翟紋靜，金尉，徐振東

（1.蘇州出入境檢驗檢疫綜合技術中心，江蘇蘇州 215100；2.蘇州世標檢測技術有限公司，江蘇蘇州 215100）

焦糖色素中4－甲基咪唑的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法的研究

翟紋靜1，2，金尉1，2，徐振東1

（1.蘇州出入境檢驗檢疫綜合技術中心，江蘇蘇州 215100；2.蘇州世標檢測技術有限公司，江蘇蘇州 215100）

建立測定焦糖色素中4－甲基咪唑的高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（LC－MS／MS）分析方法。水溶解樣品后，Waters Oasis MCX固相萃取柱為凈化柱，ACQUITY BEH HILIC色譜柱（2.1mm×100mm，1.7μm）為分析柱，5mmol／L甲酸銨溶液和0.1%甲酸乙腈為流動相，電噴霧正離子多反應監(jiān)測模式進行檢測，內(nèi)標法定量。試驗結果表明：5～100μg／L范圍內(nèi)，4－甲基咪唑的濃度和峰面積線性關系良好。確定該方法的定量限為10mg／kg，檢出限為3mg／kg。對未添加焦糖色的老抽中進行3個加標水平，4－甲基咪唑的回收率為99.7%～115.7%，變異系數(shù)均不超過3%。該方法的線性相關性良好，定量限和檢出限低，精密度和準確度均符合要求，能夠滿足焦糖色素中4－甲基咪唑的檢測要求。

高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜；4－甲基咪唑；固相萃取；焦糖色素

1 概述

焦糖色是食品及飲料中長期廣泛使用的著色劑之一。在加熱條件下，還原糖、氨基酸或蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應和焦糖化反應等系列化學反應，這些反應除產(chǎn)生焦糖色外，還可以產(chǎn)生小分子的雜環(huán)化合物，如4－甲基咪唑（4－methylimidazole）等［1，2］。4－甲基咪唑為神經(jīng)毒素，具有強烈的致驚厥作用，并且已有研究證明其具有致癌的風險［3］。我國國家標準規(guī)定亞硫酸銨法、氨法生產(chǎn)的食品添加劑焦糖色中4－甲基咪唑應不得大于0.02%［4］。依據(jù)美國食品用化學品法典，焦糖色素中4－甲基咪唑指標不得超過0.025%［5］。歐盟食品安全委員會規(guī)定亞硫酸銨法生產(chǎn)的焦糖色素中4－甲基咪唑每日最大攝取量不超過200mg／（kg·天）。

目前4－甲基咪唑的檢測方法包括紫外分光光度法、氣相色譜法［6，7］、液相色譜法［8，9］、液質(zhì)聯(lián)用法［10］等。其中液質(zhì)聯(lián)用法的前處理簡單，不用離子對試劑作流動相，無需衍生化，并且儀器靈敏度高，重現(xiàn)性和準確度好。本研究采用MCX固相萃取柱對樣品進行凈化，液質(zhì)聯(lián)用儀進行測定，建立了4－甲基咪唑的檢測方法。

2 實驗部分

2.1 儀器設備與試劑

Agilent 6460液質(zhì)聯(lián)用儀，ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱（2.1mm×100mm，1.7μm），氮吹儀（Organomation N－EVAP），渦旋混合器（IKA），電子天平（METTLER AE100），高速離心機（湖南湘儀H2050R），Waters Oasis MCX固相萃取柱（3cc／60mg，使用之前依次用甲醇3mL和水3mL活化）；4－甲基咪唑標準品（Dr.Ehrenstorfer，純度99.4%），D6－4－甲基咪唑（CDN ISOTOPES，純度98.0%），Milli－Q超純水器（Milli－Q，美國），乙腈（Fisher，色譜純），甲醇（Fisher，色譜純）。

2.2 儀器條件

2.2.1 色譜條件

流動相：5mmol／L甲酸銨水溶液∶0.1%甲酸乙腈為15∶85（V／V）；色譜柱：ACQUITY UPLC BEH HILIC（2.1mm×100mm，1.7μm）；流速為0.2mL／min；進樣量為20.0μL；柱溫為25℃。

2.2.2 質(zhì)譜條件

電離源模式：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；電離源極性：正模式（ESI＋）；檢測方式：多反應監(jiān)測（multi－reactions monitoring，MRM）；電噴霧電壓：3500V；鞘氣溫度：250℃；鞘氣流速：11L／min；干燥氣流速11L／min；干燥氣溫度：350℃；其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 4－甲基咪唑的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Mass spectrometry analysis parameters for 4－Mel

