劉銀杏

摘 要：本課題主要基于野菊花和橙皮具有作為天然植物源防腐劑的潛能，且防腐效果較好、原料來源廣泛、易提取，現(xiàn)階段對于野菊花和橙皮的研究還處于初級階段，具有較高的開發(fā)價值，因而采用濾紙片法和瓊脂擴散法分別測定野菊花和橙皮對于常見菌種的最低抑菌濃度（MIC），以及兩者聯(lián)合使用時的最低抑菌濃度，同時由于環(huán)狀糊精分子具有去除異味和提高藥效的作用，故而用其對于兩種提取物進行包被，并測定其最低抑菌濃度。初步探明提取液的最佳制備方法以及為尋找更為有效的天然防腐劑提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：野菊花；橙皮；提取物；最低抑菌濃度；環(huán)狀糊精

引言

目前人類對于防腐劑的應(yīng)用非常廣泛，比如食品工業(yè)、化妝品行業(yè)，以及藥物行業(yè)[1]等。常用的防腐劑主要是化學(xué)合成的，如苯甲酸鹽，但可能會引起食物中毒，甚至產(chǎn)生致癌性、致畸性等嚴重的危及人類生命安全的問題[2]。而天然防腐劑具有抗菌性強[3]、安全無毒、水溶性好、熱穩(wěn)定性好、作用范圍廣等合成防腐劑無法比擬的優(yōu)點，因此開發(fā)高效、安全、穩(wěn)定的天然防腐劑已成為食品科學(xué)研究的熱點之一，天然防腐劑[4]不但對人體健康無害，而且還具有一定的營養(yǎng)價值，隨著研究的深入，被揭示的天然抗菌物質(zhì)越來越多。

國內(nèi)外對植物源天然防腐劑的研究異?；钴S，究其原因是自然界的天然植物中存在許多具有抗菌作用[5]的生理活性物質(zhì)。近年來，我國眾多學(xué)者進行了植物源天然食品防腐劑[6]的研究。他們研究了大蒜、生姜、丁香等50多種香辛科植物及大黃、甘草、銀杏葉等200多種中草藥[7]及其它植物如竹葉等提取物的抗菌試驗，發(fā)現(xiàn)有150多種具有廣譜的抑菌活性，各提取物之間也存在抗菌性的協(xié)同增效作用[8]，并作為天然防腐劑應(yīng)用在某些食品中。

野菊花為菊科植物野菊（Chrysanthemum indicum L）的干燥頭狀花序，又稱瘧疾草、苦薏、山菊花等[9]。具有清熱解毒、疏風(fēng)平肝之功效，在我國民間藥用歷史悠久，中國藥典也早有收載[10]。野菊花廣泛分布于我國東北、華北、西北、華東、西南等地，野生資源比較豐富，多生于石質(zhì)山坡、草地、田邊、路旁等處[11]，本實驗用的野菊花產(chǎn)自湖南?，F(xiàn)代藥理證明：野菊花具有廣譜抗菌、抗病毒、降壓、增加冠脈血流量、清除氧自由基等作用[12]。野菊花生物活性多樣、清香宜人、安全可靠，同時藥源廣泛、價格低廉，在藥品、食品、保健品、化妝品等多領(lǐng)域具有開發(fā)價值。野菊花在抗病原微生物、抗感染中也有很大作用[13]。對野菊花煎液與揮發(fā)油的抑菌和抗病毒活性實驗研究結(jié)果表明，二者均具抑菌和抗病毒活性，且野菊花煎液的抑菌和抗病毒活性均強于揮發(fā)油[14]。野菊花煎液中含黃酮類化合物、甘油酯、棕櫚酸、多糖、β-胡蘿卜素和綠原酸等物質(zhì)，抗菌譜較廣，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白喉桿菌、傷寒桿菌、變形桿菌、痢疾桿菌、銅綠孢假單孢菌、福氏志賀菌有較強的抑制作用[15]。

桔皮抑菌防腐的主要有效成分是醇溶性色素以及橙皮苷[16]，橙（Hesperidin）異名陳皮苷、橘皮苷，微溶于乙醇，橙皮苷分子結(jié)構(gòu)中含有多個羥基，有酸性，有親水性，屬黃酮物質(zhì)的黃烷酮[17]。早期作為維生素P，近年來發(fā)現(xiàn)其具有降血壓，抗過敏，降低骨密度、膽固醇，改變體內(nèi)酶活性，改善微循環(huán)，抗菌、抗炎、抗肝炎、抗腫瘤等藥理作用[18]。橙皮苷在質(zhì)量百分比為0.06%-0.9%、pH值為5-9時對食品污染有廣譜抗菌作用[19]，經(jīng)熱處理后的橙皮苷仍有抑菌作用[20]。

