何婷，李柯翱，季志紅，田樹革

1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆奇康哈博維藥股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830026；3.新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830011

HPLC同時(shí)測(cè)定紅花藥材中4種化學(xué)成分含量

何婷1，李柯翱2，季志紅2，田樹革3

1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆奇康哈博維藥股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830026；3.新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830011

目的 建立HPLC同時(shí)測(cè)定紅花藥材中羥基紅花黃色素A、蘆丁、槲皮素、山柰素4種化學(xué)成分含量的方法。方法采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），DAD檢測(cè)器，以0.5%磷酸溶液（A）-甲醇（B）進(jìn)行梯度洗脫，柱溫為30 ℃，流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。結(jié)果 羥基紅花黃色素A在0.077 6～0.776 0 μg（r＝0.999 9）、蘆丁在0.046 0～0.460 0 μg（r＝0.999 6）、槲皮素在0.006 4～0.064 0 μg（r＝0.999 9）、山柰素在0.012 8～0.128 0 μg（r＝0.999 7）范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。羥基紅花黃色素 A、蘆丁、槲皮素、山柰素的平均回收率分別為 99.68%、99.78%、102.03%、97.03%，RSD（n＝6）分別為2.29%、1.52%、1.02%、2.05%。結(jié)論該法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，靈敏度高，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，可用于紅花藥材的質(zhì)量控制。

紅花；羥基紅花黃色素A；蘆??；槲皮素；山柰素；高效液相色譜法

紅花為菊科紅花屬植物紅花Carthamus tinctorius L.的干燥花，始載于《開寶本草》，在我國(guó)已有多年栽培和藥用歷史，主要分布在新疆、河南、四川、云南、浙江等地[1]。紅花具有活血化瘀、散瘀止痛、降血壓和降血脂等功效[2]。《本草綱目》記載，紅花能“活血潤(rùn)燥，止痛散腫，通經(jīng)”。臨床和藥理研究發(fā)現(xiàn)，紅花對(duì)心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等均可發(fā)揮一定作用，同時(shí)具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗菌、抗氧化等多種生理活性[3-5]。

紅花的化學(xué)成分有黃酮、生物堿、聚炔、有機(jī)酸和多糖等，其中以黃酮類化合物（紅花黃色素）為主要有效成分[6-9]。2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》[10]僅對(duì)紅花中的羥基紅花黃色素 A和山柰素進(jìn)行了含量測(cè)定，未對(duì)其他成分進(jìn)行研究。為更好開發(fā)和合理利用紅花資源，本試驗(yàn)以新疆紅花為研究對(duì)象，采用HPLC同時(shí)測(cè)定紅花藥材中4種化學(xué)成分含量，為有效控制藥材質(zhì)量、提高紅花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1220 LC高效液相色譜儀、Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），美國(guó)Agilent公司；WondaSil C18 Superb色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），島津技邇（上海）商貿(mào)有限公司；Waters 2690-2487型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），北京迪馬科技有限公司；火星牌O型玻璃儀器氣流烘干器，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；KQ-5200DE型數(shù)控超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；FW-200高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津泰斯達(dá)公司；XS105型萬(wàn)分之一電子天平，德國(guó)梅特勒-托利多儀器有限公司；B-260型水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠。

羥基紅花黃色素A、蘆丁、山柰素對(duì)照品（批號(hào)分別為 111637-200905、100080-200707、110861-201310），中國(guó)食品藥品檢定研究院；槲皮素對(duì)照品（批號(hào)YA0806YB13），上海源葉生物科技有限公司；甲醇為色譜純，磷酸為優(yōu)級(jí)純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；水為超純水。紅花藥材（S1為2015年產(chǎn)于新疆吉木薩爾縣，S2為2015年產(chǎn)于新疆塔城縣，購(gòu)自新疆奇康哈博維藥股份有限公司；S3為2016年產(chǎn)于新疆霍城縣，購(gòu)自安徽濟(jì)順中藥飲片有限公司；S4為2016年產(chǎn)于新疆吉木薩爾縣，S5為2016年產(chǎn)于新疆塔城縣，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)新疆新特克拉瑪依藥業(yè)有限公司；S6為2016年8月采摘于和田墨玉縣），經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定教研室徐海燕副教授鑒定為菊科紅花屬植物紅花Carthamus tinctorius L.的干燥花。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.5%磷酸溶液（A）-甲醇（B）進(jìn)行梯度洗脫（0～10 min，40%～40%B；10～15 min，40%～45%B；15～20 min，45%～50%B；20～45 min，50%～50%B）；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：30 ℃。在該色譜條件下，理論塔板數(shù)按羥基紅花黃色素A峰計(jì)算不低于3000。色譜圖見圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取經(jīng)105 ℃干燥2 h后的羥基紅花黃色素A對(duì)照品、蘆丁對(duì)照品、槲皮素對(duì)照品、山柰素對(duì)照品適量，加甲醇制成含羥基紅花黃色素A 77.6 μg/mL、蘆丁46.0 μg/mL、槲皮素6.4 μg/mL、山柰素12.8 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