2.3 溶液的配制

4－甲基咪唑標準儲備溶液（1.0mg／mL）：準確稱取10mg 4－甲基咪唑，用甲醇溶解后定容至10mL，置于－18℃冰箱冷藏保存。4－甲基咪唑標準稀釋溶液（1.0mg／L）：準確吸取100μL 4－甲基咪唑標準儲備溶液，用甲醇定容至100mL，置于4℃冰箱冷藏保存。

D6－4－甲基咪唑標準儲備溶液（1.0mg／mL）：準確稱取10mg D6－4－甲基咪唑，用甲醇溶解后定容至10mL，置于－18℃冰箱冷藏保存。D6－4－甲基咪唑標準稀釋溶液（10.0mg／L）：準確吸取100μL D6－4－甲基咪唑標準儲備溶液，用甲醇定容至10mL，置于4℃冰箱冷藏保存。

4－甲基咪唑系列標準溶液：分別準確移取4－甲基咪唑標準稀釋溶液5.0，10.0，25.0，50.0，100.0μL和D6－4－甲基咪唑標準稀釋溶液20.0μL于上樣瓶中，用水定容至1.0mL，得到濃度分別為5，10，25，50，100μg／L的標準溶液，置于冰箱冷藏備用。

2.4 前處理方法

稱取焦糖色素樣品1.00g，置于100mL容量瓶中，加水定容至刻度。取0.1mL上述樣品溶液，加入1.6mL水，0.1mL鹽酸溶液（0.02mol／L）和0.2mL內(nèi)標使用液（1.0μg／mL），混勻后待固相萃取凈化。將制備好的樣品溶液加入剛活化好的小柱中，控制流速小于0.5mL／min，抽干，1mL水和1mL甲醇分別淋洗，控制流速小于1.0mL／min，抽干，加3mL洗脫液，控制流速小于0.5mL／min，收集液在低于45℃條件下，氮氣吹干，殘渣用1mL流動相定容，渦旋混合2min，過0.22μm水系微孔濾膜，濾液供LC－MS／MS測定。

3 結果與討論

3.1 前處理條件的優(yōu)化

由于目標化合物極性較強，對于前處理的要求非常高，分離提取是個難點，本實驗考察了Waters OASIS HLB和Waters OASIS MCX對樣品的凈化效果和回收率。結果表明：在Waters OASIS HLB柱上目標化合物基本上沒有保留，而在Waters OASIS MCX柱上，凈化效果良好，并且目標物的氘代物內(nèi)標的加入，使得4－甲基咪唑的回收率穩(wěn)定在98%～120%以內(nèi)。這是由于4－甲基咪唑呈弱堿性，故采用強陽離子交換固相萃取柱進行選擇性吸附，能夠更好地對目標化合物進行凈化和富集。因此，選擇Waters OASIS MCX柱為凈化柱，5%氨水－甲醇溶液作為洗脫溶液。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

4－甲基咪唑是強極性的小分子物質(zhì)，理論上與固定相C18之間的相互作用力較差，一般反相很難保留，故實驗中對比了Waters Symmetry C18（2.1mm×100mm，3μm），Themo Hypersil GOLD HILIC（2.1mm×100mm，1.7μm）和ACQUITY BEH HILIC（2.1mm×100mm，1.7μm）不同色譜柱的分離情況。4－甲基咪唑在3根色譜柱的分離效果見圖1，Hypersil GOLD HILIC色譜柱和Symmetry C18色譜柱的峰形均出現(xiàn)不同程度的拖尾現(xiàn)象，而ACQUITY BEH HILIC色譜柱分離得到的目標化合物峰形良好且其分離度和靈敏度有所提高，故本實驗采用ACQUITY BEH HILIC色譜柱進行分離檢測。

采用甲醇和乙腈分別作為流動相中的有機相，試驗結果表明：在液質(zhì)聯(lián)用儀中，當乙腈為有機相時，化合物的響應更高且噪音更低，因此選擇乙腈作為有機相。同時在有機相中加入0.1%甲酸，是因為ESI＋模式下，在流動相中加入可以提供H＋的甲酸或乙酸等，以提高目標化合物的離子化效率［11］。此外，實驗中對比了純水和5mmol／L甲酸銨溶液兩種無機流動相的差別，結果發(fā)現(xiàn)乙腈－5mmol／L甲酸銨溶液流動相體系中4－甲基咪唑不僅達到完全分離而且峰形良好，且保留時間合理。

