謝 偉 張柱霞賈小娥 姜樹原 石 蕊 劉曉蕾 許文強(qiáng) 張顏波 邵 國，4＊

(1.包頭醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究中心，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物與遺傳學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 包頭 014060； 3. 泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 泰安 271000；4. 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 北京 100053)

DNMT1、DNMT3A和蛋白磷酸酶1γmRNA在低氧預(yù)適應(yīng)晚期相小鼠海馬組織變化

#并列第一作者；＊通訊作者

謝 偉1#張柱霞1#賈小娥1姜樹原1石 蕊1劉曉蕾1許文強(qiáng)1張顏波3，4＊邵 國1，4＊

(1.包頭醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究中心，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物與遺傳學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 包頭 014060； 3. 泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 泰安 271000；4. 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 北京 100053)

目的 研究小鼠低氧預(yù)適應(yīng)模型中DNA甲基化和PP1γ基因表達(dá)伴隨低氧后時間的變化機(jī)制，闡明低氧是否通過DNA甲基化來調(diào)控PP1γ表達(dá)，發(fā)揮其腦保護(hù)作用。方法 小鼠側(cè)腦室注射5-aza-cdR (10 μM, 5 μl)，之后進(jìn)行低氧處理，分別于低氧后0、1、2、3、4天處死小鼠，利用實時熒光定量PCR檢測甲基轉(zhuǎn)移酶DNMTs和PP1γ mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果 低氧后1天DNMT1和低氧后2天DNMT3A的mRNA表達(dá)受到抑制(P<0.05)，且不受甲基轉(zhuǎn)移酶活性的影響。5-aza-cdR對DNMT1的表達(dá)沒有影響(P>0.05)；但明顯抑制DNMT3A的表達(dá)(P<0.05)。低氧抑制PP1γ mRNA表達(dá)(P<0.05)，且有低氧后時間依賴性。甲基轉(zhuǎn)移酶對PP1γ表達(dá)有抑制作用(P<0.05)，且與低氧后時間有關(guān)。結(jié)論 隨著低氧后時間的延長，低氧通過改變DNA甲基化，尤其是DNMTs表達(dá)變化，調(diào)控PP1γ基因表達(dá)，實現(xiàn)其腦保護(hù)作用。

蛋白磷酸酶1；DNA甲基化；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶；低氧預(yù)適應(yīng)；小鼠

缺血/低氧預(yù)適應(yīng)(ischemia/hypoxia preconditioning, I/HPC)是指機(jī)體受到一次或多次短暫、非致死性缺血/低氧刺激后，對更嚴(yán)重甚至致死性缺血/低氧刺激產(chǎn)生耐受的現(xiàn)象[1]，其通過啟動內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，使大腦對缺血/低氧產(chǎn)生保護(hù)作用[2-3]。然而確切分子機(jī)制尚無定論。

DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase, DNMT)的催化下，將甲基轉(zhuǎn)移至DNA分子的堿基上，通過CpG島的甲基化控制靶基因特異性表達(dá)。研究顯示缺血/低氧可降低甲基化水平[4]，因此推測I/HPC可能通過改變DNA甲基化進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)來產(chǎn)生腦保護(hù)作用。

蛋白磷酸酶1(protein phosphatase 1, PP1)是參與腦保護(hù)的重要因子，是一類去磷酸化酶，通過控制去磷酸化和磷酸化過程，調(diào)控腦的能量代謝。同時PP1在突觸可塑性的形成中發(fā)揮重要作用，參與學(xué)習(xí)記憶的形成[5]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，急性低氧可引起PP1γ表達(dá)變化[6]，但其在低氧后不同時間的變化情況及甲基化改變是否參與其中，仍需深入研究。

因此，本文首先明確DNA甲基化和PP1γ表達(dá)伴隨低氧后時間的變化機(jī)制，并利用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮-2'脫氧胞苷(5-aza-2'deoxycytidine, 5-aza-cdR)，鑒定低氧條件下是否通過DNMTs途徑調(diào)控PP1γ表達(dá)變化來實現(xiàn)其腦保護(hù)作用，為進(jìn)一步揭示I/HPC腦保護(hù)作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 體重為18～22 g雄性昆明小鼠(6～8周)60只，購于內(nèi)蒙古大學(xué)動物實驗中心。