圖1 紅花中4種化學(xué)成分HPLC圖

2.3 供試品溶液的制備

取紅花藥材S1粉末（過(guò)3號(hào)篩）約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液30 mL，置平底燒瓶中，加鹽酸溶液（15→37）10 mL，搖勻，置水浴中加熱水解30 min，立即冷卻，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.5、3.5、4.0、5.0 mL置5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”色譜條件進(jìn)行分析。以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算羥基紅花黃色素A、蘆丁、槲皮素、山柰素的線性范圍，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。計(jì)算得羥基紅花黃色素A、蘆丁、槲皮素、山柰素峰面積的RSD依次為 0.57%、0.47%、0.68%、0.52%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取紅花藥材樣品（S1）1份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算得羥基紅花黃色素A、蘆丁、槲皮素、山柰素峰面積的RSD分別為2.45%、1.69%、1.75%、2.37%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取紅花藥材樣品（S1），按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算。羥基紅花黃色素A平均含量為5.68 mg，RSD＝1.07%；蘆丁平均含量為 1.96 mg，RSD＝0.90%；槲皮素平均含量各0.20 mg，RSD＝1.31%；山柰素平均含量為0.39 mg，RSD＝0.74%。結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 耐用性試驗(yàn)

將供試品溶液用不同的色譜柱（WondaSil C18 Superb色譜柱、Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱和Diamonsil C18色譜柱）及不同的儀器（Agilent 1220 LC和Waters 2690-2487型高效液相色譜儀）進(jìn)行測(cè)定，其他條件均保持一致。結(jié)果表明，不同色譜柱和儀器都能將紅花藥材中的4種化學(xué)成分依次分離。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

稱取6份已知含量的同一批紅花藥材S1粉末（過(guò)3號(hào)篩），每份約0.75 g，分別精密加入一定量的羥基紅花黃色素A、蘆丁、槲皮素、山柰素對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2～表5。

表2 紅花中羥基紅花黃色素A加樣回收率試驗(yàn)

表3 紅花中蘆丁加樣回收率試驗(yàn)

表4 紅花中槲皮素加樣回收率試驗(yàn)

表5 紅花中山柰素加樣回收率試驗(yàn)

2.10 樣品含量測(cè)定

取6批新疆不同產(chǎn)地的紅花藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定其峰面積，分別代入線性回歸方程，計(jì)算羥基紅花黃色素A、蘆丁、槲皮素、山柰素4種成分的含量，結(jié)果見表6。

表6 紅花樣品中4種成分含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

3 討論

在提取方法和溶劑選擇上，根據(jù)2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》[10]，本研究分別采用25%甲醇直接超聲提取及 100%甲醇回流提取，鹽酸酸化后再進(jìn)行回流提取，結(jié)果表明，在相同色譜條件下，后者色譜峰較多，分離度較好。因此，選擇 100%甲醇回流提取后鹽酸調(diào)節(jié)再進(jìn)行回流提取的方法。

在波長(zhǎng)的確定上，本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[11-12]，結(jié)合指標(biāo)成分的結(jié)構(gòu)特征，采用DAD檢測(cè)器，分別得到各特征峰的紫外光譜圖，對(duì)4種混合對(duì)照品和紅花樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)羥基紅花黃色素A、蘆丁、槲皮素、山柰素在360 nm處均有吸收，各峰峰形良好，綜合考慮確定檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。

紅花主要成分為黃酮類化合物，易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑。在流動(dòng)相的選擇上，參考相關(guān)文獻(xiàn)[11-12]，分別采用不同比例甲醇-0.5%磷酸、乙腈-0.5%磷酸和甲醇-乙腈-0.7%磷酸進(jìn)行等度和梯度洗脫。結(jié)果表明，以甲醇-0.5%磷酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，各化合物的保留時(shí)間幅度小且分離效果良好。故本研究選擇甲醇-水作為流動(dòng)相。

本試驗(yàn)采用HPLC-DAD同時(shí)對(duì)紅花藥材中羥基紅花黃色素A、蘆丁、槲皮素、山柰素4種化學(xué)成分的含量進(jìn)行測(cè)定，保留時(shí)間分別在5、13、27、39 min左右。該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重復(fù)性好，分離度＞1.5，實(shí)現(xiàn)了紅花藥材中不同類型成分的同時(shí)測(cè)定，為更好地控制紅花藥材質(zhì)量及進(jìn)一步研究提供了依據(jù)。

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Simultaneous Determination of Four Chemical Components in Carthamus tinctorius L. by HPLC

HE Ting1, LI Ke-ao2, JI Zhi-hong2, TIAN Shu-ge3(1. College of TCM, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China; 2. Xinjiang Ciconhabo Uygur Medicine Co. Ltd., Urumqi 830026, China; 3. Central Laboratory of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

ObjectiveTo establish an HPLC method for the simultaneous determination of hydroxysafflor yellow A, rutin, quercetin, and kaempferol in Carthamus tinctorius L..MethodsThe Agilent ZORBAX SB-C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) was used with diode array detection. The mobile phase was 0.5% phosphoric acid (A) and methanol (B) to separate the four components by gradient elution at 30 ℃; the flow rate was 0.8 mL/min; the injection volumn was 10 μL; the detection wavelength was at 360 nm.ResultsThe linear ranges of hydroxysafflor yellow A, rutin, quercetin, and kaempferol were 0.077 6–0.776 0 μg (r=0.999 9), 0.046 0–0.460 0 μg (r=0.999 6), 0.006 4–0.064 0 μg (r=0.999 9) and 0.012 8–0.128 0 μg (r=0.999 7), respectively. The average recoveries of four components were 99.68% with RSD=2.29% (n=6), 99.78% with RSD=1.52% (n=6), 102.03% with RSD=1.02% (n=6), 97.03% with RSD=2.05% (n=6), respectively.ConclusionThe method is convenient, accurate, sensitive, stable and repeatable, which can be a method for quality control of Carthamus tinctorius L..

Carthamus tinctorius L.; hydroxysafflor yellow A; rutin; quercetin; kaempferol; HPLC

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.020

R284.1

A

1005-5304(2017)04-0079-04

2016-07-25）

（

2016-08-27；編輯：陳靜）

烏魯木齊市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（Y141310023）

田樹革，E-mail：tsgyz@sina.com