喬麗菲，孫承韜，李煌，徐偉，褚克丹，闕金花，鄭健

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122

醒鼻微乳溫敏凝膠中丹皮酚在大鼠鼻黏膜的吸收研究

喬麗菲1，孫承韜1，李煌1，徐偉1，褚克丹1，闕金花1，鄭健2

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122

目的 通過對(duì)醒鼻微乳溫敏凝膠中丹皮酚的大鼠鼻黏膜吸收進(jìn)行研究，評(píng)價(jià)該藥的黏膜吸收情況和劑型選擇的合理性。方法通過大鼠鼻腔給藥試驗(yàn)，對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)丹皮酚的血藥濃度進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果大鼠鼻腔給予醒鼻微乳溫敏凝膠后，丹皮酚的生物利用度為78.68%，達(dá)到最大濃度（Cmax）0.340 4 μg/mL的時(shí)間為3 min，平均滯留時(shí)間為9.23 h；鼻腔給藥的血藥濃度達(dá)到Cmax后的變化情況與尾靜脈注射丹皮酚類似；丹皮酚的血藥濃度數(shù)據(jù)符合二室模型，權(quán)重為W＝1。結(jié)論醒鼻微乳溫敏凝膠經(jīng)鼻給藥生物利用度較高，劑型選擇合理。

醒鼻微乳溫敏凝膠；丹皮酚；鼻腔吸收

醒鼻方是福建省人民醫(yī)院名老中醫(yī)黃守林主任的鼻腔局部用藥經(jīng)驗(yàn)方，其主要組成為徐長卿、冰片等，具有疏風(fēng)清熱、開竅醒鼻等功效，臨床和藥理研究均表明其對(duì)變應(yīng)性鼻炎療效顯著[1-6]。方中君藥徐長卿具有祛風(fēng)化濕、止痛止癢等功效，丹皮酚是其主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗變態(tài)反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)和鎮(zhèn)痛等作用[7-8]。本課題組將醒鼻方制成溫敏凝膠劑[9-11]，制劑以液體形式滴入鼻腔后，在鼻腔溫度下膠凝成半固體，粘附在鼻黏膜上，滯留性、黏著性明顯增強(qiáng)，能夠有效防止藥物流失，延長藥物的作用時(shí)間，提高藥物的生物利用度，同時(shí)也增強(qiáng)了患者用藥的順應(yīng)性。在此基礎(chǔ)上，本研究采用大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)法研究醒鼻微乳溫敏凝膠中丹皮酚的吸收動(dòng)力學(xué)，旨在評(píng)價(jià)藥物的鼻黏膜吸收情況，為中藥新藥開發(fā)和微乳溫敏外用凝膠劑型的研發(fā)提供參考。

1 材料

LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司），湘儀H-2050R高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），QL-861渦旋振蕩器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司），XS105電子分析天平（METTLER TOLEDO）。

丹皮酚對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110708-200506），中藥醒鼻微乳溫敏凝膠（自制，批號(hào)20130712），丹皮酚注射液（自制，批號(hào)20130715），生理鹽水（福州海王福藥制藥有限公司），甲醇為色譜純，水為自制超純水，其余試劑均為分析純。

SD大鼠18只，雌雄各半，體質(zhì)量（250±10）g，6～8周齡，SPF級(jí)，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（hu）2007-0005，飼養(yǎng)環(huán)境室溫23～25 ℃，濕度50%～70%，光照12 h明暗交替，喂以SPF級(jí)大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料，水經(jīng)無菌過濾處理，正常攝水，分籠喂養(yǎng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 取丹皮酚對(duì)照品7 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得濃度為284.80 μg/mL的丹皮酚對(duì)照品貯備液；精密移取貯備液1 mL至20 mL量瓶，加甲醇稀釋至刻度，即得14.24 μg/mL的丹皮酚對(duì)照品溶液。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液 取肉桂酸對(duì)照品6 mg，精密稱定，置于20 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，即得濃度為312.00 μg/mL的肉桂酸內(nèi)標(biāo)貯備液；精密移取貯備液1 mL至20 mL量瓶，加甲醇稀釋至刻度，即得15.60 μg/mL的肉桂酸內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2 分析方法

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-SP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（60∶40）；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長：274 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；采集時(shí)間：15 min。