環(huán)糊精（CD）系淀粉經(jīng)酶解環(huán)合后得到的由6個以上葡萄糖分子連結(jié)而成的環(huán)狀低聚化合物[21]，因具有環(huán)狀中空圓筒狀結(jié)構(gòu)而呈現(xiàn)一系列特殊性質(zhì)，沒有還原端和非還原端，不易受外切α-淀粉酶的作用，但能為內(nèi)切型淀粉酶作用[22]。這種結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定，不易受酸堿、熱等條件的作用而分解，其熔點達300-350℃。CD“內(nèi)疏水、外親水”的簡狀剛性結(jié)構(gòu)賦予了其獨特的包合性能[23]。CD可以認為是具有一定分子大小的空囊，它可以包埋多種分子于其空穴中，CD分子通過范德華力、疏水相互作用完全或部分將被包埋分子包裹于其中，是藥物制劑、食品工業(yè)、化妝品工業(yè)等方面應(yīng)用較廣的新型包合材料，能包合許多有機化合物和稀有氣體、鹵素等無機化合物，被其包合后的物質(zhì)穩(wěn)定性、揮發(fā)性、溶解性等各種理化性質(zhì)發(fā)生了顯著變化，且環(huán)糊精本身基本無毒、無刺激性[24]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

儀器：電熱恒溫培養(yǎng)箱、離心機、超凈工作臺、滅菌鍋、分析天平、電熱鼓風(fēng)干燥箱、搖床、冰箱

器材： 培養(yǎng)皿、移液管、試管、三角燒瓶、容量瓶、濾紙、紗布（用來過濾）

菌種：大腸桿菌（Escherichia coli）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）

1.2 提取物的制備及材料的準備

1.2.1 野菊花提取物的制備

（1）水煮法：稱取100g野菊花，加10倍量蒸餾水小火煮沸2次，每次1h，合并2次水煎液，濃縮至100ml，最終得濃縮液的質(zhì)量濃度為1g/ml，調(diào)整pH值至7.0～7.2，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）醇提法：稱取一定量野菊花，適當粉碎，加5倍量對5O%乙醇浸泡24h，60℃水浴3h，過濾后殘渣再加5倍量對50%乙醇熱浸3h，合并醇浸液，回收乙醇，最終得濃縮液的質(zhì)量濃度為1g/ml，調(diào)整pH值至7.0～7.2，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 橙皮提取物的制備

橙皮的干燥：摘取新鮮柑桔果皮，用蒸餾水洗凈后放入鼓風(fēng)干燥箱在60℃恒溫干燥12 h。將干燥后的柑桔果皮用高速組織搗碎機破碎，備用。

橙皮苷的提?。?/p>

（1）水煮法：稱取100g橙皮，加10倍量蒸餾水小火煮沸2次，每次1h，合并2次水煎液，濃縮至100ml，最終得濃縮液的質(zhì)量濃度為1g/ml，調(diào)整pH值至7.0～7.2，冰箱保存?zhèn)溆谩?

（2） 醇提法：稱取50g干燥橙皮，加500ml85%乙醇， 80℃水浴8h，過濾取濾液，加鹽酸調(diào)PH至4.0，低溫過夜，11000rpm 10min，棄上清，抽真空（過夜），得到粉末。

1.2.3 培養(yǎng)基的制備

固體培養(yǎng)基（1000ml）：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂20g、水1000ml

液體培養(yǎng)基（50ml）：牛肉膏0.15g、蛋白胨0.5g、氯化鈉0.25g、水50ml

1.2.4 材料的滅菌：將實驗所需的培養(yǎng)皿、移液管、鑷子、玻璃刮棒等用牛皮紙包好；將實驗所需培養(yǎng)基以及裝好蒸餾水的錐形瓶等也用牛皮紙包好；將濾紙用打孔器制成直徑6mm的圓紙片，分裝于潔凈干燥的小培養(yǎng)皿內(nèi)，以上所有實驗材料放在高壓蒸汽滅菌鍋中，濕熱滅菌（121℃，20min），備用。

1.2.5 菌種的活化：將所有供試的菌種移接入相應(yīng)的試管斜面培養(yǎng)基上，每種菌接支重復(fù)。細菌置37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。每種菌株取2支供測試用，其余注明日期，置4℃冰箱冷藏備用。