1.1.2 試劑 5-aza-cdR和BSA購自Sigma公司；TRIzol購自Takara公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒superscript III購自Invitrogen公司；2×Real-time PCR Mix 購自Takara公司；引物合成由上海生工公司完成；其余試劑為國產(chǎn)試劑。

1.2方法

1.2.1 小鼠大腦立體定位注射5-aza-cdR 小鼠使用1%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，麻醉后固定于大腦立體定位儀上，去除頭頂鼠毛，消毒皮膚，在頭頂部正中切口，暴露前囟，根據(jù)小鼠腦圖譜，于前囟后0.5mm，中線右側(cè)1 mm，垂直深度2.5 mm，向?qū)嶒灲M小鼠右側(cè)腦室緩慢注入5-aza-cdR (10 μmol/L) 5μl，每次注射時間為5 min，留針2 min。注射完成并消毒后，縫合傷口。對照組注射等體積的1%牛血清白蛋白(bovine albumin, BSA)。

1.2.2 小鼠低氧處理 手術(shù)完成后休息2 d，實驗組和對照組小鼠分別進(jìn)行低氧處理：小鼠放置在250 ml的廣口瓶中，塞緊橡膠塞，實時觀察小鼠的呼吸狀態(tài)。待小鼠出現(xiàn)腹式呼吸后，拔下膠塞，取出小鼠，此為小鼠低氧1次。取出小鼠后，待小鼠呼吸恢復(fù)，再次迅速對其低氧，共重復(fù)4次，此為小鼠低氧預(yù)適應(yīng)，即低氧4次。低氧和低氧預(yù)適應(yīng)完成后即刻處死小鼠為小鼠0天低氧組(0.1組，0.4組)，低氧后1天處死為1天低氧組(1.1組，1.4組)，低氧后2天處死為2天低氧組(2.1組，2.4組)，低氧后3天處死為3天低氧組(3.1組，3.4組)，低氧后4天處死為4天低氧組(4.1組，4.4組)，未低氧直接處死為未低氧組(0.0組)，分組如表1、2所示。各組小鼠處死后，立即剝離小鼠左右海馬和皮層，準(zhǔn)備提取mRNA樣本。

表1 大腦立體定位注射5-aza-cdR小鼠分組表

表2 大腦立體定位注射BSA小鼠分組表

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測DNMT1、DNMT3A和PP1γ在mRNA水平的表達(dá)變化 TRIzol法提取各組組織總RNA后，使用Nondrop 2000微量分光光度計檢測總RNA的純度和含量。使用1 μg的RNA樣本用于逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，利用熒光定量PCR檢測DNMT1、DNMT3A和PP1γ在mRNA水平的表達(dá)變化。使用ABI公司的96孔板，反應(yīng)體系為：cDNA 1 μl，引物1 μl，無菌水8 μl，Mix 10 μl，在ABI7900HT Real-time PCR反應(yīng)儀上反應(yīng)，每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔。PCR反應(yīng)條件為： 95 ℃預(yù)變性3 min；循環(huán)為95 ℃變性3 min，59 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)，72 ℃終末延伸5 min。使用β-actin為內(nèi)參，以mRNA/β-actin mRNA的相對豐度值表示實驗結(jié)果，特異性引物序列如下：

作為一種新型經(jīng)濟(jì)模式和商業(yè)模式，物流業(yè)發(fā)展共享經(jīng)濟(jì)中難免會遇到質(zhì)疑和困難，有些問題會引起政府或者有關(guān)部門的干涉和禁止。在共享經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展與應(yīng)用中，其更新速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了目前政府所監(jiān)管的范疇和能力，政府還沒有一個針對性地健全監(jiān)管制度，一定程度上阻礙了物流業(yè)共享經(jīng)濟(jì)的發(fā)展?；谶@種背景，為了更好地利用共享經(jīng)濟(jì)促進(jìn)我國綠色物流的建設(shè)、實現(xiàn)對社會物流費用的有效降低，政府要充分發(fā)揮出其監(jiān)管作用，建立起針對物流共享平臺搭建以及合理運行的相關(guān)監(jiān)管制度，形成一個允許試錯、寬容、多元化、開放的經(jīng)濟(jì)環(huán)境，打破一味禁止和限制的監(jiān)管弊端，完善經(jīng)濟(jì)環(huán)境，為物流共享經(jīng)濟(jì)的發(fā)展提供必要保障。