2.2.2 血漿樣品的處理 取血漿樣品100 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液2 μL，加入甲醇200 μL，渦旋混合30 s，14 000 r/min離心10 min，分離上清液，于-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 專屬性考察 取大鼠空白血漿100 μL加肉桂酸內(nèi)標(biāo)溶液和甲醇各2 μL、空白血漿100 μL加丹皮酚對(duì)照品溶液和肉桂酸內(nèi)標(biāo)溶液各 2 μL、含藥血漿100 μL加肉桂酸內(nèi)標(biāo)溶液和甲醇2 μL，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣。色譜圖見圖1。結(jié)果表明，丹皮酚峰與內(nèi)標(biāo)峰分離良好，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別取“2.1.1”項(xiàng)下濃度為284.80 μg/mL的丹皮酚對(duì)照品貯備液0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 mL至20 mL量瓶，甲醇稀釋至刻度，配制得濃度分別為1.42、2.85、7.12、14.24、28.48、71.20、142.40 μg/mL的系列丹皮酚對(duì)照品溶液；取100 μL空白血漿7份，分別加2 μL上述系列對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以丹皮酚濃度對(duì)丹皮酚和內(nèi)標(biāo)峰面積比值進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝2.786 7X＋ 0.026 4（r＝0.998 7）。結(jié)果表明，丹皮酚血藥濃度在0.028 5～2.850 0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積比值線性關(guān)系良好。

圖1 大鼠血漿中丹皮酚HPLC圖

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn)

2.2.5.1 提取回收率 取100 μL空白血漿6份，分別加入濃度為2.850 0 μg/mL（低濃度）、0.285 0 μg/mL（中濃度）、1.424 0 μg/mL（高濃度）的丹皮酚對(duì)照品溶液2 μL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，另取與配制對(duì)照品血漿相同的丹皮酚對(duì)照品溶液，用流動(dòng)相配制成相應(yīng)濃度的丹皮酚溶液，不經(jīng)處理直接進(jìn)樣[12]，將2組峰面積進(jìn)行比較，測(cè)得低、中、高濃度丹皮酚血漿的平均提取回收率分別為73.71%±7.58%（n＝6）、77.93%±6.77%（n＝6）、73.93%±6.63%（n＝6），RSD分別為2.86%、3.15%、2.95%。

2.2.5.2 方法回收率 另取100 μL空白血漿6份，分別加入2 μL低、中、高濃度丹皮酚對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，將丹皮酚和內(nèi)標(biāo)峰面積比值代入“2.2.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算丹皮酚濃度及回收率[12]，測(cè)得低、中、高濃度丹皮酚的方法回收率分別為85.92%±4.41%（n＝6）、87.70%±2.59%（n＝6）、86.62%±2.20%（n＝6），RSD分別為2.53%、2.37%、2.32%。

2.2.6 精密度試驗(yàn)

2.2.6.1 方法精密度試驗(yàn) 制備丹皮酚血藥濃度為0.285 0 μg/mL的樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算得丹皮酚峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值RSD＝1.18%，表明HPLC測(cè)定丹皮酚血藥濃度的精密度良好。

2.2.6.2 日內(nèi)精密度 分別取低、中、高濃度（0.057 0、0.285 0、1.424 0 μg/mL）的丹皮酚血漿樣品各5份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，于1 d內(nèi)，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得低、中、高質(zhì)量濃度樣品丹皮酚峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的 RSD分別為10.19 %、8.27 %、6.54 %。

2.2.6.3 日間精密度 連續(xù)3 d制備低、中、高濃度（0.057 0、0.285 0、1.424 0 μg/mL）的丹皮酚血漿樣品各5份，共 3批，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得3批低、中、高質(zhì)量濃度樣品丹皮酚峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的 RSD分別為13.23 %、9.34 %、6.87 %。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 平行制備丹皮酚血藥濃度為0.285 0 μg/mL的樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得丹皮酚峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD＝1.88%，表明重復(fù)性良好。

2.2.8 檢測(cè)限與定量限 通過 LC-20A高效液相色譜工作站，測(cè)得丹皮酚血漿樣品的檢測(cè)限（S/N＝3）為0.014 24 μg/mL。按“2.2.5.1”項(xiàng)下方法計(jì)算5份濃度為0.028 5 μg/mL的丹皮酚血漿樣品的提取回收率為 82.32%，RSD＝16.36 %。因此，確定定量限（S/N＞10）為0.028 5 μg/mL。

2.2.9 不同溫度的穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取低、中、高濃度（0.057 0、0.285 0、1.424 0 μg/mL）的丹皮酚血漿樣品各5份，置室溫1、2、4、6、24 h及1、2、4、7、14 d后取樣，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算6 h內(nèi)及6 d內(nèi)低、中、高質(zhì)量濃度的丹皮酚血漿樣品中丹皮酚峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的 RSD。同法考察丹皮酚血漿樣品在4 ℃、-20 ℃的穩(wěn)定性。結(jié)果見表 1。丹皮酚血漿樣品在室溫下放置，其含量變化較大；4 ℃放置14 d，含量略有變化；-20 ℃放置14 d，含量基本穩(wěn)定。所以樣品放置于-20 ℃保存，2周內(nèi)測(cè)定。

表1 不同溫度下丹皮酚血漿樣品的穩(wěn)定性RSD（%，n＝5）

2.3 醒鼻微乳溫敏凝膠的大鼠鼻腔吸收動(dòng)力學(xué)

