù)）/（僵蠶粉末質(zhì)量×1 000）×100%。

2.7 草酸銨含量測(cè)定

采用高錳酸鉀滴定法[8]測(cè)定。精密量取“2.1”項(xiàng)下僵蠶提取液6 mL，共3份，置于10 mL離心試管中，加2 mL蒸餾水，于75℃水浴中滴加氯化鈣溶液（0.25 mol/ L）3 mL，使草酸鈣完全沉淀，放冷，離心（離心半徑為6 cm，2 000 r/min，下同）20 min。加約8 mL蒸餾水洗滌1次后離心20 min，用吸管吸去上清液，沉淀用1 mol/L的硫酸15 mL溶解后轉(zhuǎn)移至250 mL錐形瓶中。用0.2 mmol/L的高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，溶液由無(wú)色變?yōu)闇\紅色即為滴定終點(diǎn)。根據(jù)消耗高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積計(jì)算出草酸銨含量（草酸根88.1%以草酸銨形態(tài)存在，11.9%以其他陽(yáng)離子鹽形態(tài)存在）。草酸銨含量（%）＝（5×6 mL僵蠶提取消耗的高錳酸鉀體積×高錳酸鉀滴定液的濃度×草酸銨的摩爾質(zhì)量×250×0.881）/（2× 6×僵蠶粉末的質(zhì)量）×100%。

3 結(jié)果

3.1 性狀觀察結(jié)果

所有僵蠶樣品均略呈圓柱形，多彎曲皺縮，長(zhǎng)2～5 cm，直徑0.5～0.7 cm。表面灰黃色，被有白色粉霜狀的氣生菌絲和分生孢子。其中，3、6、10號(hào)樣品表面的石灰粉覆蓋較明顯，10號(hào)樣品可見(jiàn)明顯蟲(chóng)眼，詳見(jiàn)圖1。僵蠶頭部較圓，足8對(duì)，體節(jié)明顯，尾部略呈二分歧狀。質(zhì)硬而脆，易折斷，斷面平坦，外層白色，中間有亮棕色或亮黑色的絲腺環(huán)4個(gè)，氣微腥，味微咸。

3.2 水分與總灰分測(cè)定結(jié)果

10批僵蠶樣品的水分、總灰分含量分別在2.84%～4.07%、7.79%～34.32%之間，RSD分別在0.67%～3.97%（n＝3）、0.19%～2.90%（n＝3）之間，詳見(jiàn)表2。

圖1 僵蠶的外觀性狀Fig 1 Appearance characters of B.batryticatus samples

表2 僵蠶水分、總灰分測(cè)定結(jié)果（n＝3，%%）Tab 2 Determination results of moisture and total ash in B.batryticatus samples（n＝3，%%）

3.3 紅外光譜測(cè)定結(jié)果

10批僵蠶樣品的紅外光譜圖相似，其中在4 000～1 250 cm－1范圍內(nèi)共有峰6個(gè)，分別為3 450～3 200、1 644、1 533、2 925、2 855、1 445 cm－1。指紋區(qū)1 250～400 cm－1范圍稍有差異，詳見(jiàn)圖2。

圖2 10批僵蠶樣品的紅外光譜圖Fig 2 FTIR spectra of 10 batches of B.batryticatus samples

3.4 蛋白質(zhì)與草酸銨測(cè)定結(jié)果

10批僵蠶樣品在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)紫外吸收光譜相似，均有2個(gè)最大吸收峰，分別為210～220、260～280 nm，詳見(jiàn)圖3。10批僵蠶樣品蛋白質(zhì)與草酸銨含量分別在29.87%～57.19%、0.27%～4.77%之間，RSD分別為0.02%～0.10%（n＝3）、0.54%～4.55%（n＝3）。其中，10號(hào)樣品蛋白質(zhì)含量最高，7號(hào)樣品蛋白質(zhì)含量最低；1號(hào)樣品草酸銨的含量最高，而3號(hào)樣品草酸銨的含量最低，詳見(jiàn)表3。

4 討論

圖3 10批僵蠶樣品的紫外吸收光譜圖Fig 3 UV-Vis spectra of 10 batches of B.batryticatus samples

表3 10批僵蠶樣品蛋白質(zhì)與草酸銨含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，%%）Tab 3 Determination results of proteins and ammonium oxalate in 10 batches of B.batryticatus samples（n＝3，%%）