DNMT1F：CCTGGCTAAAGTCAAGTCCCT

DNMT1R：GTGTGTGTTCCGTTCTCCAAG

DNMT3A F：GGCCGAATTGTGTCTTGGTG

DNMT3A R：CCATCTCCGAACCACATGAC

PP1gamma F：GAGAACGAGATCCGAGGACTC

PP1 gamma R：CGTATTCAAACAGACGGAGCAA

β-actin F：GGCTGTATTCCCCTCCATCG

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

各組實驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 19.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件中的t-test和two way ANOVA方法進(jìn)行處理和分析，P≤0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實時熒光定量PCR檢測DNMT1在mRNA水平的表達(dá)變化

在對照組中(側(cè)腦室注射BSA)，比較低氧對DNMT1轉(zhuǎn)錄水平的影響。與未低氧組(0.0組)相比較，結(jié)果顯示低氧(低氧一次組)后1天(1.1組)、2天(2.1組)和3天(3.1組) DNMT1的mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1A)；而4天(4.1組) DNMT1表達(dá)雖有降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) (圖1A)。低氧預(yù)適應(yīng)組(重復(fù)4次低氧)與低氧組相比，DNMT1表達(dá)雖有升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) (圖1A)。

在實驗組中(側(cè)腦室注射了5-aza-cdR)，在使用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑后，與未低氧組(0.0組)相比，低氧(低氧一次組)后1天(1.1組)、3天(3.1組)和4天(4.1組) DNMT1的mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1B)；而2天(2.1組) DNMT1表達(dá)雖有降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) (圖1 B)。低氧預(yù)適應(yīng)組(重復(fù)4次低氧)與低氧組相比，DNMT1表達(dá)雖有升高，但僅在1天(1.4組)有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) (圖1 B)。

比較在未低氧、低氧(低氧一次組)和低氧預(yù)適應(yīng)(重復(fù)4次低氧)條件下，5-aza-cdR對DNMT1表達(dá)的影響，結(jié)果顯示5-aza-cdR 雖可降低DNMT1表達(dá)，但是沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) (圖1C)。在小鼠低氧后1天、2天、3天和4天時，5-aza-cdR對DNMT1的表達(dá)沒有顯著的影響(P>0.05) (圖1 D)。

以上結(jié)果揭示，低氧處理1、2、3、4天DNMT1 mRNA的表達(dá)受到抑制，且不受甲基轉(zhuǎn)移酶活性的影響；5-aza-cdR對DNMT1在mRNA水平的表達(dá)沒有明顯的影響。

圖1 實時熒光定量PCR檢測不同處理組中DNMT1在mRNA水平的表達(dá)變化

注：A: 小鼠側(cè)腦室注射BSA后，低氧和低氧預(yù)適應(yīng)對DNMT1轉(zhuǎn)錄水平的影響(n=4;*P≤0.05,低氧一次組與未低氧組之間的比較)。B: 小鼠側(cè)腦室注射5-aza-cdR后，低氧和低氧預(yù)適應(yīng)對DNMT1轉(zhuǎn)錄水平的影響(n=4;*P≤0.05,**P≤0.01低氧一次組與未低氧組相比;※P≤0.05, 相同天數(shù)下低氧四次組與低氧一次組相比)。C: 比較在未低氧、低氧和低氧預(yù)適應(yīng)條件下， 5-aza-cdR對DNMT1轉(zhuǎn)錄水平的影響。D: 低氧后1天、2天、3天、4天，5-aza-cdR對DNMT1轉(zhuǎn)錄水平的影響。