2.3.1 丹皮酚注射液的配制 首先配制 88%氯化鈉注射液、10%乙醇和2 %吐溫-80的混合溶液，再用上述混合溶液配制濃度為2.6 mg/mL的丹皮酚溶液，過0.45 μm微孔濾膜，即得丹皮酚注射液。

2.3.2 大鼠鼻腔吸收實(shí)驗(yàn) 將18只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、丹皮酚注射液組、醒鼻微乳溫敏凝膠組，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h。動(dòng)物用15%烏拉坦（5 mL/kg）淺度麻醉后，空白組和醒鼻微乳溫敏凝膠組分別經(jīng)鼻腔給予生理鹽水和醒鼻微乳溫敏凝膠（50 mg×2，約47 μL×2，丹皮酚含量2.74%，凝膠給藥劑量0.4 g/kg），丹皮酚注射液組經(jīng)尾靜脈注射丹皮酚注射液 0.1 mL（丹皮酚給藥劑量1.04 mg/kg），給藥后0.017、0.05、0.08、0.17、0.33、0.5、1、2、4、8、12、24 h眼眶取血0.3～0.5 mL于含肝素的采血管中，12 000 r/min離心10 min，分離上清液，得血漿，取100 μL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，并按“2.2.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿樣品中丹皮酚的濃度，繪制血藥濃度-時(shí)間曲線（見圖 2）。用DAS1.0軟件處理血藥濃度數(shù)據(jù)，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表2。由結(jié)果可知，醒鼻微乳溫敏凝膠大鼠鼻腔給藥后，丹皮酚的生物利用度為 78.68%，達(dá)到最大濃度（Cmax）0.340 4 μg/mL的時(shí)間為3 min；平均滯留時(shí)間為9.23 h，大鼠尾靜脈注射丹皮酚的平均滯留時(shí)間為8.89 h；鼻腔給藥的血藥濃度在達(dá)到Cmax之后，變化情況與尾靜脈注射丹皮酚類似；丹皮酚的血藥濃度數(shù)據(jù)均符合二室模型，權(quán)重為W＝1。

圖2 大鼠給藥后丹皮酚的藥時(shí)曲線

表2 大鼠給藥后主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3 討論

本研究比較了甲醇和乙腈的除蛋白效果，發(fā)現(xiàn)甲醇處理后的血漿樣品丹皮酚峰高于乙腈處理后的血漿樣品丹皮酚峰，而且溶劑峰低于乙腈處理后的血漿樣品的溶劑峰，因此，本試驗(yàn)選用甲醇除蛋白。

測(cè)定血漿樣品中的成分時(shí)，本研究比較了有機(jī)試劑沉淀蛋白后直接離心與揮干有機(jī)試劑再定容2種方法處理生物樣品的丹皮酚回收率，發(fā)現(xiàn)加入2倍血漿量的甲醇能夠達(dá)到較高的回收率，原因可能為丹皮酚為易揮發(fā)成分，易在揮干有機(jī)試劑時(shí)損失。

醒鼻微乳溫敏凝膠常溫下為有一定黏度的可流動(dòng)液體，不易直接測(cè)量體積，因此，在醒鼻微乳溫敏凝膠的制備及大鼠鼻腔給藥時(shí)，均通過質(zhì)量來確定其取樣量。

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Study on Nasal Mucosa Absorption of Paeonol of Xingbi Microemulsion-based Thermo-sensitive Gel in Rats

QIAO Li-fei1, SUN Cheng-tao1, LI Huang1, XU Wei1, CHU Ke-dan1, QUE Jin-hua1, ZHENG Jian2(1. College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China; 2. Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China)

ObjectiveTo study the nasal mucosa absorption of paeonol of Xingbi microemulsion-based thermo-sensitive gel in rats; To evaluate the nasal mucosa absorption of medicine and the rationality of preparation form.MethodsAccording to the nasal administration method, the blood medicine concentration of paeonol was determined at different time points.ResultsThe nasal administration bioavailability of paeonol in Xingbi microemulsion-based thermo-sensitive gel was 78.68%, the plasma concentration reached the maximum (0.340 4 μg/mL) after 3 min of administration, and the average residence time was 9.23 h. After reaching Cmax, The plasma concentration changed similar to intravenous administration of paeonol. The concentration data of paeonol in plasma was consistent with a two-compartment model, with a weight of 1.ConclusionXingbi microemulsion-based thermosensitive gel has a higher bioavailability, and the preparation form was reasonable.

Xingbi microemulsion-based thermo-sensitive gel; paeonol; nasal absorption

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.022

R285.5

A

1005-5304(2017)04-0088-04

2016-10-13）

（

2016-10-28；編輯：陳靜）

福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013Y4004）

褚克丹，E-mail：chukd5917@163.com