1.2.6 供試菌株懸浮液制備：把預(yù)先進行菌種斜面活化的各菌種分別挑取2環(huán)制成菌懸液，然后對每種菌取2支盛有10ml無菌水的試管排在試管架上，稀釋菌液濃度，使其含菌體為107-108個/ml，即得供試菌種，將各種菌的菌懸液貼好標簽，備用。

1.3 抑菌實驗方案

（1）二倍稀釋法。最小抑菌濃度（MIC）的測定用二倍稀釋法將提取液分別稀釋成100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%等濃度梯度。

（2）濾紙片法。待培養(yǎng)基冷卻到適當溫度，將擴大培養(yǎng)好的菌液按5ml/100ml培養(yǎng)基接種，混勻后每一平皿倒入約15ml。待培養(yǎng)基凝固后，用無菌鑷子夾取浸泡于野菊花提取物的濾紙片，濾去多余的汁液，以無菌操作將濾紙片對號放在培養(yǎng)基表面，每皿3片，每片相隔一定距離，以防止其相互影響。將放好濾紙片的含菌培養(yǎng)皿分別在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h后，測定抑菌圈大小。

（3）瓊脂擴散法。在直徑為9cm的培養(yǎng)皿中倒入10ml左右的無菌培養(yǎng)基，待凝固后在上面安放牛津杯（規(guī)格：外徑：8mm；內(nèi)徑6mm；高10mm），每平皿三個，再倒入含菌的培養(yǎng)基15ml，待其凝固后拔出牛津杯，每孔加入150μl稀釋液，每個濃度設(shè)置三個平行對照，37℃恒溫培養(yǎng)24h，然后測定其抑菌圈的大小。

1.4 CD分子包被方法

取100ml水加溫到60℃，加入1.8gCD分子溶解后，攪拌下加入20ml野菊花提取液，用磁力攪拌器連續(xù)攪拌2h，加熱煮沸，并稀釋至100ml，則包被液原始濃度為0.2g/ml。瓊脂擴散法測定抑菌圈直徑大小。

實驗結(jié)果：

用濾紙片法測定野菊花、橙皮水提物及其混合物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用，結(jié)果見表1（質(zhì)量濃度：1g/ml；濾紙片直徑6mm）。

由表1可知野菊花和橙皮的提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌作用，且兩者聯(lián)合使用比單獨使用抑菌效果有所提高。

濾紙片法測定橙皮醇提物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用，結(jié)果如表2（濾紙片直徑6mm）。

由圖1可知：橙皮提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有抑菌作用，并且在一定范圍內(nèi)隨著濃度的提高其抑菌效果逐漸提高。

瓊脂擴散法測定野菊花醇提物對大腸桿菌抑菌作用（牛津杯的規(guī)格：外徑8mm；內(nèi)徑6mm；高10mm），結(jié)果見表3。

由圖2可知：CD分子包被野菊花提取物后的抑菌效果有所提高，同時經(jīng)過CD包被后的野菊花對大腸桿菌最低抑菌濃度為0.26mg/ml，比野菊花提取液對大腸桿菌的最低抑菌濃度（1.06mg/ml）低，且相同濃度下經(jīng)過CD包被后的提取液的抑菌作用比包被前增加了15%。

瓊脂擴散法測定野菊花醇提物對金黃色葡萄球菌的抑菌作用（牛津杯的規(guī)格：外徑8mm；內(nèi)徑6mm；高10mm），結(jié)果見表4。

由圖3可知：CD分子包被野菊花提取物后的抑菌效果有所提高，同時經(jīng)過CD包被后的野菊花對金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度為0.26mg/ml，比野菊花提取液對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（0.52mg/ml）低，且相同濃度下經(jīng)過CD包被后的提取液的抑菌作用比包被前增加了15%。

實驗結(jié)論：

（1）野菊花和橙皮的提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌作用，在一定范圍內(nèi)隨著濃度的提高其抑菌效果逐漸提高。

（2）野菊花醇提物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為1.06mg/ml、 0.52mg/ml。

（3）橙皮醇提物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度均為0.05%。

（4）經(jīng)過CD包被后的野菊花對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度均為0.26mg/ml。CD分子包被后兩種提取物的抑菌作用均有所提高，相同濃度下經(jīng)過CD包被后的野菊花醇提物的抑菌作用比包被前增加了15%，并且野菊花的氣味也有所減少，達到了去味的效果。

（5）兩種提取物聯(lián)合使用比單獨使用的抑菌作用較強。

（6）探討出了兩種提取野菊花和橙皮的方法，以及CD分子包被野菊花提取物的方法，并在比較中得到了較為優(yōu)化的實驗方案。

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