2.2 實時熒光定量PCR檢測DNMT3A在mRNA水平的表達(dá)變化

在對照組中(側(cè)腦室注射BSA)，比較低氧對DNMT3A轉(zhuǎn)錄水平的影響。與未低氧組(0.0組)相比較，結(jié)果顯示低氧(低氧一次組)后2天(2.1組)、3天(3.1組)和4天(4.1組) DNMT3A的mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2 A)；而1天(1.1組) DNMT3A表達(dá)雖有降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) (圖2 A)。低氧預(yù)適應(yīng)組(重復(fù)4次低氧)與低氧組相比，DNMT3A表達(dá)進(jìn)一步降低，且低氧預(yù)適應(yīng)后1天(1.1組)、4天(4.1組)表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) (圖2 A)。

在實驗組中(側(cè)腦室注射了5-aza-cdR)，與未低氧組(0.0組)相比，低氧(低氧一次組)后2天(2.1組)和4天(4.1組) DNMT3A的mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2 B)；1天和3天變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) (圖2 B)。低氧預(yù)適應(yīng)組(重復(fù)4次低氧)與低氧組相比，DNMT3A的表達(dá)變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) (圖2 B)。

在未低氧、低氧(低氧一次組)和低氧預(yù)適應(yīng)(重復(fù)4次低氧)條件下， 5-aza-cdR 雖可降低DNMT3A表達(dá)，但只在未低氧條件下才有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) (圖2 C)。在小鼠低氧后1天、2天、3天和4天時，5-aza-cdR對DNMT3A的表達(dá)沒有顯著的影響(P>0.05) (圖2 D)。

以上結(jié)果揭示，低氧處理2天后DNMT3A的mRNA表達(dá)水平降低，且不受甲基轉(zhuǎn)移酶活性的影響；5-aza-cdR對DNMT3A有明顯的抑制作用，但是這種抑制作用受到氧含量的調(diào)控。

圖2 實時熒光定量PCR檢測不同處理組中

注：A: 小鼠側(cè)腦室注射BSA后，低氧和低氧預(yù)適應(yīng)對DNMT3A轉(zhuǎn)錄水平的影響(n=4;**P≤0.01,*P≤0.05, 低氧一次組與未低氧組相比;※P≤0.05, 相同天數(shù)下低氧預(yù)適應(yīng)組與低氧組相比)。B: 小鼠側(cè)腦室注射5-aza-cdR后，低氧和低氧預(yù)適應(yīng)對DNMT3A轉(zhuǎn)錄水平的影響(n=4;**P≤0.01, 低氧一次組與未低氧組相比)。C: 比較在未低氧、低氧和低氧預(yù)適應(yīng)條件下， 5-aza-cdR對DNMT3A轉(zhuǎn)錄水平的影響(n=4;*P≤0.05相同低氧條件下，5-aza-cdR組與BSA組相比)。D: 低氧后1天、2天、3天、4天，5-aza-cdR對DNMT3A轉(zhuǎn)錄水平的影響。

2.3 實時熒光定量PCR檢測PP1γ在mRNA水平的表達(dá)變化

在對照組中(側(cè)腦室注射BSA)，比較低氧對PP1γ轉(zhuǎn)錄水平的影響。與未低氧組(0.0組)相比較，結(jié)果顯示低氧后2天(2.1組)、3天(3.1組)和4天(4.1組) PP1γ的mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3 A)；此外，隨著低氧后時間的延長，PP1γ的mRNA表達(dá)呈下降趨勢，但是在低氧后第4天出現(xiàn)回升。低氧預(yù)適應(yīng)組與低氧組相比，PP1γ表達(dá)無顯著性變化(P>0.05) (圖3 A)。

在實驗組中(側(cè)腦室注射了5-aza-cdR)，與未低氧組(0.0組)相比，低氧后3天(3.1組)和4天(4.1組) PP1γ的mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3 B)。低氧預(yù)適應(yīng)組與低氧組相比，PP1γ表達(dá)沒有顯著的變化趨勢，但是第4天(4.4組)，PP1γ表達(dá)卻顯著增加(P<0.05) (圖3 B)。

比較在未低氧、低氧(低氧一次組)和低氧預(yù)適應(yīng)(重復(fù)4次低氧)條件下， 5-aza-cdR對PP1γ表達(dá)的影響，結(jié)果顯示在低氧和低氧預(yù)適應(yīng)條件下，5-aza-cdR 雖可上調(diào)PP1γ表達(dá)，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) (圖3 C)。在小鼠低氧后1天、2天、3天和4天時，5-aza-cdR可上調(diào)實驗組PP1γ的轉(zhuǎn)錄水平，且在第1天和第2天具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05) (圖3 D)。