圖1 4－Mel在不同色譜柱上的保留色譜圖（從上到下依次為ACQUITY BEH HILIC，Hypersil GOLD HILIC和Symmetry C18）Fig.1 Chromatograms of 4－Mel on different columns（from top to bottom is ACQUITY BEH HILIC，Hypersil GOLD HILIC，and Symmetry C18）

3.3 線性相關性和定量限

4－甲基咪唑標準溶液按2.2中的儀器條件進行進樣分析，濃度－峰面積的線性回歸方程為y＝0.245404x＋0.853571，相關系數(shù)r＝0.9999，說明在5～100μg／L范圍內(nèi)4－甲基咪唑的濃度和峰面積線性關系良好。

按照方法前處理步驟并結合儀器信噪比應至少等于10進行加標試驗，確定本方法的定量限為10mg／kg；儀器信噪比應至少等于3，確定方法檢出限為3mg／kg。

3.4 準確度及精密度

對4－甲基咪唑加標濃度分別為3，6，30mg／kg的陰性醬油樣品進行加標回收率試驗（見表2），每個濃度重復測定6次。

表2 醬油中4－甲基咪唑加標回收率及精密度Table 2 Recovery rate and precision of 4－Mel in soy sauce（n＝6）

由表2可知，方法的回收率在99.7%～115.7%，變異系數(shù)均不超過3%，說明方法的準確度和精密度較高。

3.5 實際樣品分析

按照2.4中的前處理方法，對添加焦糖色的醬油樣品進行處理，考察試驗結果，各樣品中4－甲基咪唑的出峰位置附近并沒有雜質(zhì)峰干擾且峰形良好，因此能夠進行定性及定量。以本方法對市場上不同的樣品進行測定，結果發(fā)現(xiàn)添加焦糖色的醬油中4－甲基咪唑均被檢出，而食品配料表中沒有添加焦糖色的醬油均未檢出4－甲基咪唑。

4 結論

采用固相萃取前處理并添加目標物氘代內(nèi)標，通過液質(zhì)聯(lián)用儀檢測4－甲基咪唑含量。該方法操作步驟簡單，有效去除樣品基質(zhì)效應和雜質(zhì)干擾，且分析效率高。驗證結果表明：該方法的線性相關性良好，定量限和檢出限低，精密度和準確度均符合要求，能夠滿足焦糖色素中4－甲基咪唑的檢測要求。

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Research on Detection of 4－Methylimidazole in Caramel Pigment by Ultra Performance Liquid Chromatography－Tandem Mass Spectrometry

ZHAI Wen－jing1，2，JIN Wei1，2，XU Zhen－dong1
（1.Suzhou Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Suzhou 215100，China；2.Suzhou World Standard Testing Technology Co.，Ltd.，Suzhou 215100，China）

A high performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry（LC－MS／MS）method is developed for the detection of 4－methylimidazole in caramel pigment.Samples are diluted with water，Waters Oasis MCX solid－phase extraction column is used to purify and concentrate the target analytes and the analytes are separated by a ACQUITY BEH HILIC column（2.1mm×100mm，1.7μm）using a mobile phase consisting of 5mmol／L ammonium acetate aqueous solution and acetonitrile with 0.1%formic acid.The analytes are detected with multiple－reaction monitoring mode via positive electrospray ionization.The results show that the calibration curves of 4－Mel are of good linearity in the range of 5～100μg／L.The limit of quantification of the method is 10mg／kg and the limit of detection is 3mg／kg.The recovery is 99.7%～115.7%at three spiked levels for 4－Mel and the co－efficient of variation（CV）is less than 3%.The developed method is characterized by the excellent purification effect，sensitivity and accuracy，and it can be used for the detection of 4－Mel in caramel pigment samples.

high performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry（LC－MS／MS）；4－methylimidazole；solid－phase extraction（SPE）；caramel pigment

TS202.3

A

10.3969／j.issn.1000－9973.2017.04.032

1000－9973（2017）04－0141－04

2016－10－16

翟紋靜（1987－），女，工程師，碩士，主要從事食品檢驗工作。