本次檢驗(yàn)所分析藥材的性狀符合2015年版《中國(guó)藥典》（一部）對(duì)僵蠶性狀的描述，判斷均為正品且為炮制品。10號(hào)樣品可見(jiàn)明顯的蟲(chóng)眼且中空，外觀質(zhì)量較差。僵蠶樣品的水分含量在2.84～4.07%之間，低于2015年版《中國(guó)藥典》（一部）標(biāo)準(zhǔn)14%，符合規(guī)定。而總灰分含量在7.79%～34.32%之間，高于2015年版《中國(guó)藥典》（一部）標(biāo)準(zhǔn)6%，不符合規(guī)定?？偦曳趾扛呖赡芘c僵蠶原藥材中添加了較多的石灰粉有關(guān)。

10批僵蠶樣品的紅外光譜圖在4 000～1 250 cm－1范圍內(nèi)共有峰6個(gè)，其中3 450～3 200 cm－1是N—H、O—H伸縮振動(dòng)峰，1 644 cm－1和1 533 cm－1是蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶C＝O的伸縮振動(dòng)峰和酰胺Ⅱ帶N—H的彎曲振動(dòng)和C—N的振動(dòng)峰，2 925 cm－1、2 855 cm－1和1 445 cm－1是CH3、CH2的吸收峰，結(jié)果與僵蠶的主成分是蛋白質(zhì)的結(jié)果相符[14]。10批藥材在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有2個(gè)最大吸收峰，其中210～220 nm是肽鍵的特征吸收，260～280 nm是色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸殘基的吸收峰。根據(jù)紅外光譜法和紫外光譜法結(jié)果，判斷僵蠶的主要化學(xué)成分是蛋白質(zhì)多肽類(lèi)物質(zhì)。

以上結(jié)果表明，市售僵蠶基本上是正品且為炮制品，其主成分為蛋白質(zhì)多肽類(lèi)物質(zhì)，含量在29.87%～57.19%之間，草酸銨的含量在0.27%～4.77%之間，質(zhì)量差異較大，這可能與藥材的炮制方法不同有關(guān)。僵蠶質(zhì)量主要存在兩個(gè)問(wèn)題：一是原藥材中摻入較多的石灰粉以增加質(zhì)量；二是有效組分蛋白質(zhì)多肽與草酸銨含量差異較大。草酸銨和蛋白質(zhì)含量反映藥理作用強(qiáng)弱，可作為評(píng)價(jià)其質(zhì)量的指標(biāo)之一。本文為僵蠶的定性鑒定和定量測(cè)定提供了依據(jù)，同時(shí)為主成分為蛋白質(zhì)多肽類(lèi)物質(zhì)的動(dòng)物藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了參考。

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Quality Evaluation of 10 Batches of Bombyx batrhticatus Medicinal Materials in the Market

ZHAO Jianguo1，QU Weihong1，YU Jinmou1，LYU Lu1，ZHANG Lei1，TAN Changli2（1.College of Pharmacy and Life Sciences，Jiujiang University，Jiangxi Jiujiang 332005，China；2.Grade 2008，Pharmacy Undergraduate，Jiujiang University，Jiangxi Jiujiang 332005，China）

OBJECTIVE：To evaluate the quality of Bombyx batryticatus medicinal materials in the market by multi-index，and provide reference for clinical rational drug use.METHODS：Referring to the Chinese Pharmacopoeia（2015 edition，part 1），the appearance characters of samples were observed，moisture and the total ash were detected，F(xiàn)ourier transform infrared spectroscopy was adopted to identify the medicinal materials，UV-Visible spectrophotometry and potassium permanganate titration were respectively used to determine the contents of active ingredient protein and ammonium oxalate.RESULTS：The moisture ranged in 2.84%-4.07%（RSD＜5%，n＝3），total ash in 7.79%-34.32%（RSD＜5%，n＝3），UV and FTIR spectra were basically similar，and both can reflect the characteristic peaks of protein peptides.Protein content ranged in 29.87%-57.19%（RSD＜0.5%，n＝3），ammonium oxalate content in 0.27%-4.77%（RSD＜5%，n＝3）.CONCLUSIONS：The 10 batches of samples are authentic and processed products，moisture fits the requirement in pharmacopoeia while total ash does not；and the main ingredient is protein peptides.However，effective protein polypeptide content shows great differences as well as ammonium oxalate.

Bombyx batryticatus；Fourier transform infrared spectroscopy；Protein；Ammonium oxalate

R931.74

A

1001-0408（2017）10-1399-04

2016-04-26

2016-09-29）

（編輯：劉明偉）

江西省衛(wèi)生計(jì)生委中醫(yī)藥科研課題（No.2014A119）；九江學(xué)院校級(jí)科研課題（No.KJ201008）

＊副教授，碩士。研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：zhaojg10000@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.28