以上結(jié)果揭示，低氧抑制PP1γ的mRNA表達(dá)水平，且PP1γ表達(dá)有低氧后時間依賴性；甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑對PP1γ有明顯的促進(jìn)作用，低氧不影響這種作用的發(fā)揮。

圖3 實時熒光定量PCR檢測不同處理組中PP1γ在mRNA水平的表達(dá)變化

注：A: 小鼠側(cè)腦室注射BSA后，低氧和低氧預(yù)適應(yīng)對PP1γ轉(zhuǎn)錄水平的影響(n=4;*P≤0.05, 低氧一次組與未低氧組相比)。B: 小鼠側(cè)腦室注射5-aza-cdR后，低氧和低氧預(yù)適應(yīng)對PP1γ轉(zhuǎn)錄水平的影響(n=4;*P≤0.05, 低氧一次組與未低氧組相比;※P≤0.05, 相同天數(shù)下低氧四次組與低氧一次組相比)。C: 比較在未低氧、低氧和低氧預(yù)適應(yīng)條件下， 5-aza-cdR對PP1γ轉(zhuǎn)錄水平的影響。D: 低氧后1天、2天、3天、4天，5-aza-cdR對DNMT3A轉(zhuǎn)錄水平的影響。

3 討 論

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)變化之一，其主要發(fā)生在CpG二核苷酸中胞嘧啶第五位碳原子上，并由DNMTs負(fù)責(zé)對DNA進(jìn)行甲基化修飾，最終通過調(diào)控基因表達(dá)變化參與神經(jīng)發(fā)育和分化、突觸可塑性等過程[7]。目前存在三種有催化活性的甲基轉(zhuǎn)移酶：DNMT1是維持型甲基化酶；DNMT3A和DNMT3B為從頭合成型甲基化酶。有研究顯示DNMTs表達(dá)改變可以延遲缺血/低氧對大腦的損傷[8]；另一方面，缺血/低氧可降低整體甲基化水平[4]。因此，我們推測在缺血/低氧調(diào)節(jié)神經(jīng)組織某些基因表達(dá)過程中，DNA甲基化可能存在重要作用。但DNA甲基化，尤其是DNMTs表達(dá)是否會隨著低氧后時間的增加發(fā)生變化，并參與低氧腦保護(hù)過程，則需要本實驗研究加以印證。

有研究初步探索了DNMTs在缺血/低氧條件下的表達(dá)變化規(guī)律，例如蒙古沙鼠經(jīng)短暫全腦缺血處理后，在24 h內(nèi)神經(jīng)元DNMT1表達(dá)沒有變化，而加長缺血時間到2、4、5和7天后DNMT1表達(dá)降低，因此推測DNMT的表達(dá)變化在低氧條件下有時間依賴性[9]。為了證實這個推論，本研究分別給予小鼠低氧后0、1、2、3和4天依次處死，觀察DNMT的變化。結(jié)果顯示：急性低氧對DNMT1的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有影響，但低氧處理1天后DNMT1的mRNA表達(dá)水平受到抑制；低氧后2天DNMT3A的mRNA表達(dá)水平開始下降，這些結(jié)果與之前報道一致。同時，為了深入研究DNMTs表達(dá)在低氧條件下的變化，我們對小鼠側(cè)腦室注射5-aza-cdR，其為DNA復(fù)制過程中的核苷酸類似物，可與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶共價結(jié)合形成復(fù)合物從而抑制甲基轉(zhuǎn)移酶活性[10]。結(jié)果顯示低氧對DNMT1和DNMT3A的抑制作用不受甲基轉(zhuǎn)移酶活性的影響。此外，5-aza-cdR對DNMT1的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯的影響；但對DNMT3A有明顯的抑制作用，但是受到氧含量的調(diào)控。綜上，我們驗證了上述的推論，證實低氧抑制了DNMTs的表達(dá)，并且這種抑制作用的發(fā)揮有時間依賴性。

以上結(jié)果已證實低氧可使DNA甲基化發(fā)生改變，之后是否能調(diào)控某些基因表達(dá)來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，則需要進(jìn)一步檢測。PP1是腦內(nèi)一類重要的去磷酸化酶，其下游的激活蛋白CREB(cAMP反應(yīng)原件結(jié)合蛋白)可以上調(diào)神經(jīng)生長因子和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但PP1可使磷酸化的CREB發(fā)生去磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致其失活。因此，研究顯示PP1常通過下調(diào)自身表達(dá)，發(fā)揮保護(hù)作用。例如，成年大鼠受到情境性恐懼刺激后，海馬中DNMTs表達(dá)上調(diào)，并引起PP1啟動子區(qū)的甲基化增加，其轉(zhuǎn)錄減少[11]。在低氧預(yù)適應(yīng)小鼠模型中，也發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)磷酸化的CREB水平升高。我們前期研究同樣發(fā)現(xiàn)，急性小鼠低氧模型中PP1表達(dá)下降[12]。而本研究進(jìn)一步探討低氧后1、2、3和4天小鼠腦區(qū)PP1表達(dá)發(fā)生的變化情況，實驗結(jié)果揭示：低氧抑制PP1γ的表達(dá)水平，且PP1γ表達(dá)有低氧后時間依賴性。所以低氧條件下，PP1γ表達(dá)水平的降低，對小鼠海馬起到一定的神經(jīng)保護(hù)作用。同時，使用5-aza-cdR后，PP1γ表達(dá)明顯增加。因此，我們推測DNMTs介導(dǎo)了PP1γ啟動子區(qū)高甲基化，從而調(diào)控PP1γ基因的轉(zhuǎn)錄，PP1γ在低氧條件下的表達(dá)下降與DNMTs介導(dǎo)的PP1γ基因啟動子區(qū)高甲基化導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄沉默有關(guān)。DNA甲基化很可能是低氧預(yù)適應(yīng)參與腦保護(hù)的機(jī)制之一。

綜上，在小鼠低氧模型中，與能量代謝密切相關(guān)的PP1γ表達(dá)下調(diào)，且隨著低氧后天數(shù)增加逐漸降低，可通過降低代謝來實現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用。而DNA甲基化也參與了對PP1γ的表達(dá)調(diào)控：抑制DNA甲基化，低氧條件下PP1γ表達(dá)增加。因此，低氧通過改變DNA甲基化，尤其是DNMTs表達(dá)變化，調(diào)控PP1γ基因表達(dá)，實現(xiàn)其腦保護(hù)作用。這進(jìn)一步豐富了I/HPC腦保護(hù)作用的分子機(jī)制。

[1] Shao G, Lu GW. Hypoxic preconditioning in an autohypoxic animal model[J]. Neurosci Bull, 2012, 28(3):316-320.

[2] Lu GW, Shao G. Hypoxic preconditioning: Effect, mechanism and clinical implication (part. 1)[J]. Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi, 2014, 30(6):489-501.

[3] Shao G, Zhang R, Wang ZL, et al. Hypoxic preconditioning improves spatial cognitive ability in mice[J]. Neurosignals, 2006, 15(6):314-321.

[4] Shahrzad S, Bertrand K, Minhas K, et al. Induction of DNA hypomethylation by tumor hypoxia[J]. Epigenetics, 2007, 2(2):119-125.

[5] Stockwell J, Chen Z, Niazi M, et al. Protein phosphatase role in adenosine a1 receptor-induced ampa receptor trafficking and rat hippocampal neuronal damage in hypoxia/reperfusion injury[J]. Neuropharmacology, 2016, 102:254-265.

[6] Zhang S, Zhang Y, Jiang S, et al. The effect of hypoxia preconditioning on DNA methyltransferase and pp1gamma in hippocampus of hypoxia preconditioned mice[J]. High Alt Med Biol, 2014, 15(4):483-490.

[7] Graff J, Kim D, Dobbin MM, et al. Epigenetic regulation of gene expression in physiological and pathological brain processes[J]. Physiol Rev, 2011, 91(2):603-649.

[8] Endres M, Meisel A, Biniszkiewicz D, et al. DNA methyltransferase contributes to delayed ischemic brain injury[J]. J Neurosci, 2000, 20(9):3175-3181.

[9] Lee JC, Park JH, Yan BC, et al. Effects of transient cerebral ischemia on the expression of DNA methyltransferase 1 in the gerbil hippocampal ca1 region[J]. Neurochem Res, 2013, 38(1):74-81.

[10] 孫明英, 張柱霞, 楊潔, 等. 5-aza-cdr對低氧預(yù)適應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞NG108的DNMTs表達(dá)的影響[J]. 泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2015, 36(12):1321-1323.

[11] Miller CA, Sweatt JD. Covalent modification of DNA regulates memory formation[J]. Neuron, 2007, 53(6):857-869.

[12] 張柱霞, 孫明英, 楊潔, 等. 5-Aza-CdR和低氧對小鼠海馬中蛋白磷酸酶-1γ表達(dá)及對學(xué)習(xí)記憶的影響[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2015, 36(9):59-63.

The changes of DNMT1，DNMT3A and Protein Phosphatase 1γmRNA in later phase of hypoxic preconditioning mice

XIE Wei1ZHANF Zhu-xia1JIA Xiao-e1,2#JIANG Shu-yuan1SHI Rui1LIU Xiao-lei1XU Wen-qiang1ZHANG Yanbo3＊SHAO Guo1，4＊

(1. Biomedical Research Center, Baotou Medical College, Baotou, Inner Mongolia Autonomous Region,Baoton 014060, China;2. School of Basic Medical and Forensic Medicine, Dept. of Cell Biology and Genetics, Baotou Medical College, Baotou, Inner Mongolia Autonomous Region,Baotou 014060, China; 3. Dept. of Neurology，Affiliated Hospital of Taishan Medical College, Taian 271000, China;4. Beijing key laboratory of Hypoxic Conditioning Translational Medicine, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, Beijing 100053,China)

Objective: In hypoxic preconditioned mouse model, to study the changes of DNA methylation and protein phosphatase 1 expressions with the time after hypoxia. To reveal the hypoxia may regulate the PP1γ expression via the DNA methylation to play role in brain neuroprotection. Methods: The experimental group mice were injected with 5-aza-cdR (10 μmol/L, 5 μl), then they were treated by hypoxia and last they were euthanasia after zero/one/two/three/four day's hypoxia. Real-time PCR was used to examine the mRNA levels of DNMTs and PP1γ in the mice hippocampus. Results: The results showed that the mRNA level of DNMT1 was decreased after one day since hypoxia and DNMT3A decreased after two day since hypoxia (P<0.05), those changes might not be affected by the activity of DNA methyltransferases. The mRNA level of DNMT3B was restrained by 5-aza-cdR (P<0.05), but not DNMT1 (P>0.05). The mRNA levels of PP1γ were down-regulated by hypoxia (P<0.05). The mRNA levels of PP1γ were increased with 5-aza-cdR (P<0.05), and the increases had the relationship with the time after hypoxia. Conclusion: As the extension of time after hypoxia, the hypoxia may regulate the expression of PP1γ via the change in DNA methylation, especially DNMTs expression, to take part in the brain neuroprotection.

protein phosphatase 1; DNA methylation; DNA methyltransferase; hypoxic; mice

國家自然科學(xué)基金項目(81060212,81160244,81360316,81460283，81550038，81660307，81660204)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(2014MS0810，2015BS0801，2015BS0807，2016MS (LH)0307)；包頭醫(yī)學(xué)院博士科研啟動基金(BSJJ201632，BSJJ201623，BSJJ201617)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究項目(NJZY16207)；泰山醫(yī)學(xué)院高層次培育課題(2016GCC02)。

謝偉(1985—)，男，內(nèi)蒙古包頭市人，博士，包頭醫(yī)學(xué)院中心實驗室講師，主要研究方向神經(jīng)低氧保護(hù)。

張柱霞(1990—)，女，山東萊蕪人，博士，主要研究方向神經(jīng)生物學(xué)。

R392

A

1004-7115(2017)02-121-05

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.02.001

2016-11-12)